基于RNA⁃seq技术对大骨鸡垂体及下丘脑组织的SNP/InDel分析

SNP/InDel analysis of pituitary and hypothalamus of Dagu chicken based on RNA⁃seq technology

摘要

下丘脑和垂体调节母鸡的生殖生理和产蛋性能。为了解其产卵调控机制，利用RNA⁃seq技术对高产和低产庄河大骨鸡的下丘脑和垂体组织进行测序和分析，获得SNP/InDel位点，并进行数据统计及生物信息学分析，以鸡基因组作为参考，对SNP所在基因进行GO富集分析。结果显示：SNP/InDel纯合子变异体数量高于杂合子变异体数量，垂体组织中的SNP/InDel数量高于下丘脑组织；SNP类型转换种类少于颠换，但转换类型的数量却远远高于颠换；垂体组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈负相关关系（P<0.05），下丘脑组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈正相关关系（P<0.05）。研究结果为大骨鸡的选育以及改善其生产性能的研究提供了理论依据。

Abstract

The reproductive physiology and laying performance of laying hens are regulated by the hypothalamus and pituitary. To understand the mechanism of egg laying regulation， we sequenced and analysed the hypothalamus and pituitary tissues in high⁃ and low⁃yielding laying Chinese Dagu chickens （CDC） using RNA⁃seq， and got the SNP/InDel sites， then conducted data statistics and bioinformatics analysis using the chicken genome as a reference to analyze the genes of SNP. The result showed that the number of SNP/InDel homozygous variants was higher than that of heterozygous variants， and the number of SNP/InDel in pituitary tissues was higher than that in hypothalamus tissues； the SNP conversion type was less than transversion， but the number was inverse； the GO enrichment degree of SNP gene in pituitary tissues was negatively correlated with its production performance（P<0.05）， but the GO enrichment degree of SNP gene in hypothalamus was positively correlated with the production performance（P<0.05）. The results provide a theoretical basis for breeding Dagu chickens， and improve their production performance.

Graphical abstract

关键词

大骨鸡 / 转录组测序技术 / 单核苷酸多态性 / 插入缺失标记 / 基因本体富集

Key words

Dagu chicken / RNA sequencing（RNA⁃seq） / single nucleotide polymorphism （SNP） / insertion⁃deletion（InDel） / gene ontology enrichment

0 引 言

家禽饲养业在中国养殖业中占据着不可或缺的位置，与牛羊等家畜相比，鸡饲养的自动化程度高、饲料转化率也非常高^［1］，因此，鸡渐渐成为世界各地消费者普遍接受的优质动物。庄河大骨鸡属于肉蛋兼用型，是我国著名的地方品种，具有肉质壮而不肥、蛋质好、抗病力强、易粗饲等优点。近年来，随着商业化蛋鸡水平的不断升高，市场对优质鸡蛋需求量不断加大，提高大骨鸡的产蛋量逐渐成为研究热点，也是母鸡育种的主要目的之一。鸡的促性腺激素释放激素（GnRH）由下丘脑分泌，可以进一步刺激垂体分泌释放促卵泡素（FSH）以及促黄体生成素（LH），从而调控鸡的繁殖行为，另外还可以通过外周血液循环，对性腺产生作用，影响其内分泌和外分泌。由此可知，鸡的下丘脑和垂体在鸡的生长、发育、性成熟和生殖过程中有非常重要的作用^［2，3］。因此，鸡的下丘脑和垂体与其产蛋能力息息相关。

SNP（single nucleotide polymorphism），是指在基因组水平上因为单个核苷酸变异而引发的DNA序列多态性。而这种多态性一般只涉及到单个碱基的变异，也就是说，这种变异通常是由单个碱基的转换或颠换引起的。SNP的位点非常丰富，几乎可以遍及到整个基因组。随着科技的不断进步，不管是动物还是植物，都已经可以成功挖掘出许多SNP/InDel位点^［4］。本研究采用RNA⁃seq技术对高产和低产母鸡的垂体和下丘脑组织进行测序，获得SNP/InDel标记的位点，并对这些位点进行生物信息学分析，探索大骨鸡产蛋性能相关基因，为大骨鸡的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用鸡及配备用具均由锦州医科大学畜牧兽医学院提供。本试验选用产蛋高峰期39~42周龄雌性大骨鸡6只。将所选母鸡按产蛋高峰期（39~42周）的产蛋数量分为高产蛋组（25个蛋/每只鸡）和低产蛋组（14个蛋/每只鸡）。为了减少组内误差，组内每只母鸡的日产蛋量相同。处死母鸡，在无菌条件下分离得到其下丘脑和垂体组织，并迅速放在液氮中保存备用。所有方法和程序均经锦州医科大学伦理委员会批准，并按照中华人民共和国农业部制定的有关指导方针执行。

试验分组情况如下：LP⁃1~LP⁃3是高产母鸡1~3的垂体样本；NP⁃1~NP⁃3是低产母鸡1~3的垂体样本；LH⁃1~LH⁃3为高产母鸡1~3的下丘脑样本；NH⁃1~NH⁃3为低产母鸡1~3的下丘脑样本。

1.2 RNA分离、文库构建和测序

① 使用Trizol试剂分别从垂体和下丘脑组织样本中提取总RNA，提取方法按照提取试剂盒的说明书要求进行。② 使用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA纯度。③ 使用liyonQubit 2.0测定RNA的浓度，用Agilent 2100 Bio analyzer来评估RNA的完整性。④ 样品测试全部完成后，依据测序公司建议，使用NEB Next®Ultra TM RNA文库制备试剂盒（NEB，美国）生成测序文库，并且在每个样品的序列中添加了一个索引代码。⑤ 利用安捷伦生物分析仪2100系统评价其质量。⑥ 文库制备在Illumina Hi Seq 2500平台上测序，采用p150对端测序方法^［5，6］。

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据过滤

对高产母鸡和低产母鸡的垂体和下丘脑的RNA样品进行测序，共构建了12个cDNA文库。所得序列总数最少为6.91×10⁷个（NP⁃2），最多的是7.97×10⁷个（LH⁃1）。对所得原始数据通过去低质量序列、去接头污染等过程完成数据过滤得到高质量序列，其中最少的是4.70×10⁷个（NH⁃2），最多为7.80×10⁷个（LH⁃3）。高质量序列含量均高于94.85%，其中Q20（质量值≥20的碱基占总体碱基的百分比）和Q30（质量值≥30的碱基占总体碱基的百分比）分别超过96.18%和90.76%，该结果达到进一步数据分析的要求，可用于后续分析，见表1。

2.2 SNP检测

通过使用samtools和picard⁃tools等工具将比对结果分别进行染色体坐标排序以及去掉重复的reads等处理，然后通过samtools工具分别进行SNP Calling、InDel Calling，最后对原始结果进行过滤，得到SNP/InDel的分析结果。

2.3 SNP和InDel统计数据分析

2.3.1 大骨鸡垂体组织的SNP数量统计分析

对高产母鸡和低产母鸡垂体每个样品的SNP结果分别进行统计，结果如图1所示。由图可知，每个样品中hete位点均高于homo位点；hete位点最高为3.68×10⁵个（NP⁃2），最低为3.21×10⁵个（NP⁃1），平均为3.43×10⁵个； homo位点最高为4.06×10⁵个（NP⁃2），最低为3.65×10⁵个（LP⁃3），平均为3.83×10⁵个。但homo位点与hete位点的数量变化趋势不呈相关关系。

2.3.2 大骨鸡下丘脑组织的SNP数量统计分析

对高产母鸡和低产母鸡的下丘脑每个样品的SNP结果分别进行统计，结果如图2所示。由结果可知，每个样品中hete位点仍高于homo位点；hete位点最高为3.37×10⁵个（NH⁃3），最低为2.60×10⁵个（NH⁃2），平均为3.05×10⁵个； homo位点最高为3.73×10⁵个（NH⁃3），最低为2.86×10⁵个（NH⁃2），平均为3.41×10⁵个。在这六个样品中，hete和homo的变化呈正相关关系（P<0.05）。

2.3.3 SNP类型统计分析

在SNP位点中，基因型变化有A/G、C/T、A/C、A/T、C/G、G/T等6种类型。由表2可以看出，最少的有5.70×10⁴个（A/T），最多的可以达到3.47×10⁵个（C/T），平均为1.50×10⁵个。在这6种基因突变类型中，转换类型（A/G和C/T）共有6.56×10⁵个，而颠换类型（A/C，A/T，C/G和G/T）仅有2.41×10⁵个，两种突变类型的比值为2.72，虽然转换类型的SNP位点比颠换要多的多，但颠换的种类却比转换多。

2.3.4 大骨鸡垂体组织的InDel数量统计分析

对高产母鸡和低产母鸡垂体的每个样品的InDel位点分别进行统计，结果如图3所示。由结果可知，每个样品中hete位点均低于homo位点；hete位点最高为2.48×10⁴个（NP⁃2），最低为2.22×10⁴个（LP⁃3），平均为2.35×10⁴个；homo位点最高为2.84×10⁴个（NP⁃2），最低为2.56×10⁴个（LP⁃3），平均为2.69×10⁴个。在这六个样品中，hete和homo的变化呈正相关关系（P<0.05）。

2.3.5 大骨鸡下丘脑组织的InDel数量统计分析

对高产母鸡和低产母鸡的下丘脑的每个样品的InDel位点分别进行统计，结果如图4所示。由结果可知，每个样品中hete位点均低于homo位点；hete位点最高为2.29×10⁴个（NH⁃3），最低为1.80×10⁴个（NH⁃2），平均为2.10×10⁴个；homo位点最高为2.58×10⁴个（LH⁃3），最低为1.99×10⁴个（NH⁃2），平均为2.38×10⁴个。在这六个样品中，hete和homo的变化呈正相关（P<0.05）。

2.3.6 SNP所在基因的注释

利用Omicshare（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Index/index. html）分别统计高产蛋组和低产蛋组的下丘脑和垂体组织的SNP所在基因的富集情况，结果如图5所示。可以看出，4组样本在生物进程、细胞组分、分子功能三个部分所占比例基本一致。

① 在生物进程中，4组样本均主要富集在细胞进程部分；且除去免疫系统进程和细胞增殖，其他部分中下丘脑组织的SNP位点所在基因的富集均高于垂体组织。通过垂体组织的基因富集比较可以发现，在细胞增殖、运动和行为部分，高产蛋组的富集情况要比低产蛋组高，其他部分高产蛋组的基因富集均低于低产蛋组；而在下丘脑组织中，高产蛋组的SNP位点所在基因富集全部高于低产蛋组。

② 在细胞组分中，4组样本主要集中在细胞和细胞零件部分，且下丘脑组织的SNP位点所在基因的富集全部高于垂体组织。在垂体组织的基因富集比较中，高产蛋组的SNP位点所在基因富集均低于低产蛋组，而在下丘脑组织中刚好相反。

③ 在分子功能中，4组样本主要集中在结合部分，且下丘脑组织的SNP位点所在基因的富集均高于垂体组织。在垂体组织的基因富集比较中，除了转录调节活性，其他部分的高产蛋组均低于低产蛋组；而下丘脑组织中，高产蛋组均高于低产蛋组。

3 讨 论

利用RNA⁃seq高通量检测技术，可以反映出动植物体内全部基因的表达情况，而且可以测定动植物任意时间点任意组织中的基因表达^［7］。目前，这项技术已经被广泛应用到动物和植物的遗传与育种研究中。研究发现，基因PLA2G4A和MAPK12可能与武定鸡的停产有密切关系，而这两个基因位于与繁殖相关的GnRH信号通路中^［8］，且GnRH是通过下丘脑分泌的，它能够刺激或抑制机体垂体中促性腺激素的分泌。本研究通过采集高产和低产两种生产模式下的大骨鸡的下丘脑和垂体组织，利用高通量转录组测序技术，每个样本均获得超过7Gb的高质量序列，包含大量的SNP和InDel标记信息。

SNP指的是在基因组水平上因为单个核苷酸的变异而引起的DNA序列的多态性，它实际上属于一种核苷酸形式的多态性的标记。通过本试验采集了共12个样本得到的SNP数据可以看出，在杂合子变异体SNP数量中，垂体组织平均为3.43×10⁵个，下丘脑组织平均3.05×10⁵个；而纯合子变异体数量垂体组织平均是3.83×10⁵个，下丘脑组织是3.41×10⁵个。从这个结果可以看出，纯合子变异体的SNP数量显著高于杂合子变异体的SNP数目，且垂体组织中的SNP数量显著高于下丘脑组织。另外，本试验发现了SNP的变异类型共6种，其中转换类型只有2种，颠换类型有4种，但转换类型的数量却远远高于颠换，这与其本身的基因组中不同碱基突变频率有差异密切相关^［9］，与大量研究中转换突变的频率高于颠换的数据相符合^［10~12］；而且在本次试验中发现SNP突变类型大部分都是C转换为T。分析出现这种情况的原因，有研究表明是因为CG中的C通常是甲基化的，它可以自发地脱氨转而成为胸腺嘧啶^［13］。

InDel在本质上是属于长度多态性标记，它的出现是由于基因组中的脱氧核苷酸的插入或缺失引起的DNA序列长度的多态性^［13］。通过本试验获得的InDel数据可以看到：杂合变异体中，垂体组织的InDel数量平均为2.35×10⁴个，下丘脑组织的数量平均为2.10×10⁴个；纯合子变异体中，垂体组织的数量平均是2.69×10⁴个，下丘脑组织InDel数量平均2.38×10⁴个。由此结果可以看出，纯合子的变异体InDel数量显著高于杂合子变异体，且垂体组织的变异体数量明显高于下丘脑组织，这与SNP的统计结果基本一致。此外，InDel的发生率远远低于SNP，这与其他研究人员得出的结论是一致的。

GO富集可以知道所研究基因的主要生物功能，能够为后续的相关研究奠定理论基础^［8］，包括生物进程、细胞组分和分子功能三个部分。本试验通过对4组样本的SNP所在基因进行富集分析发现，在生产性能相同的条件下，下丘脑组织的SNP所在基因的富集情况均高于垂体组织。此外，这4组样本在细胞进程、细胞和结合部分富集最高，这说明下丘脑组织对大骨鸡生产性能的影响比垂体高，而且所得到的SNP位点对细胞进程、细胞和结合部分影响最高。在垂体组织的SNP位点所在基因的GO富集分析中可以发现，在细胞增殖、运动、行为和转录调节活性部分，高产蛋组的富集情况要比低产蛋组高，其他部分高产蛋组的基因富集均低于低产蛋组，而在下丘脑组织中，高产蛋组的基因富集情况都比低产蛋组要高。这说明，垂体中所筛选出的SNP可能对于大骨鸡的生产性能有负面影响，而下丘脑中的变异位点对其生产性能有积极的影响，这对高生产性能大骨鸡的选育有着鲜明的指导意义。

4 结 论

通过对高产和低产大骨鸡的垂体和下丘脑组织的SNP/InDel位点的统计分析，得出以下结论：

在突变位点数量上，SNP/InDel纯合子变异体数量高于杂合子变异体数量，且垂体组织中的SNP/InDel数量高于下丘脑组织；在SNP类型中，虽然转换类型的种类少于颠换类型，但转换类型的数量却远远高于颠换；垂体组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈负相关关系（P<0.05）；下丘脑组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈正相关关系（P<0.05）。本研究发现了大量可能与产蛋性能相关的SNP/InDel分析标记，为选育高生产性能的大骨鸡提供了理论基础。

参考文献

[1] 单艳菊, 姬改革, 邹剑敏, 等. 鸡CSRP3基因编码区SNPs及其与肌纤维性状的相关分析[J]. 中国家禽, 2020, 42(1): 7⁃11.

[2] Shan Y J, Ji G G, Zou J M, et al. Polymorphisms of coding region in CSRP3 gene and its association with muscle fiber traits in chickens [J]. China Poult, 2020, 42(1): 7⁃11.

[3] 张学余, 李国辉, 韩威, 等. PRL和POU1F1基因及基因聚合对白耳鸡产蛋数的效应分析[J]. 安徽农业大学学报, 2010, 37(2): 249⁃252.

[4] Zhang X Y, Li G H, Han W, et al. Effects of single and pyramiding genotypes of PRL and POU1F1 genes on Baier chicken egg production [J]. J Anhui Agric Univ, 2010, 37(2): 249⁃252.

[5] 姜建萍, 徐日福, 范贤聪,等. 大骨鸡FSHβ与PIT1基因多态性及其聚合基因型对产蛋性能的影响[C]// 中国畜牧兽医学会家禽学分会代表会议暨全国家禽学术讨论会. 扬州, 2013.

[6] Jiang J P, Xu R F, Fan X C, et al. Effects of FSHβ and PIT1 gene polymorphisms and their polymeric genotypes on egg production performance in large bone chicken. [C]// Representative Conference of Poultry Science Branch of Chinese Society of Animal Husbandry and Veterinary Medicine and National Poultry Academic Symposium. Yangzhou, 2013.

[7] 王晖, 谢岩, 高玉军, 等. 桑葚转录组SNP/Indel位点的挖掘及功能注释[J]. 石河子大学学报(自然科学版), 2020, 38(3): 325⁃330.

[8] Wang H, Xie Y, Gao Y J, et al. Detection SNP/Indel and function annotation of mulberry fruit transcriptome[J]. J Shihezi Univ Nat Sci, 2020, 38(3): 325⁃330.

[9] Yu G C, Wang L G, Han Y Y, et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters [J]. OMICS: A J Integr Biol, 2012, 16(5): 284⁃287.

[10] Wang C, Ma W. Hypothalamic and pituitary transcriptome profiling using RNA⁃sequencing in high⁃yielding and low⁃yielding laying hens [J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 10285.

[11] 王飞, 刘林波, 高天歌, 等. 转录组学在牧草上的应用进展[J]. 草业科学, 2019, 36(2): 402⁃413.

[12] Wang F, Liu L B, Gao T G, et al. Research advances on transcriptomics in forage plants [J]. Pratacultural Sci, 2019, 36(2): 402⁃413.

[13] 吴梦, 杨明, 马琳, 等. 产蛋和停产武定鸡卵巢转录组SNP分析[J]. 中国家禽, 2020, 42(3): 8⁃12.

[14] Wu M, Yang M, Ma L, et al. SNP analysis of ovarian transcriptome in laying and laying⁃discontinued Wuding chickens [J]. China Poult, 2020, 42(3): 8⁃12.

[15] Hansey C N, Vaillancourt B, Sekhon R S, et al. Maize (Zea mays L.) genome diversity as revealed by RNA⁃sequencing [J].PLoS One, 2012, 7(3): e33071.

[16] 顾丽红, 李金明, 张细权, 等. 120日龄文昌鸡RNA⁃Seq基因结构及SNP分析[J]. 中国家禽, 2019, 41(12): 5⁃11.

[17] Gu L H, Li J M, Zhang X Q, et al. Gene structure and SNP analysis from RNA⁃seq for Wenchang chicken at 120 days of age [J]. China Poult, 2019, 41(12): 5⁃11.

[18] 宋娜娜. 三江黄牛遗传多样性研究[D]. 成都: 西南民族大学, 2017.

[19] Song N N. Study on genetic diversity of cattle in Sanjiang [D]. Chengdu: Southwest University for Nationalities, 2017.

[20] 孙瑞萍, 魏立民, 王峰, 等. 基于RNA–seq五指山猪背最长肌基因表达差异分析[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2018, 44(2): 193⁃197.

[21] Sun R P, Wei L M, Wang F, et al. Gene differential expression analysis in longissimus dorsi of pig–back using RNA–seq [J]. J Hunan Agric Univ Nat Sci, 2018, 44(2): 193⁃197.

[22] 刘小红.基于RNA⁃seq技术的玉米SNP和InDel标记分析 [J/OL].分子植物育种:1⁃10 [2020⁃01⁃10 17:22].

[23] Liu X H. Analysis of SNP and InDel markers in maize based on RNA⁃seq technique [J/OL]. Molecular plant breeding: 1⁃10 [2020⁃01⁃10 17:22].

基金资助

国家自然科学基金(31601914)

国家自然科学基金(31301971)

辽宁省自然科学基金(2019-ZD-0798)

国家大学生创新创业训练计划项目(201910160012)

国家大学生创新创业训练计划项目(201910160004)