microRNA155在动脉粥样硬化发生过程中的网络调控机制

The network regulation mechanism of microRNA155 in the development of atherosclerosis

摘要

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性进行性的血管炎症性疾病，其发病机制主要包括内皮细胞损伤，脂质浸润及炎症介质分泌等。microRNA155（miR⁃155）是参与AS炎性调控、免疫和自噬信号等通路的微小非编码RNA。系统性研究miR⁃155及其靶基因的网络调控机制，能全面理解miR⁃155在AS中的作用，促进其在临床诊断中的应用开发。利用miRNA靶基因预测数据库miRDB、miRmap和Starbase获取miR⁃155的靶基因集。R语言分析基因表达综合数据库（gene expression omnibus， GEO）共享平台动脉粥样硬化斑块差异表达基因（GSE24702），筛选出18 076个差异表达基因。利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）分析，观察这些差异表达基因共同富集在IL6⁃JAK⁃STAT3信号通路、炎症反应和TNFα等炎症信号通路。与miR⁃155靶基因交叉匹配得到371个交集mRNA，其中159个在动脉粥样硬化斑块中上调，212个在动脉粥样硬化斑块中下调。基因本体（gene ontology， GO）及基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）分析研究基因功能，GO富集分析371个差异基因主要富集炎症和凋亡信号通路的负调控等功能，KEGG分析371个差异基因主要富集TGFβ等炎症信号通路。蛋白相互作用网络（protein⁃protein interaction networks， PPI）分析获得关键节点基因是ARRB2、FBXO11、SOCS1、FBXO22、FBXO30、KRAS、RNF19A、TRIM32、HERC4、PJA1、RCHY1和DET1。本研究表明，miR⁃155主要通过调控炎症反应等相关信号通路影响斑块细胞炎症、自噬及凋亡等功能，进而影响动脉粥样硬化的各个进程。

Abstract

Atherosclerosis（AS） is a chronic and progressive vascular inflammatory disease. Its pathogenesis mainly includes endothelial cell injury， lipid infiltration and secretion of inflammatory mediators. microRNA155（miR⁃155） is a small non⁃coding RNA involved in inflammatory regulation， immune and autophagy signaling of AS. Systematic study on the network regulation mechanism of miR⁃155 and its target genes can fully understand the role of miR⁃155 in AS and promote its application in clinical diagnosis. The target gene set of miR⁃155 was obtained by using miRNA target gene prediction databases miRDB， miRmap and Starbase. R language was utilized to analyze the differentially expressed genes in atherosclerotic plaques in GEO （GSE24702），18 076 differentially expressed genes were screened. GSEA analysis were used to observe that these differentially expressed genes were co⁃enriched in IL6⁃JAK⁃STAT3 signaling pathway， inflammatory response and TNFα and other inflammatory signaling pathways. 371 overlapping mRNA were achieved by cross⁃matching with miR⁃155 target genes， of which 159 were up⁃regulated in atherosclerotic plaques and 212 were down⁃regulated in atherosclerotic plaques. The function of genes was studied by GO and KEGG analysis， GO enrichment analysis of 371 differential genes mainly enrich the negative regulation of apoptosis signal pathway and inflammatory response， etc. KEGG analysis of 371 differential genes mainly enrich TGFβ and other inflammatory signal pathways. PPI analysis showed that the key genes were ARRB2， FBXO11， SOCS1， FBXO22， FBXO30， KRAS， RNF19A， TRIM32， HERC4， PJA1， RCHY1 and DET1. This study indicated that miR⁃155 may affect the functions of plaque cell inflammation， autophagy and apoptosis through the regulation of inflammatory response and other related signal pathways， and then affecting the processes of atherosclerosis.

Graphical abstract

关键词

动脉粥样硬化 / 生物信息学分析 / miR⁃155 / 网络调控 / 炎症

Key words

atherosclerosis / bioinformatics analysis / miR⁃155 / network regulation / inflammation

0 引 言

动脉粥样硬化性心脑血管疾病严重威胁人类健康，是目前人类发病率和死亡率的首要原因之一^［1］。动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是由多因素引起的免疫炎性疾病，其发生发展过程非常复杂，目前有脂质渗入学说、内皮损伤学说、平滑肌突变学说、炎症学说及单核⁃巨噬细胞作用学说等多种学说^［2］。AS的发生发展与炎症、氧化应激和血脂紊乱等均密切相关^［3］。内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞间复杂的相互作用，主要包括黏附分子的表达，免疫分子的分泌，白细胞的分化与活化以及血管平滑肌细胞的迁移等，引发动脉粥样硬化斑块中细胞炎症，泡沫细胞的形成，细胞自噬以及细胞凋亡等多种病变反应^［4，5］。AS的分子调控机制的网络十分复杂，其分子机制尚未完全阐明，影响有效诊断治疗靶点的开发利用，需要系统的网络分析，以明确分子的网络调控机制。

microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码微小RNA，约19~25个核苷酸，成熟miRNA与RNA诱导的沉默复合物（RNA⁃induced silencing complex， RISC）结合，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体阻遏靶mRNA的翻译或者降解靶mRNA^［6］。最近研究证明，miRNAs是体内和体外参与动脉粥样硬化发病机制的许多信号级联的必需调节因子^［7］。已经在动脉粥样硬化的患者和动物模型中证实了失调的 miRNA表达谱，发现了几种miRNA在调节疾病进展的关键机制中的作用^{［8， 9］}。此外，miRNA靶向治疗策略开辟了预防和治疗动脉粥样硬化的新诊断和干预的方法^［10］。研究表明，miR⁃155是一个典型的内源性多功能miRNA，其位于第21号染色体。人们最初发现miR⁃155为B细胞基因整合簇（B⁃cell integration cluster，BIC），它通过插入病毒启动子在鸡的基因组中激活而诱导白血病^［11］。miR⁃155在鸡、小鼠和人中高度保守，其参与多种生物学过程，包括造血、炎症、免疫反应和肿瘤发生等^［12］。miR⁃155已经成为动脉粥样硬化的发病机制中炎症信号传导的关键调节因子。然而，miR⁃155在不同的细胞类型、病理进程和动物模型中可能发挥抑制炎症或促进炎症这两种相反的作用^［13］。在内皮细胞中，miR⁃155可通过共同靶向血管紧张素Π受体1（recombinant angiotensin Π receptor 1， AGTR1）和ETS原癌基因1（ETS proto⁃oncogene 1，ETS⁃1）调节炎症通路，下调粘附分子，细胞因子和趋化因子的表达，从而抑制动脉粥样硬化的内皮炎症^{［14，15］}；miR⁃155^-/-骨髓（bone marrow，BM）细胞的LDLR^-/-小鼠似乎更容易受高胆固醇饮食诱导而形成动脉粥样硬化^［16］，而具有miR⁃155^-/-BM细胞的apoE^-/-小鼠由急性扰动血流和高胆固醇血症引发的病变不太明显^［17］。研究表明，miRNA可调节数百个靶基因包括转录因子、细胞因子和受体等。几种miRNAs也可以联合调控单一基因的表达，miRNAs和靶基因组成了复杂的调节网络^［18］。因此，揭示miRNA的作用机制对我们认识体内miRNAs之间、miRNAs与mRNA之间、miRNAs与蛋白质以及与DNA之间的网络交互作用具有重要的意义^［19］。尽管近年来取得了很多进展，但miR⁃155在体内外调节动脉粥样硬化的详细机制并未完全阐明，为了更进一步对miR⁃155在动脉粥样硬化中的作用进行研究，本文结合基因表达综合数据库（gene expression omnibus， GEO）平台，通过生物信息学方法研究miR⁃155的预测靶标与动脉粥样硬化斑块差异表达基因的网络调控机制。进一步系统分析miR⁃155在斑块中的预测靶基因，能更全面掌握miR⁃155在动脉粥样硬化斑块中的网络调控机制。这将为诊断和治疗动脉粥样硬化开发新的生物标志物和治疗靶标提供理论依据。

1 数据来源与方法

1.1 数据来源

GSE24702 mRNA表达芯片矩阵文件和芯片探针注释文件来源于美国国立生物技术信息中心（national centerfor biotechnology information， NCBI）平台下的基因表达综合数据库（gene expression omnibus， GEO）。GSE24702芯片检测动脉粥样硬化斑块mRNA表达谱，包括290个动脉粥样硬化外周斑块。利用Perl软件将芯片的矩阵文件中探针名转化为标准基因名，R语言读取芯片矩阵数据并进行缺失值的补充、数据均一化处理等。

1.2 斑块基因表达谱筛选

利用R语言Limma程序包芯片对290个斑块的基因表达谱进行分析，筛选阈值：FC（fold change）≥1.5，P<0.05。再利用ggplot2程序包绘制差异表达基因火山图。

1.3 miRNA的靶基因预测

利用在线miRNA靶基因预测工具miRDB（http：//mirdb.org/index.html）、miRmap（https：//mirmap.ezlab.org/）和Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）获取hsa⁃miR⁃155预测的靶基因，将3个数据库的预测结合信息集合进行结合关联分析。

1.4 miR⁃155预测靶基因与斑块基因表达谱调控网络构建

Has⁃miR⁃155预测靶基因与斑块差异表达基因做交集。并利用STRING（http：//www.string-db.org）数据库构建miR⁃155调控的基因编码蛋白的相互作用网络（Protein⁃Protein Interaction Networks，PPI），利用Cytocape3.7.2软件分析获取蛋白相互作用网络的信息，以“节点连接度（degree）大于等于4倍中位数”，“紧密度（closeness）和介度（betweenness）均大于等于其中位数”为筛选条件，选取miR⁃155靶基因⁃斑块差异表达基因节点绘制调控网络图。

1.5 GO富集分析及KEGG通路分析

通过R软件ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2程序包对差异表达基因进行基因本体（gene ontology， GO）富集分析以及京都基因与基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析。分析结果P<0.05有统计学意义。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）

将斑块差异表达基因、表型标签加载到 GSEA java 软件中，设置排列数目为1 000个，chip platform 选用对应数据所用的测序或者芯片平台。MSigDB选择C2筛选基因集和GO基因集。选取不同样本，制作不同的标签，运行3~4次GSEA java，取错误发现率（false discovery rate， FDR） q 值<25%和nom P 值<0.01基因集最多的结果。

2 结 果

2.1 斑块差异表达基因

芯片GSE24702中筛选得到290个动脉粥样硬化外周斑块的18 076个差异表达基因，我们对这些基因进行火山图分析，其中7 654个差异基因表达上调， 10 422个差异基因表达下调，而斑块中显著上调的基因多于显著下调的基因（如图1）。

2.2 miR⁃155预测靶基因

利用在线miRNA靶基因预测工具miRDB（http：//mirdb.org/index.html）、miRmap（https：//mirmap.ezlab.org/）和Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测miR⁃155的靶基因，将三个数据库的预测结合信息集合进行结合关联分析，用韦恩图表示预测靶基因的交集，得到406个基因（如图2A）。并把miR⁃155的预测靶基因与斑块差异表达基因做交集，得到371个基因（如图2B）。

2.3 GO富集分析及KEGG通路分析

对miR⁃155预测靶基因与斑块差异表达基因的371个交集基因进行GO分析，按照统计学差异（P<0.05），GO富集的生物过程（biological process， BP）主要包括DNA结合转录因子活性的调控、丝氨酸磷酸化、丝氨酸修饰、T细胞活性的负调控、磷酸化负调控、细胞间粘附的调节、白细胞分化的调节和凋亡信号通路的负调控；细胞组成（cell composition， CC）的功能富集主要包括转录调节复合物、细胞间连接和神经元到神经元突触；分子功能（molecular function， MF）的功能富集主要包括DNA结合转录因子结合、钙粘蛋白结合、泛素样蛋白连接酶结合和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性（如图3）。

对miR⁃155预测靶基因与斑块差异表达基因的371个交集基因进行KEGG分析，按照统计学差异（P值<0.05），主要富集在以下信号通路：MAPK信号通路、PI3K⁃AKT信号通路、胞吞作用、调节干细胞多能性的信号通路、mTOR信号通路和TGFβ信号通路等（如图4）。

GO及KEGG富集分析发现miR⁃155可能通过凋亡信号通路的负调控、转录调节复合物和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的功能以及PI3K⁃AKT和MAPK等信号通路调节动脉粥样硬化斑块内细胞的免疫炎症、增殖、自噬和凋亡，从而影响动脉粥样硬化斑块的发生发展过程。

2.4 miR⁃155靶基因与斑块差异表达基因网络调控机制

371个差异表达中有159个基因上调，212个基因下调。通过GO分析上调表达基因主要富集生物活性脂质受体活性、细胞形态调控和神经元到神经元突触的功能（如图5A）；KEGG分析上调表达基因主要富集癌症的途径、嘧啶代谢等通路（如图5B）；GO分析下调表达基因主要富集泛素连接酶复合体、转录调节复合物、泛素样蛋白转移酶活性和DNA结合转录因子等功能（如图5C）；KEGG分析下调表达基因主要富集PI3K⁃AKT信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、TGFβ信号通路和泛素介导的蛋白水解等通路（如图5D）。

2.5 GEO数据库斑块差异表达基因的GSEA分析

利用GSEA分析，观察这些差异表达的基因在一些既往的通路中的富集情况，分析斑块差异表达基因在相应信号通路是否上调。GSEA分析的结果显示了显著富集的前10个信号通路，大部分涉及炎症、细胞增殖和凋亡调控，如IL6⁃JAK⁃STAT3信号通路、干扰素α/γ反应、KRAS信号通路、TNFα信号通路、IL2⁃STAT5信号通路、E2F靶向效应、炎症反应和补体途径等，还观察到了同种异体移植排斥反应（如图6）。

GSEA分析发现斑块中差异基因富集在IL6⁃JAK⁃STAT3信号通路、炎症反应、TNFα信号通路中显著上调，而KEGG分析miR⁃155调控斑块中下调差异基因也主要富集TGFβ等炎症信号通路，这说明miR⁃155主要通过影响炎症相关信号通路影响动脉粥样硬化斑块的的形成过程。

2.6 miR⁃155靶基因与斑块差异表达基因蛋白互作网络调控

对miR⁃155预测靶基因与斑块差异表达基因做交集，得到371个交集基因，利用STRING蛋白互作数据库对371个差异基因进行互作分析。进行优化处理后，137个节点，210个边，并且处于节点中心位置的排名前12位编码蛋白的基因分别是：抑制蛋白β2（Aarrestin beta 2，ARRB2）、F⁃box蛋白11（F⁃box protein 11，FBXO11）、细胞因子信号传导抑制分子1（Suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）、F⁃box蛋白22（F⁃box protein 22，FBXO22）、F⁃box蛋白30（F⁃box protein 30，FBXO30）、鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS proto⁃oncogene，KRAS）、无名指蛋白19A（Ring finger protein 19A，RNF19A）、三重基序蛋白32（Tripartite motif containing 32，TRIM32）、E3泛素连接酶HERC4（HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 4，HERC4）、E3泛素连接酶PJA1（Praja ring finger ubiquitin ligase 1，PJA1）、E3泛素连接酶RCHY1（Ring finger and CHY zinc finger domain containing 1，RCHY1）和E3泛素连接酶的DET1伴侣（DET1 partner of COP1 E3 ubiquitin ligase，DET1），其中ARRB2、FBXO11基因表达上调，其余基因下调（如图7），这些关键节点在动脉粥样硬化的各个进程中发挥重要的作用。

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种全身性的慢性炎症性血管疾病，脂质沉积在血管壁上，引发AS相关细胞的炎症和自噬凋亡反应^{［20， 21］}。炎症和自噬在动脉粥样硬化的初始病变到终末期并发症的起始和进展中起关键作用。最近，研究表明，miRNA已经成为调节动脉粥样硬化炎症和自噬反应的组分。miR⁃155在疾病的不同阶段，对不同的细胞，靶向不同基因的调控作用表现出明显差异，其机制并未完全阐明^［11］。然而，miR⁃155在不同的细胞类型、病理进程和动物模型中可能发挥抑制炎症或促进炎症这两种相反的作用^［13］。以往的研究表明，miR⁃155广泛参与体内内皮细胞、血管平滑细胞、巨噬细胞^［22］、树突状细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的调控，因此在体外调节各种类型细胞炎症和自噬等相关基因表达以及血管壁动脉粥样硬化形成中起关键作用。此外，miR⁃155可能被用作诊断和治疗动脉粥样硬化的新型疾病生物标志物和治疗靶标^［23］。

利用生物信息学方法发现miR⁃155的预测靶基因中371个在斑块中差异表达，对这些基因的调控网络进行分析。GO富集分析发现miR⁃155可参与多种生物学过程，可能通过细胞凋亡、转录调节复合物以及蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等功能影响动脉粥样硬化发生发展的过程；KEGG富集分析表示miR⁃155主要影响PI3K⁃AKT信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路和TGF⁃β等信号通路，其中PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路的调节可直接影响AS的病理过程^［24］。GSEA分析观察到差异表达基因主要富集在IL6⁃JAK⁃STAT3信号通路、MTORCI信号通路以及PI3K/AKT等信号通路。研究发现，miR⁃155可靶向PIK3R1抑制PI3K/AKT途径从而促进了由IL⁃1β诱导的软骨细胞凋亡和分解代谢活性^［25］；miR‑155也可通过靶向磷脂酰肌醇⁃4，5⁃双磷酸3⁃激酶催化亚基α和Ras同源物调控PI3K/Akt/mTOR信号途径促进ox⁃LDL诱导的人脐静脉内皮细胞自噬^［26］；有研究者提出酒精诱导的miR⁃155敲除小鼠脂肪堆积的减少与过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件（peroxisome proliferator response element， PPRE）和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor alpha， PPARα）（miR⁃155靶标）的结合增加以及MCP1蛋白（MCP1 protein， MCP1）降低有关，miR⁃155的促炎作用促进肝纤维化和酒精诱导的脂肪性肝炎^［27］。本课题组通过GSEA分析斑块差异表达基因发现炎症相关的信号通路在斑块中上调，KEGG分析miR⁃155调控斑块中下调差异基因发现它们富集在炎症相关信号通路。miR⁃155在冠心病患者血清中的水平较高^［28］，同时也有研究表明miR⁃155是促炎因子，对其抑制可以减少动脉粥样斑块的生成。因此，我们认为miR⁃155可作为治疗动脉粥样硬化的有效靶点。

PPI蛋白互作结果显示处于中心节点的基因，经和miRNA靶基因数据库（microRNA⁃Target Interactions， MTI）比对，发现FBXO11，KRAS和TGFβ活化激酶结合蛋白1（TGF⁃beta activated kinase binding protein 1， TAB1）是miR⁃155已经验证的靶标。与FBXO11、FBXO22和FBXO30是F⁃box蛋白家族的成员，在斑块差异表达基因中下调，在细胞凋亡和免疫抑制反应调控中发挥重要的作用。研究表明，FBXO22通过抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）的分泌来阻碍血管的形成^［29］；FBXO11是靶向转录因子蛋白SNAIL（transcription factor protein， SNAIL）蛋白的真正的E3连接酶，用于泛素化和降解，并且FBXO11阻止SNAIL诱导的上皮⁃间充质转移和肿瘤发生^［30］；FBXO30⁃Eg5相互作用是哺乳动物体内的关键检查点^［31］。因此，miR⁃155可能通过调节FBXO家族基因影响动脉粥样硬化的多个过程。KRAS基因编码的蛋白质是小GTPase超家族的成员，同时，许多miRNA也会调控其表达。KRAS ^G12D导致巨噬细胞通过信号转录因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）依赖性脂肪酸氧化转变为M2样肿瘤表型^［32］；SOCS1是细胞因子信号传导抑制因子1，也称为细胞因子信号转导（SOCS）家族的成员。DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1， DNMT1）介导的SOCS1甲基化导致SOCS1表达缺失，抑制激活巨噬细胞中JAK2/STAT3信号通路，并增强了脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）诱导的促炎性细胞因子如TNFα和IL⁃6的释放^［33］。DET1，它可能参与了染色质的重塑过程。研究表明，AKT2/JNK1/2/C⁃JUN和AKT2/miR⁃155⁃5p/DET1/C⁃JUN信号通路，它们调节巨噬细胞的极化和改变牙周炎症状态^［34］；RNF19A，该基因编码无名指之间的环成员（ring member between ring finger， RBR）蛋白质家族。研究发现，NLR家族蛋白（NLR family pyrin domain containing 11， NLRP11）募集在蛋白连接酶RNF19A，以多个位点催化TNF受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）的K48连接泛素化，从而导致TRAF6降解，从而促进NF⁃κB和MAPK信号的激活并增加促炎细胞因子的产生^［35］。因此，miR⁃155主要调节巨噬细胞炎症反应和极化影响动脉粥样硬化早期斑块的形成过程。TRIM32，该基因编码的蛋白质是三重基序（tripartite motif containing， TRIM）家族的成员，涉及许多细胞过程，包括蛋白质稳态和自噬。研究报道，TRIM32是自噬底物，热休克蛋白62（hypothetical protein 62， p62）指示TRIM32发生溶酶体降解，而TRIM32在赖氨酸残基上单泛素化p62参与p62活性的调节。TRIM32的缺失损害了p62的螯合，而TRIM32的重新引入促进了p62点的形成及其自噬降解^［36］；RCHY1介导E3依赖性泛素化和靶蛋白的蛋白酶体降解，从而调节其水平和细胞周期进程。RCHY1介导的Yes1相关转录调节因子（Yes1 associated transcriptional regulator， YAP1）蛋白下调是解释放射诱导的神经胶质瘤细胞凋亡的主要机制^［37］；HERC4属于泛素连接酶的HERC家族，研究表明，HERC4过表达增加了肝癌细胞的增殖和迁移能力，并减少了其凋亡^［38］。因此，miR⁃155可能通过影响细胞的增殖迁移凋亡等影响动脉粥样硬化的多个进程。PJA1编码的蛋白属于一类具有RING手指基序的泛素连接酶，可与E2泛素结合酶UbcH5B相互作用。研究发现，靶向E3泛素连接酶PJA1可增强抑制肿瘤的TGFβ信号传导^［39］。因此，miR⁃155可能通过影响蛋白的稳态与细胞的信号通路等影响动脉粥样硬化的多个进程。

综上所述，结合生物信息学方法，我们确定了miR⁃155调控AS斑块形成发展的网络机制中的关键基因和主要信号通路。对miR⁃155可能调控的靶基因进行GO、KEGG以及GSEA分析，显示了miR⁃155调控动脉粥样硬化斑块多靶点、涉及多种生物过程、分子和通路的特点。miR⁃155主要通过炎症反应、干扰素反应等信号通路调控细胞的增殖、自噬和凋亡，同时发挥免疫炎症调控作用，影响动脉粥样硬化斑块的发生发展过程。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81670412)