以4⁃香豆酸为底物转化白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建

Construction of engineered Escherichia coli for resveratrol synthesis using 4⁃coumaric acid as substrate

摘要

白藜芦醇具有多种生物活性，在食品、化妆品及生物制药中具有广阔的应用前景。利用合成生物学生产白藜芦醇是未来的发展趋势。将白藜芦醇合酶（resveratrol synthase，RS）和4⁃香豆酰⁃CoA连接酶（4⁃coumaric acid⁃CoA ligase，4CL）的编码基因整合到共表达载体pETDuet⁃1上成功构建了重组质粒pETDuet⁃rs⁃4cl，转化大肠杆菌BL21（DE3），在M9培养基中添加4⁃香豆酸，在诱导条件下培养，发酵液中白藜芦醇含量为8.6 mg/L。本研究在大肠杆菌中实现了白藜芦醇的转化，为微生物法生产白藜芦醇奠定了基础。

Abstract

Resveratrol has multiple biological activities and broad application prospects in food， cosmetics and biopharmaceutical industries. The production of resveratrol using synthetic biology is the trend of development. Resveratrol synthase encoding gene rs and 4⁃coumaric acid⁃CoA ligase encoding gene 4cl were inserted into co⁃expression vector pETDuet⁃1 and recombinant vector pETDuet⁃rs⁃4cl was successfully constructed. The recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）. The 8.6 mg/L of resveratrol was determined in M9 fermentation broth with additional 4⁃coumaric acid and inducer. In this study， resveratrol is synthesized in E.coli， which lays a foundation for the production of resveratrol by microbial method.

Graphical abstract

关键词

白藜芦醇 / 大肠杆菌 / 重组工程菌 / 微生物发酵

Key words

resveratrol / Escherichia coli / recombinant strain / microbial fermentation

0 引 言

白藜芦醇（resveratrol）是一种多酚类化合物，主要存在于葡萄、花生、桑椹和虎杖等植物中^［1］。白藜芦醇具有顺式和反式两种化学结构，如图1所示，其中反式白藜芦醇生物活性较高，是植物体中的主要存在形式。现有研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、调节细胞凋亡、减轻炎症反应、抗肿瘤、保护心脑血管等多种药理生物活性，在化妆品、保健食品，生物医药等领域中有着广阔的应用前景^［2~9］。目前，白藜芦醇主要是从植物组织中提取，但从植物中提取受到原材料生长季节，地域分布及提取工艺复杂等影响，导致提取白藜芦醇成本较高，而化学合成白藜芦醇又易对环境造成污染，而且分离手性化合物成本高等诸多因素在很大程度上限制了它的应用^［10］。近年来，随着合成生物学的发展，通过构建异源合成途径在微生物体内合成植物源代谢产物取得很大进展^{［11，12］}。

在植物体中，白藜芦醇的合成途径如图2所示，首先苯丙氨酸经苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonia⁃lyase， PAL）催化生成肉桂酸，然后生成的肉桂酸被肉桂酸⁃4⁃羟化酶（cinnamate⁃4⁃hydroxylase， C4H）羟化生成对香豆酸；对香豆酸经4⁃香豆酰⁃CoA连接酶（4⁃coumaric acid⁃CoA ligase，4CL）作用连接到辅酶A的泛酸基团上生成4⁃香豆酰辅酶A，最后由白藜芦醇合酶（resveratrol synthase，RS）催化1分子4⁃香豆酰⁃CoA和3分子丙二酰⁃CoA生成1分子白藜芦醇。一些植物的酪氨酸裂解酶（tyrosine ammonialyase， TAL）可直接以酪氨酸为底物催化产生对香豆酸，再经4CL、芪合酶（stilbene synthase， STS ）催化合成白藜芦醇^{［13，14］}。

RS和4CL是白藜芦醇合成途径中的两个关键酶，研究表明，在发酵液中添加底物4⁃香豆酸，在大肠杆菌或者酵母中仅表达rs和4cl基因就可实现白藜芦醇的合成^{［12，15，16］}。本研究拟将前期分离到的rs和4cl与质粒pETDuet⁃1构建可同时表达rs和4cl的双表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）实现白藜芦醇的合成，以期为下一步利用微生物发酵实现白藜芦醇的大量合成奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司，pMDTM18T⁃rs、pMDTM18T⁃4cl由重组蛋白基因检测技术国家地方联合工程实验室保存，表达载体pETDuet⁃1由山东大学生命科学院祁庆生教授馈赠。

1.1.2 培养基、主要试剂及仪器

LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0； M9培养基：5×M9盐溶液200 mL、1 mol/L MgSO₄ 2.0 mL、20%葡萄糖20 mL、1 mol/L CaCl₂ 0.1 mL，补加纯水至1 000 mL。主要试剂：分子量标准D2000 DNA Marker、D15000+2000 DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、MunⅠ、XhoⅠ、LA Taq、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、Plasmid Purification Kit Ver.4.0、T₄ DNA Ligase购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizma碱、甘氨酸、氨苄青霉素、荧光染料Gel red购自Sigma⁃Aldrich；蛋白胨、酵母粉、琼脂等购自青岛浩赛科技股份有限公司。仪器：TECHNE TC⁃512 PCR仪（英国Bibby Scientific Ltd）；DYCP 水平电泳仪（北京六一仪器厂）；Tanon 1600R全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；5430R多功能台式高速离心机（上海艾本德生物技术国际贸易有限公司）；YXQ⁃LS⁃50A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；DTY⁃5A智能恒温循环器（北京德天佑科技发展有限公司）；JE203电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；PHS⁃3C pH计（上海虹益仪器仪表有限公司）；DTY⁃900 超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 pETDuet⁃1提取与MunⅠ/XhoⅠ酶切回收

将转有pETDuet⁃1的大肠杆菌DH5α接入氨苄抗性LB液体培养基中，培养后在氨苄抗性平板上划线，37 ℃倒置培养。菌落长出后，挑取单菌落接入氨苄抗性LB液体培养基中，培养12 h以质粒纯化试剂盒提取纯化。取适量提取pETDuet⁃1以MunⅠ/XhoⅠ双酶切，反应体系（20 μL）及条件如下：MunⅠ 1.0 μL、XhoⅠ 2.0 μL、10×M Buffer 2.0 μL、0.1% BSA 2.0 μL、pETDuet⁃1 10.0 μL、H₂O 3.0 μL，37 ℃ 2.5 h，凝胶电泳纯化回收酶切载体片段。

1.2.2 rs和4cl表达序列扩增与酶切回收

根据pETDuet⁃1克隆位点及rs和4cl表达序列分析，设计引物及相应酶切位点如表1所示。以保存pMDTM18T⁃rs质粒为模板扩增rs表达序列，反应体系（50 μL）及组成：Premix 25.0 μL、bRS⁃F 2.5 μL、bRS⁃R 2.5 μL、H₂O 18.0 μL、pMDTM18T⁃RS 2.0 μL；PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、57 ℃退火40 s、72 ℃延伸80 s、35个循环，72 ℃延伸10 min；将扩增产物以DNA凝胶纯化回收试剂盒Ver.4.0纯化回收，取适量以MunⅠ/XhoⅠ酶切，反应体系（20 μL）及条件：MunⅠ 1.0 μL、XhoⅠ 2.0 μL、10×M Buffer 2.0 μL、0.1% BSA 2.0 μL、pETDuet⁃1 10.0 μL、H₂O 3.0 μL，37 ℃、2.5 h。反应完毕纯化回收酶切产物，-20 ℃保存备用。以保存pMDTM18T⁃4cl为模板扩增4cl表达序列，反应体系（50 μL）及组成：Premix 25.0 μL、b4CL⁃F 2.5 μL、b4CL⁃R 2.5 μL、H₂O 18.0 μL、pMDTM18T⁃4cl 2.0 μL；PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min、95 ℃预变性30 s、58 ℃退火40 s、72 ℃延伸100 s、35个循环，72 ℃延伸10 min。反应完毕将扩增产物纯化回收，取适量以BamHⅠ/HindⅢ酶切，反应体系（20 μL）及条件为： 4cl片段8.0 μL、BamHⅠ 1.5 μL、HindⅢ 2.0 μL、10×K Buffer 2.0 μL、H₂O 6.5 μL，37 ℃，2.5 h，反应完毕纯化回收酶切产物，-20 ℃保存备用。

1.2.3 pETDuet⁃rs载体构建与酶切回收

分别取适量1.2.1和1.2.2中酶切纯化后的pETDuet⁃1和rs片段，按如下体系（10 μL）及条件连接：pETDuet⁃1片段1.5 μL、rs片段6.0 μL、10×Buffer 1.0 μL、T4DNA连接酶1.0 μL、H₂O 0.5 μL。将上述体系缓慢混合均匀，4 ℃连接12 h。取适量连接产物，按产品说明书转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞并涂布氨苄抗性培养。待平板长出菌落后，挑取白色单克隆接入氨苄抗性LB液体培养基中，于37 ℃、150 r/min振荡培养12 h，以1.2.1中方法提取纯化质粒；以提取质粒为模板，bRS⁃F、bRS⁃R为引物PCR扩增以验证pETDuet⁃rs是否构建成功，反应体系（50 μL）及组成：pETDuet⁃rs 2.0 μL、Premix 25.0 μL、bRS⁃F 2.5 μL、bRS⁃R 2.5 μL、H₂O 18.0 μL，扩增条件同1.2.2中rs扩增；取适量已构建正确pETDuet⁃rs以BamHⅠ/HindⅢ双酶切，反应体系（20 μL）及组成如下：pETDuet⁃rs 4.0 μL、BamHⅠ 1.5 μL、HindⅢ 2.0 μL、10×K Buffer 2.0 μL、H₂O 10.5 μL；37 ℃，2.5 h。反应完毕纯化回收线性pETDuet⁃rs片段。

1.2.4 pETDuet⁃rs⁃4cl载体构建及验证

分别取1.2.2、1.2.3中酶切回收的pETDuet⁃rs、4cl片段，按如下体系（10 μL）及条件连接：pETDuet⁃rs 1.5 μL、4cl 4.5 μL、10 × Buffer 1.0 μL、T4DNA连接酶 1.0 μL、H₂O 2.0 μL，将上述体系缓慢混合均匀，4 ℃连接12 h。连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞、重组质粒提取等操作步骤如1.2.3中所述；以提取质粒为模板，b4CL⁃F、b4CL⁃R为引物PCR扩增验证4cl片段是否已插入pETDuet⁃rs中，PCR反应体系（50 μL）及组成：Premix 25.0 μL、bCL⁃F 2.5 μL、bCL⁃R 2.5 μL、重组质粒 1.5 μL、H₂O 18.5 μL，扩增条件同1.2.2中4cl表达序列扩增，反应完毕取适量产物电泳检测。

1.2.5 重组pETDuet⁃rs⁃4cl工程菌发酵与白藜芦醇测定

准确称取12.5 mg白藜芦醇标准品，用甲醇溶解定容至250 mL，制得50 mg/L白藜芦醇标准贮存液。分别吸取0 μL、40 μL、80 μL、120 μL、160 μL、200 μL白藜芦醇标准贮存液，以甲醇定容至1 mL，混匀后以高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC）进行测定。HPLC测定条件为：C₁₈反向色谱柱（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流动相为乙腈、水和冰醋酸，体积比25∶75∶0.09，流速0.7 mL/min；紫外检测波长306 nm，色谱柱温度为室温，样品进样10 μL。以样品峰面积为纵坐标，白藜芦醇浓度为横坐标计算标准曲线；将含pETDuet⁃rs⁃4cl表达载体的重组菌接入新鲜氨苄抗性LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min培养24 h，取适量培养物转接入氨苄抗性新鲜M9培养基中，待培养物OD值达0.1~0.2时，取5 mL按1∶100比例转接于终浓度为1 mmol/L 4⁃香豆酸、0.1 mmol/L IPTG的氨苄抗性新鲜M₉培养基中，28 ℃、200 r/min培养24 h。取适量发酵液以等体积乙酸乙酯提取两次，将上层有机相合并、冷冻干燥后重溶于一定体积甲醇，0.22 μm滤膜过滤后用HPLC进行测定。

2 结果与分析

2.1 pETDuet⁃1质粒提取与酶切回收

为构建rs、4cl双基因表达载体，实验采用具两个多克隆位点和独立T7启动子的pETDuet⁃1质粒，它可同时表达两个外源基因。提取的pETDuet⁃1电泳检测如图3（a）所示，从图中可看到所提取质粒有三条明显电泳条带，并以超螺旋条带为主，这表明所提pETDuet⁃1质粒质量较好，可用于下一步酶切实验。

质粒pETDuet⁃1经限制性内切酶MunⅠ/XhoⅠ酶切后的电泳检测结果如图3（b）所示，从图中可以看出pETDuet⁃1经酶切后呈线性状态，大小与预期一致，这表明pETDuet⁃1已被完全切开。将目的条带切下后纯化回收，用于下一步pETDuet⁃rs重组质粒的构建。

2.2 pETDuet⁃rs重组载体鉴定与酶切回收

为验证1.2.3中rs表达序列是否已经插入到重载体pETDuet⁃1中，对提取的重组质粒进行了PCR扩增。rs开放阅读框为1 179 bp，加上两端酶切位点和保护碱基，序列全长为1 238 bp。从图3（c）可以看出，以1.2.3中所构建重组质粒为模板，经PCR扩增所得产物条带大小与预期一致，这表明rs的表达序列已插入到载体pETDuet⁃1多克隆位点，pETDuet⁃rs重组载体构建成功。将重组pETDuet⁃rs进行BamHⅠ/HindⅢ酶切，回收线性pETDuet⁃rs片段，用于pETDuet⁃rs⁃4cl双表达载体的构建。

2.3 重组表达载体pETDuet⁃rs⁃4cl鉴定

为验证1.2.4中重组载体pETDuet⁃rs⁃4cl是否构建成功，对其插入片段进行了PCR扩增。4cl基因完整开放阅读框序列为1 686 bp，加上两端酶切位点和保护碱基，序列全长为1 740 bp。以1.2.4中所构建重组质粒为模板，经PCR扩增所得产物的电泳检测结果如图3（d）所示，从中可以看出扩增产物电泳条带大小与预期一致。这表明4cl表达序列已插入到载体pETDuet⁃rs另一多克隆位点，pETDuet⁃rs⁃4cl重组载体构建成功。

2.4 重组工程菌发酵中白藜芦醇含量的测定

4⁃香豆酸标准品， 反式白藜芦醇标准品和重组菌发酵液样品的HPLC分别如图4（a）、（b）、（c）所示，其中反式白藜芦醇保留时间为15.587 min。根据白藜芦醇标准品峰面积和相应浓度作标准曲线，计算所得标准方程为Y=1.967 2X+0.204 8，相关系数R²=0.996 8，其中Y为测量的峰面积，X为白藜芦醇标准品浓度。根据所测得发酵液中白藜芦醇峰面积计算，发酵液中白藜芦醇的浓度为8.6 mg/L。这表明rs、4cl基因在BL21（DE3）中实现了表达并合成了白藜芦醇。

3 讨 论

近年来，生物技术的快速发展使得利用微生物细胞来合成植物源的活性物质成为研究热点，相关研究者开始利用微生物系统来进行白藜芦醇合成研究。

大肠杆菌和酵母是常用表达系统，研究显示，在利用微生物发酵合成白藜芦醇的过程中，菌株、目的基因4cl和rs的来源以及它们之间的不同组合都会影响白藜芦醇的产量。来源于拟南芥的4cl，烟草4cl分别和rs在大肠杆菌中表达，可获得4.5 mg/L和25.76 mg/L的白藜芦醇^{［17，18］}。拟南芥4cl和马尾松rs在大肠杆菌BL21 Star中表达时未检测到白藜芦醇产生，而将欧兰芹4cl和花生rs在大肠杆菌BL21 Star中表达可产生33.0 mg/L白藜芦醇；拟南芥4cl和花生rs在大肠杆菌BW27784中可产生404 mg/L的白藜芦醇，相同条件下欧兰芹4cl和葡萄rs则可产生1 380 mg/L白藜芦醇^［15］。在酿酒酵母中，表达杨树4cl和葡萄rs可获得1.5 μg/L白藜芦醇^［19］，而烟草4cl和葡萄rs可得到6 mg/L的白藜芦醇 ^［20］。此外，有研究者通过对表达系统进行相关优化以提高白藜芦醇的产量，如在酿酒酵母中引入“脚手架”策略，对4cl、rs进行突变和密码子优化等来提高白藜芦醇的合成产量^{［21，22］}，但大多数情况下生物产量比较低，还远未达到可大量生产白藜芦醇的程度。

本实验中重组菌发酵后产生的白藜芦醇含量为8.6 mg/L，从理论上计算，底物4⁃香豆酸利用率很低，增加或减少其添加量也未对白藜芦醇的产生有明显影响，推测可能是因为4cl和rs中某一个酶或者两个酶的活性较低。在下一步工作中，我们将以此为基础，在菌株类型、发酵培养条件、4cl和rs表达的组合方式与密码子偏好性，以及基因定点改造等方面进行深入研究，以期为将来利用微生物大量合成白藜芦醇提供相关研究数据及理论依据。

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基金资助

山东博奥克生物科技有限公司博士后项目(bsh151210)

宜宾市科技计划项目(2019YG01)