白及MSI1基因的序列分析及SSR多态性分析

Sequence analysis and SSR polymorphism analysis of MSI1 gene in Bletilla striata

摘要

通过对白及（Bletilla striata （Thunb.） Rchb.f.）的IRA1多拷贝抑制子（multicopy suppressor of IRA1，MSI1）基因序列进行生物信息学分析，并根据其核苷酸序列设计简单重复序列（simple sequence repeats， SSR）引物，进一步验证其在多个白及地方种中高度的保守性。运用Protparam、SOPMA、SWISS⁃MODEL等生物信息学软件分析白及MSI1蛋白的理化性质和结构域；DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析；分析序列中的SSR位点并对多个白及品系进行PAGE检测和验证。结果显示，克隆得到的BSMSI1基因全长为3 700 bp，共编码了601个氨基酸残基，预测蛋白质分子量为65 309.75 kg/moL，等电点为5.95，表现出高度的保守性，而且发现不同地区的白及BSMSI1基因在遗传上具有多样性。本研究拓展了对 BSMSI1序列的认识，新开发标记能有效应用于MSI1基因的检测和育种鉴定，同时也可为其他物种的MSI1基因研究提供参考。

Abstract

By analyzing the sequences information of multicopy suppressor of IRA1 in Bletilla striata （BSMSI1）， simple sequence repeats （SSR） primers were designed based on the nucleotide sequence to further verify the high conservation in multiple Bletilla striata local species. The physical and chemical properties and domains of BSMSI1 protein were determined by a series of bioinformatics tools such as Protparam， SOPMA， SWISS⁃MODEL. Multiple alignment and phylogenetic tree were respectively achieved by DNAMAN. SSR sites in the sequence were analyzed and the PAGE electrophoresis confirmed that this primer pair had polymorphism. The sequence of BSMSI1 was 3 700 bp in length which encoded a protein of 601⁃amino⁃acid with a molecular weight of 65 309.75 kg/mol and an isoelectric point （pI） of 5.95. And this sequence showed a high degree of conservatism. Moreover， the genes of Bletilla striata in different regions were found to be genetically diverse. The results expanded the understanding of BSMSI1 gene sequence. The newly developed marker could be effectively applied to the detection of MSI1 gene and breeding projects， and it also provided reference for MSI1 researches of other species.

Graphical abstract

关键词

白及 / MSI1基因 / 结构与功能 / 生物信息学分析 / 简单重复序列

Key words

Bletilla striata / MSI1 / structure and function / bioinfomatic analysis / simple sequence repeats （SSR）

0 引 言

白及（Bletilla striata）为兰科（Orchidaceae）白及属（Bletilla）多年生草本药用植物，主要分布于我国贵州、四川、湖南和江西等地^［1］。白及是我国的名贵中草药，主要以干燥块茎入药，具有止血收敛、消肿生肌之功效，其药理作用主要包括抗菌、活血止血、促进创伤愈合、促进胃肠道黏膜损伤的修复、促进骨髓造血、抗肿瘤、防龋及修复牙槽骨缺损、美白抗氧化和免疫调节功能^［2~4］。研究表明，白及含有白及多糖胶、淀粉、联苄类、菲类及其衍生物、芪类、花色素苷类、三萜、甾体、醚类、脂类、黄酮类、多酚类、氨基酸及其少量的挥发油等成分^［5］。运用现代生物技术构建起白及等濒危民族中药的标志性成分的生物合成体系，是中药材现代化升级和国际化的大势所趋。因此，通过研究这些中药材细胞的生长和发育来提高其药用活性成分利用率和研究代谢通路显得尤为重要。

IRA1的多拷贝抑制子（multicopy suppressor of IRA1， MSI1）是调控细胞生长的Ras⁃cAMP通路中IRA1基因突变的多拷贝抑制因子^［6］；MSI1还参与了中央细胞核的复制和之后胚乳发育相关基因的表达，这说明MSI1基因在受精和种子发育中起着重要调控作用^［7］；研究表明，MSI1基因在植物的各个器官均有表达，而且在整个种子发育过程中一直处于表达状态^［8，9］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，还发现MSI1基因参与了种子的早期发育，并与其开花时间和花粉的发育相关^{［10，11］}。

有研究发现，MSI1基因缺陷的拟南芥突变体中存在SE融合（synergid⁃endosperm fusion），并在未受精的情况下能形成自主胚乳^［12］。在MSI1过表达的转基因番茄（Solanum lycopersicum）果实中，发现MSI1能抑制其果实成熟^［13］。MSI1基因在种子发育过程中具有十分重要的功能，然而目前对白及中有关MSI1基因的报道很少。

本研究通过对白及MSI1基因（Bletilla striata multicopy suppressor of IRA1， BSMSI1）序列进行生物信息学分析，探究该基因蛋白的理化性质和保守结构域的功能，并根据其转录组测序的序列开发设计了特异性检测的分子标记，以期为其他物种MSI1基因的结构与功能分析、分子检测研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中所用材料白及为本研究组在贵州正安（N28°56′，E107°43′）和修文（N26°84′，E106°59′）采收，并选取了白及生长状态良好的嫩叶进行DNA提取。

1.2 Trizol法提取RNA

用Trizol法提取白及叶片RNA。首先，取出白及组织，用液氮进行充分研磨，将研磨后的粉末快速放入提前预冷2 mL的EP管中，加1 mL Trizol试剂，震荡混匀，室温放置5 min；再加入0.2 mL氯仿，颠倒混匀15 s，室温放置2 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min（离心机提前预冷至4 ℃）；用移液枪吸取上清液至1.5 mL的灭菌EP管中，加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃放置20 min；4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃掉上清液，在沉淀中加入1 mL 75%乙醇；4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃掉无水乙醇后于通风处晾干至无乙醇味。最后，加入30 μL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate， DEPC）水溶解RNA，RNA于-80 ℃冰箱保存。

1.3 白及转录组数据库构建

将悬浮培养的白及愈伤组织通过Trizol试剂提取RNA（购自大连宝生物工程公司），质量检测后进行转录组测序，对unigene 序列进行信息学注解，从中挑选出MSI1基因序列，进行后续分析。

1.4 CTAB法提取DNA

用常规CTAB法提取叶片DNA。选取新鲜白及叶片用液氮进行充分研磨，加入1 ml CTAB裂解缓冲液，30 ℃水浴锅加热30 min；12 000 r/min离心8 min，吸取上清液500 μL并加入500 μL氯仿和异戊醇的混合液（V_氯仿∶V_异戊醇=24∶1），缓慢并充分混匀，12 000 r/min离心5 min；吸出上层水相400 μL并加入400 μL无水乙醇（-20 ℃预冷），轻轻摇晃出白色絮状DNA，12 000 r/min离心1 min；再加入75%乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，于通风处晾干至无乙醇味。最后，加入50 μL的灭菌ddH₂O，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 IRA1的多拷贝抑制子基因的生物信息学分析

用ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析MSI1基因序列开放阅读框；用Conserved domain search工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析其蛋白的保守结构域；用Expasy Prot Param（https：//web.expasy.org/protparam/）分析其分子量、等电点和氨基酸组成；用Prot Scale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析该蛋白的亲疏水性；用NetPhos3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点；用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）预测二级结构和三维结构；DNAMAN（6.0）进行多重比对分析；MEGA6.0构建系统发生树^［14］。

1.6 SSR检测与PAGE验证

用NWISRL在线服务器（https：//ssr.nwisrl.ars.usda.gov）对白及测序后得到的MSI1基因的核苷酸序列检测序列的简单重复序列（simple sequence repeats， SSR）位点，再利用DNAMAN软件对序列检索到的SSR位点设计特异性引物62216 F1（5'⁃GGCGATGTAATTGTTGTTTGAT⁃3'）和62216 R1（5'⁃TGATCTTCTGGGGATA⁃ATTAAAT⁃3'），再进一步通过PCR扩增基因序列和PAGE电泳检测结果。PCR反应体系：正/反向引物各0.75 μL，2×PCR MIX 6 μL，ddH₂O 1 μL，白及DNA模板1.5 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃延伸 5 min。将PCR产物进行PAGE电泳实验，使用PowerPac型稳压稳流电泳仪，用10% 聚丙烯酰胺凝胶分离扩增产物，恒定电压150 V，电泳90 min，硝酸银染色观察。

2 结果与分析

2.1 BSMSI1的氨基酸理化性质特征分析

从白及转录组数据库中挑选出初步注解为BSMSI1基因的全部unigene，去除冗余和不完整序列后对序列进行ORF finder的开放阅读框的完整性检测，预测出序列共编码了601个氨基酸序列残基。将ORF finder推导出的氨基酸序列通过NCBI的CCD程序进行验证，结果表明该ORF编码的蛋白具有FYVE保守结构域。利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的Conserved domain search工具分析BSMSI1蛋白，发现该蛋白具有明显的FYVE锌指结构域（如图1）。Expasy⁃Prot⁃Param软件预测BSMSI1蛋白由20种氨基酸组成，脯氨酸（Pro）和丝氨酸（Ser）含量最高，不含吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。该蛋白分子式为C₂₈₂₉H₄₃₂₆N₈₁₄O₉₂₇S₂₃，分子量为65 309.75 kg/mol，负电荷残基（Asp+Glu）63个，正电荷残基（Arg+Lys）54个，理论等电点为5.95，分类为酸性蛋白质。在哺乳动物网织红细胞内半衰期为30 h，脂肪系数为52.78，亲水性总平均值为-0.737，不稳定系数为60.57，表明该蛋白质结构不稳定。

2.2 BSMSI1蛋白的亲疏水性分析

利用在线软件Prot Scale对BSMSI1的蛋白进行亲疏水性预测分析，疏水性最强的氨基酸是异亮氨酸（Ile），分值为4.5；亲水性最强的氨基酸是精氨酸（Arg），分值为-4.5。亲水氨基酸占65%，疏水氨基酸占35%，其总平均值为-0.49，该蛋白的区域多位于亲水区域（图2）。由此可以看出，BSMSI1蛋白是一个亲水蛋白质。

2.3 BSMSI1蛋白的磷酸化修饰检测

通过NetPhos3.1 Server对BSMSI1蛋白的氨基酸序列进行分析，发现该蛋白共有84个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有53个，苏氨酸磷酸化位点有14个，酪氨酸磷酸化位点有17个（图3）。

2.4 BSMSI1蛋白的空间结构预测

由图4可知，用SOPMA软件预测BSMSI1蛋白的二级结构，结果表明其主要的结构元件是不规则卷曲和α⁃螺旋（图4A）。通过SOPMA分析结果可知，BSMSI1蛋白的二级结构中无规卷曲占61.40%，α⁃螺旋占19.63%，延伸链占13.64%，β⁃转角占5.32%。从分布位点上来看，C端和N端均含无规则卷曲，无规则卷曲散布于整个蛋白质中。使用SWISS⁃MODEL建模服务器预测了BSMSI1蛋白的三维结构，发现无规则卷曲和螺旋占据了该蛋白的大部分空间（图4B），这与BSMSI1蛋白的二级结构相吻合。

2.5 基因编码蛋白的多序列比对分析

应用软件DNAMAN，将BSMSI1蛋白与白及的近缘物种铁皮石斛（Dendrobium catenatum，XP_020685918.1）和蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris，XP_020581999.1）以及其他物种芦笋（Asparagus officinalis，XP_020254417.1）、猕猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis，PSS31236.1）、柑桔（Citrus sinensis，XP_006473696.1）和茶树（Camellia sinensis，XP_028055365.1）在氨基酸水平上进行同源性比较（图5），发现BSMSI1基因在近缘物种中具有非常高的保守性，其中与同为兰科的铁皮石斛和蝴蝶兰的同源性分别为90.53%、89.02%。

2.6 BSMSI1基因的系统进化分析

利用NCBI上BLAST功能搜索与BSMSI1氨基酸序列相似度高的序列，并利用MEGA软件，选择NJ法构建系统进化树。从构建的进化树中可见（图6），BSMSI1蛋白序列与铁皮石斛和蝴蝶兰处于同一进化分支上，表明它与两者亲缘关系较近；与其他物种的亲缘关系较远。

2.7 SSR标记的多态性分析

对贵州正安紫花紫果白及（BS⁃1~BS⁃12）和修文紫花紫果白及（BS⁃13~BS⁃24）的基因组DNA用SSR引物进行了PCR扩增，再通过PAGE电泳发现，BS⁃1~BS⁃23白及具有单一且一致的条带和多态性条带（图7），体现了贵州地区白及的BSMSI1基因在遗传上既具有保守性也具有多态性。

3 讨 论

在植物中，MSI1基因研究较少。在模式植物中发现MSI1基因参与调控了种子的发育过程，并参与调控开花时间^{［15，16］}。本研究通过生物信息学分析和PAGE检测，为白及以及其他植物的细胞生长和发育的调控通路探究提供了一定依据。通过分析，发现BSMSI1基因全长为3 700 bp，共编码了601个氨基酸序列残基，预测显示BSMSI1蛋白由20种氨基酸组成，其中脯氨酸和丝氨酸含量最高，该蛋白分子式为C₂₈₂₉H₄₃₂₆N₈₁₄O₉₂₇S₂₃，分子量为65 309.75 kg/mol，理论等电点为5.95，其蛋白为酸性蛋白质和亲水性蛋白质。

本研究构建了BSMSI1基因与多个植物比较的进化树，再结合其理化性质分析和多序列比对分析的结果，显示BSMSI1蛋白具有稳定的保守结构，且其在近缘物种中具有很高的保守性，与石斛的同源性最高，高达90.53%^［17］，而在其他物种中同源性较低，表明MSI1基因在兰科植物中具有很高的保守性，这对于兰科植物的品种鉴定和保护具有重要作用。本研究发现，BSMSI1蛋白有84个磷酸化位点，磷酸化在植物基因组正确转录表达和植物生长发育及逆境胁迫响应的过程中起着重要的调控作用^{［18，19］}，因此，也能看出MSI1基因在白及的生长和发育过程中发挥了重要的调控作用。

本研究通过SSR标记分析，发现BSMSI1基因在不同地区的白及中具有高度保守性，通过扩增出的条带的不同位置和数量，能初步判断不同地区白及的亲缘关系，而且通过在不同物种中BSMSI1蛋白序列比对也发现该基因在近缘物种也有很高的保守性，这对不同物种之间的基因分析以及不同品种之间的鉴定和资源保护具有重要意义^{［20，21］}。本研究首次对白及MSI1基因进行生物信息学分析和PAGE检测，这些分析结果既有利于白及资源的种质评价和资源保护，也为BSMSI1基因调控白及生长发育的通路机制探究提供了基础数据，同时为其他药用植物MSI1基因的分析奠定了理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31560079)

国家自然科学基金项目(31960074)

贵州省科学技术基金项目(黔科合平台人才［2017］5733-050)

贵州省科学技术基金项目(黔科合平台人才［2017］5712)

贵州省中医药管理局课题(QZYY-2019-060)