不同采收期罗布麻和白麻药材化学成分的差异分析

Differences analysis of chemical constituents of Apocynum venetum L. and Apocynum pictum （Schrenk） Baill. in different harvest times

摘要

建立高效液相色谱法，分别测定不同采收期的新疆产罗布麻和白麻药材中绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、芦丁和白麻苷的含量，进而分析2种药材的最佳采收期。发现不同采收期的新疆产罗布麻和白麻药材中绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、芦丁和白麻苷的含量存在一定差异，并且罗布麻和白麻呈现出不同特点。以《中国药典》中罗布麻含量测定项下的金丝桃苷为指标，罗布麻和白麻的最佳采收期都是6、7月；但是，以7个成分的总含量和6个黄酮的总含量为指标，罗布麻的最佳采收期是8、9月，白麻的最佳采收期仍是6、7月。该结果可为确定罗布麻和白麻药材的采收时间提供一定参考。

Abstract

The HPLC method was used to determine the contents of chlorogenic acid， quercetin⁃3⁃O⁃sophoroside， rutin， hyperin， isoquercitrin， trifolin and astragalin in Apocynum venetum L. and Apocynum pictum （Schrenk） Baill. in Xinjiang at different harvest times. The content determination results showed that there were some differences in the contents of chlorogenic acid， quercetin⁃3⁃O⁃sophoroside， rutin， hyperin， isoquercitrin， trifolin and astragalin in A.venetum and A.pictum in different harvest time in Xinjiang， and showed different characteristics. According to the characteristic components of hyperin of Apocynum venetum L. in Pharmacopoeia of the People’s Republic of China， the best harvest time of A.venetum and A.pictum was June and July. However， from the perspective of total components and six flavonoid contents， the best harvest time of A.venetum was August and September， and the best harvest time of A.pictum was still June and July. The results can provide a reference for the analysis and evaluation of the differences between A.venetum and A.pictum in different harvest periods and the selection of harvest time.

Graphical abstract

关键词

罗布麻 / 白麻 / 高效液相色谱法 / 含量测定 / 采收期

Key words

Apocynum venetum L. / Apocynum pictum （Schrenk） Baill. / high performance liquid chromatography（HPLC） / content determination / harvest time

0 引 言

罗布麻叶为夹竹桃科（Apocynaceae）罗布麻属（Apocynum）植物罗布麻（Apocynum venetum L.）的干燥叶，有平肝安神、清热利水功效^［1］。研究表明， 黄酮^［2］是其主要活性成分，具有抗氧化^［3］、抗糖尿病^［4］、抗血小板聚集^［5］、抗癌^［6］、保肝^［7］和抑菌^［8］等多种活性。白麻叶为同科同属植物白麻（Apocynum pictum （Schrenk） Baill.）的干燥叶，其与罗布麻叶具有相似的成分与药理活性^［9~12］。二者均为新疆民间常用药材，在新疆分布广泛，主要分布在塔里木盆地各河岸、准噶尔盆地盐碱荒地、额尔齐斯河流域、艾比湖流域、盐化草甸土和沙漠边缘^［13］。《中华人民共和国药典》^［1］规定罗布麻叶夏季采收，除去杂质，干燥。《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》^［9］规定白麻夏季采收。有文献报道金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、芦丁、白麻苷和绿原酸成分的药理活性均与罗布麻和白麻的临床疗效相关^［14~20］。本研究通过高效液相色谱法（HPLC）对夏季6~9月份收集的药材中7个活性成分含量进行测定，旨在确定新疆罗布麻和白麻药材最佳采收期，为后期质量评价研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

U3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）；AB265⁃S（1/10万）电子天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；HH⁃6数显恒温水浴锅（金坛市华峰仪器有限公司）；JY92⁃2D超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

绿原酸（批号MUST⁃20032310）购于成都曼斯特生物科技有限公司；芦丁（编号FZ6R⁃FZ5R）、金丝桃苷（编号2TFX⁃XEMN）和异槲皮苷（编号OG64⁃Y8L3）购于中国食品药品检定研究院；三叶豆苷（编号23627⁃87⁃4）和白麻苷（编号18609⁃17⁃1）购于上海源叶生物科技有限公司；紫云英苷（编号SA8590）购于北京索莱宝科技有限公司。乙腈和甲醇为色谱纯，购于赛默飞世尔科技中国有限公司，其余试剂均为分析纯，购于天津市百世化工有限公司。

药材于2019年在新疆库尔勒、阿勒泰和精河县采收，除去杂质后阴干。经新疆维吾尔自治区中药民族药研究所王果平研究员鉴定，药材S1~S8为罗布麻的干燥叶，S9~S12为白麻的干燥叶。药材信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液制备

精密称取绿原酸2.5 mg、白麻苷2.2 mg、芦丁2.5 mg、金丝桃苷2.5 mg、异槲皮苷6.2 mg、三叶豆苷5.0 mg和紫云英苷4.1 mg于10 mL容量瓶中，用50%的甲醇定容制备成单一对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，加入到25 mL容量瓶中，用50%的甲醇定容，制成浓度为绿原酸0.039 mg/mL，白麻苷0.15 mg/mL，芦丁0.092 mg/mL，金丝桃苷0.035 mg/mL，异槲皮苷0.098 mg/mL，三叶豆苷0.098 mg/mL和紫云英苷0.009 8 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液制备

精密称定样品粉末（过40目筛）0.50 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，放置至室温后再次称定重量，并用50%甲醇溶液补足失重。滤过，取续滤液，备用。

1.2.3 色谱条件

Phenomenex Kinetex C₁₈（100 mm×4.6 mm， 2.6 µm）色谱柱，以乙腈（A）和0.01%三氟乙酸（TFA）水溶液（B）梯度洗脱：0~6 min，6% A；6~11 min，6%~8% A；11~15 min，8%~12% A；15~29 min，12%~26% A；29~31 min，26%~27% A；31~50 min，27%~70% A。流速为0.6 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长281 nm，进样量为10 µL。

1.2.4 线性关系考察

精密吸取不同体积的对照品溶液，测定各成分的峰面积，以各成分的进样量为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），进行线性回归，得各成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围。

1.2.5 精密度

精密吸取同一供试品溶液（S10）10 µL，连续进样6次，记录各成分的峰面积并计算相对标准偏差。

1.2.6 稳定性

精密吸取同一供试品溶液（S10）10 µL，分别在0、2、10、24 h测定，记录各成分的峰面积并计算相对标准偏差。

1.2.7 重复性

称取S10样品6份，按照1.2.2的方法制备供试品溶液，进样，记录各成分的峰面积并计算各成分含量的相对标准偏差。

1.2.8 准确度试验

称取已测知含量的同一供试品（S10）6份，约0.5 g，按照各成分等比例地精密加入对照品溶液中，按照1.2.2的方法制备供试品溶液，按照1.2.3的色谱条件进样测定，分别计算各成分的加样回收率。

1.2.9 含量测定

精密称取12批药材粉末（过40目筛），按照1.2.2的方法制备供试品溶液，按照1.2.3的色谱条件测定，分别计算各药材中7个成分的质量百分比。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

各成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围，见表2。

2.2 精密度

绿原酸、白麻苷、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷和紫云英苷峰面积的相对标准偏差分别为1.70%、0.90%、0.40%、1.10%、1.80%、1.10%和1.90%，说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性

绿原酸、白麻苷、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷和紫云英苷峰面积的相对标准偏差分别为2.10%、0.80%、0.40%、1.40%、2.20%、1.30%和1.80%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 重复性

绿原酸、白麻苷、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷和紫云英苷含量的相对标准偏差分别为2.10%、1.60%、0.20%、1.00%、2.70%、1.90%和2.10%，说明该方法重复性良好。

2.5 准确度试验

绿原酸、白麻苷、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷和紫云英苷的平均加样回收率分别为87.45%、85.34%、91.50%、85.10%、90.43%、86.73%和85.27%，相对标准偏差值分别为2.2%、3.3%、2.9%、1.8%、3.0%、4.0%和2.6%，说明该方法准确度良好。

2.6 含量测定

12批药材中7个成分的质量百分比结果见表3，HPLC图谱见图1；含量测定结果表明，不同采收期新疆产罗布麻和白麻药材中绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、芦丁和白麻苷的含量存在一定差异。

2.7 不同采收期的成分含量比较

2.7.1 不同采收期药材成分含量比较分析

由图2可知，两种不同产地（库尔勒、阿勒泰）的罗布麻中绿原酸和芦丁在所有成分中的比重最大，而且相对稳定。但是，在白麻中这两种成分在8、9月份下降的趋势非常明显。白麻苷的含量在白麻中呈现逐月增长趋势，以8、9月份的含量最高，而两种罗布麻中仅在6、7月份的库尔勒罗布麻里检出白麻苷，并且含量不高。罗布麻和白麻中金丝桃苷变化规律未表现出明显的品种差异，以6、7月份的含量最高。

2.7.2 罗布麻和白麻药材中总成分和总黄酮含量的比较

以3个产地的药材中7个成分的总含量和6个黄酮成分的总黄酮含量百分比进行折线图分析，见图3、图4。由图可知，两个产地的罗布麻中总成分和总黄酮的累积趋势较为相似，基本都是随月份增加而增加，以8、9月份的含量最高。白麻中成分累积趋势则与罗布麻相反，略微上升之后逐月下降，并以7月的含量最高。

2.7.3 3个产地的药材中7个成分的比较

由图5可知，两种不同产地的罗布麻中，绿原酸、芦丁、三叶豆苷、白麻苷和紫云英苷累积趋势相同，而白麻中则不同。3个产地药材中，金丝桃苷总的趋势相似。异槲皮苷成分在两个罗布麻中的变化趋势完全不同，有待进一步研究。

3 讨 论

3.1 实验方法的优化

本研究提取药材时，采用回流提取和超声提取两种方法后出来的色谱峰差异不大，因此用了操作简便、耗时短的超声提取法；提取溶剂用常用的甲醇，分别用50%，65%和80%甲醇提取后，根据色谱峰形选择50%甲醇。流动相B用甲酸水溶液6个黄酮类糖苷极性较大，洗脱后色谱峰较集中，换成三氟乙酸水溶液后得到了均匀的色谱峰，峰形也得到了改善。

3.2 采收季节的选择

从总成分和总黄酮的含量看，两个产地罗布麻的成分累积趋势基本相同，总体上都是逐月增加的，一定程度上说明较长的生长时间有利于总成分和总黄酮的累积。虽然两个产地的罗布麻在总成分和总黄酮在具体含量上有一定差异，但是产地并未对二者的累积规律产生明显影响。白麻的成分累积趋势则与罗布麻不同，是略微上升之后逐月下降，但因产地也与罗布麻不同，并不能完全确定这种累积规律的差异是否来源于种间差异。总体上看，无论是罗布麻还是白麻，绿原酸、芦丁等成分的变化趋势与总成分、总黄酮的变化规律基本一致。但是，金丝桃苷则呈现不同特点，在两个品种中的变化趋势是相似的，总体上是逐月减少的，并以6、7月份的含量最高。金丝桃苷被认为是罗布麻的功效成分之一，并且《中国药典》^［1］也对罗布麻中金丝桃苷的含量做出了规定，从这个角度看，罗布麻和白麻的最佳采收期都是6、7月。但是，从总成分和总黄酮含量来看，罗布麻的最佳采收期则是8、9月份。有研究通过分析6~9月份采收的阿勒泰罗布麻中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素四个黄酮总含量整体趋势，得出黄酮总量最高的8月份为最佳采收期，与本研究研究结果一致^［21］。用紫外分光光度法测定6~8月份采收的新疆白麻叶中总黄酮的含量，其积累趋势与本研究完全一致，以6、7月份采集的白麻叶总黄酮含量最高^［22］。本研究增加活性成分的种类，通过含量测定方法得出的结果与已报道文献一致，可为确定罗布麻和白麻的最佳采收时间提供一定参考。

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基金资助

国家重点研发计划(2017YFF0211005)

新疆维吾尔自治区重大科技专项项目(2016A03006)