0 引 言
石菖蒲(
Acorus tatarinowii)隶属于天南星科(Araceae)菖蒲属(
Acorus),是一种广泛分布于我国南方各省的常用中草药,其主要入药部位为干燥根茎。石菖蒲具有开窍醒神,化湿和胃,宁神益志的功效,是治疗癫痫、痰厥、热病神昏、健忘、气闭耳聋、心胸烦闷等精神不振的常用开窍药物
[1]。对石菖蒲化学成分及相关药物机理研究
[2,3]发现,石菖蒲挥发油中的
α⁃细辛醚(
α⁃asarone)、
β⁃细辛醚(
β⁃asarone)、细辛醛(asaronaldehyde)、甲基丁香酚(methyleugenol)等物质是其主要药性成分。有学者发现将石菖蒲挥发油应用于动脉粥样硬化大鼠,其主要药效成分
β⁃细辛醚可明显改善小鼠动脉粥硬化症状,对心肌缺血大鼠亦有良好作用效果,可降低内皮素(ET)数值,提高体内NO含量,缓解心肌细胞损伤状况,降低坏死速度,维持心血管正常生理代谢,稳定体内血液循环
[4]。
β⁃细辛醚对心肌细胞具有保护作用,12.5 μg/mL的
β⁃细辛醚对心肌细胞的保护作用较强
[5]。
β⁃细辛醚对血栓形成有良好拮抗作用,可有效减缓小鼠体内凝血现象,降低小鼠血液黏度,改善小鼠体内血液流动性。此外,可在一定程度上修复心肌损伤,舒缓血管进而改善血液循环
[6];
α⁃细辛醚常用作抗癫痫等病的治疗
[7]。在人血管脐静脉内皮细胞株(ECV304)培养基中,添加不同剂量
β⁃细辛醚,均能在不同程度上缓解ECV304细胞凋亡,稳定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),维持机体内循环稳定,促进血管内皮细胞机能恢复,对动脉硬化(Atherosclerosis, AS)治疗与防治具有极其重要意义
[8]。此外,
α⁃细辛醚还可以稳定甚至增强机体心功能,其药理为通过改善心肌细胞搏动频率、增强心肌细胞活力进而达到稳定心肌细胞作用
[9]。综上所述,石菖蒲挥发油运用于小鼠体内可降低小鼠大脑组织一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性,改善小鼠认知功能,且石菖蒲中水溶性成分和挥发油成分作用效益相似
[10]。通过详细统计分析发现我国老年痴呆治疗方剂中,中药石菖蒲出现频次达58次,配对药物中,人参⁃石菖蒲出现频次为19次,均为相关搜索频次中最高,表明石菖蒲药效稳定、效果较好,是阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)临床治疗中不可或缺的药物
[11]。
气相色谱法(gas chromatography, GC)是一种分离复杂样品中化合物的重要化学分析方法,其在药物成分精确分析中已得到广泛应用。质谱(mass spectrnum, MS)在对有机化合物结构及成分解析中有其独特的优势;可根据各类有机化合物的断裂规律,在质谱图中通过相关分子碎片离子峰,对有机化合物结构进行精准判断。气相色谱⁃质谱(gas chromatography⁃mass spectrometry, GC⁃MS)联用可有选择地检测所需要的目标化合物和离子,精确度较高,灵敏度提升显著;此外,由于计算机化及分析技术的发展,可对复杂混合样品进行完整定性定量分析,可以获得质量、保留时间、强度等多维信息。因此,其在分析中药材挥发油成分中有着不可替代作用。
石菖蒲挥发油成分的GC⁃MS分析已被广泛研究。有学者已建立了石菖蒲的GC⁃MS指纹图谱,发现不同地区石菖蒲挥发油中均含有甲基丁香酚、顺式甲基异丁香酚、反式甲基异丁香酚、
γ⁃细辛醚、
β⁃细辛醚和
α⁃细辛醚等成分
[12,13]。应用GC⁃MS联用法分析浙江、四川、江西、昆明、湖南、江苏、安徽7个产地的石菖蒲挥发油成分,结果发现不同产地挥发油主要成分均为苯丙素类、单萜类,但不同产地成分含量差异较大,且四川产石菖蒲挥发油含量及细辛醚总量均较高,质量较优
[14]。有研究通过GC⁃MS分析调查市场销售石菖蒲的挥发油成分,共分离出52个特征色谱峰,对其中39个色谱峰进行鉴定,未检测出黄樟醚,且
β⁃细辛醚含量最高可达83.75%
[15]。对湖南产地的石菖蒲挥发油成分进行GC⁃MS分析,湖南产石菖蒲挥发油中鉴定出11个化合物,其主要成分细辛醚含量为57.61%
[6]。综合以上研究,均表明GC⁃MS可对石菖蒲挥发油成分进行精确分析,但对安徽不同地域产石菖蒲研究尚未见报道,且以往研究对石菖蒲挥发油中黄樟醚成分的报道较少,部分研究
[16]表明石菖蒲挥发油中含有少量黄樟醚,黄樟醚主要来自樟科植物,曾作为食品添加剂,但经进一步研究指出,黄樟醚具有一定毒性,为一种弱的致癌剂,应禁止作为添加剂使用。因此,本研究以安徽石菖蒲主产区的皖南山区、大别山区、安庆及芜湖地区的石菖蒲为研究材料,应用GC⁃MS对其主要成分进行分析,对不同地区石菖蒲质量进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
石菖蒲采摘于安徽省石菖蒲主要产区的皖南山区(北纬29°31′~31°,东经116°31′~119°45′)(实验编号:103021)、大别山区(北纬30°10′~32°30′,东经112°40′~117°10′)(实验编号:123021)、安庆(北纬29°47′~31°16′,东经115°45′~117°44′)(实验编号:140523)及芜湖(北纬30°19′~31°34′,东经117°40′~118°44′)(实验编号:151511),晾晒阴干,待其根茎干燥完全后,作为本实验材料。石菖蒲根茎由成都中医药大学教学研究室吴雪茄教授鉴定为天南星科植物石菖蒲的根茎(Acori Tatarinowii Rhzoma)。
1.1.2 实验仪器和主要试剂
实验仪器:Agilent 7890A/5975C型气相色谱⁃质谱联用仪(GC⁃MS)(美国安捷伦公司);色谱柱为DB=35MS石英毛细管柱(0.25 μm×250 μm×30.0 m);MH⁃250型1 000 mL可调式电热套(郑州佰斯特化验仪器设备有限公司);智博联FA1004型万分之一电子天平(天津智博联检测仪器销售有限公司)。
主要试剂:无水硫酸钠(寿光市鼎昊经贸有限公司);β⁃环糊精购置于石药集团欧意药业有限公司(国药准字F20020050,符合《中国药典》2015版相关要求),纯度98%;乙醚(广东翁江化学试剂有限公司)、采用本实验室自有水蒸气蒸馏装置制取蒸馏水。蒸馏水、醋酸乙酯、乙醚等药物均采用分析纯标准。
1.2 方法
1.2.1 实验样品的制备
以2015版《中华人民共和国药典》
[17]中相关挥发油提取方法为参考,结合本实验室自有仪器条件,将安徽皖南山区、大别山区、安庆及芜湖石菖蒲干燥根茎粉碎成粉后过2号筛,用天平称取1.00 g,溶于加有500 mL蒸馏水的电热套中,装入标准挥发油提取器材中,提取4~5 h,采用微量乙醚及0.1 mL精油将析出挥发油反复浸提,提取完毕后用无水硫酸钠脱水过夜,采用0.45 μm口径微孔滤膜缓慢滤过,装入特定试剂瓶中待测,封闭保存。
1.2.2 黄樟醚的检测方法
取安徽皖南山区、大别山区、安庆及芜湖地区石菖蒲挥发油液体1 mL,放入微型容量瓶(10 mL)中,加入适量醋酸乙酯定容至刻度。采用天平精准称量24.3 mg黄樟醚固体,放入微型容量瓶(10 mL)中,加入适量醋酸乙酯定容至10 mL,充分摇匀,后用移液枪吸取已定容溶液0.1 mL,采用相同方式继续定容至所需浓度(0.24 μg/mL)。
1.3 GC⁃MS条件
1.3.1 气相色谱条件
采用石英管毛细管色谱柱,规格为:0.25 mm×30.00 m×0.25 μm,样口温度为250 ℃,接口温度为230 ℃,采用高纯氦气为本次实验载体气体,流速为1.0 mL/min。升温程序为:缓慢升高色谱柱温度至90 ℃,保持此温度1 min左右,其后,以每分钟3 ℃的速率升高柱温至120 ℃,缓慢降低升温速度至每分钟2 ℃,继续升高温度至140 ℃,保持此温度3 min左右,升高升温速度至每分钟5 ℃,使温度升高至190 ℃,最后采用每分钟10 ℃的速率升高柱温至260 ℃,稳定此温度2 min,样品分流比40∶1,每次进样量为1.0 μL。
1.3.2 质谱条件
采用MS:EI源,能量为70 eV,扫描范围:荷质比(m/z)为60~350 amu,全扫描方式,NIST11质谱库。
1.3.3 石菖蒲挥发油中黄樟醚的气相测定
仪器:岛津GC⁃5A;载体:gas Chromosorb Q;毛细管柱:1 m×0.3 cm;固定液:1% OV⁃17;检出温度200 ℃。气流条件:载气流量45 mL/min,空气流量600 mL/min,氢气流量40 mL/min,氢火焰离子检出器;灵敏度0.2 mV/(mg/cm3);进样量1 μL。
2 结果与分析
2.1 不同地区石菖蒲挥发油GC⁃MS分析
对安徽不同地区石菖蒲挥发油分析得各地区样品总离子流色谱图(TIC),由
图1可知,不同地区挥发油色谱峰均较多且丰度较大。
2.2 不同地区石菖蒲挥发油的化学成分分析
对不同地区TIC图进行质谱扫面后得到成分质谱扫描结果,经美国国家标准与技术研究所(national institute of standards and technology, NIST)标准质谱图及标准图谱有关资料对照,皖南山区、大别山区、安庆及芜湖4个地区分别鉴定出45、52、48、54个化合物,4个地区共有的化合物为25个,并利用面积归一化法以及通过与NIST标准质谱图及标准图谱有关资料对比,确定各个成分的相对含量,结果见
表1。不同产地化合物种类差异较大,大别山区产石菖蒲鉴定出特有化合物菖蒲酮、菖蒲醇等,皖南山区产石菖蒲则发现苯甲醛、草蒲酮等特征性化合物,安庆地区鉴定出去羟异水菖蒲二醇、二氢沉香呋喃等化合物,芜湖地区发现存在绿叶烯、斯巴醇等特征性化合物,具体化合物见
表2。
由
表2可知,大别山区、皖南山区、安庆及芜湖已鉴定的25个共有化学成分占石菖蒲挥发油总量分别为93.27%、84.75%、90.73%、92.84%。4个地区石菖蒲挥发油中主要成分均为单萜氧化物、倍半萜氧化物、苯丙素类衍生物以及脂肪族醛酮类化合物,值得注意的是,安徽产石菖蒲含有特有的五种化合物,分别为
β⁃榄香烯、隐绿原酸、
α⁃柏木烯、丹香酚和异喇叭烯。4个地区石菖蒲挥发油中含量超过1.00%的组分为甲基异丁香酚、异丁香酚甲醚、
β⁃细辛醚、
α⁃细辛醚。对四种成分总量占挥发油总量进行统计发现,大别山区、皖南山区、安庆及芜湖地区四种成分总和分别占挥发油总量的91.86%、83.74%、89.55%、91.56%。
β⁃细辛醚和
α⁃细辛醚和榄香素互为同分异构体(分子式C
12H
16O
3,分子量208.1),大别山区、皖南山区、安庆及芜湖地区这三种成分总量分别占其挥发油总量的87.18%、80.41%、85.60%、86.53%,大别山区的占比显著高于其他3个地区的占比(
P<0.05)。其中含量最高的是
β⁃细辛醚,占比依次为54.73%、50.12%、57.24、60.15%,芜湖地区的占比最高,与其他三地的占比存在显著性差异(
P<0.05),其次是
α⁃细辛醚,占比依次为32.18%、30.14%、28.15%、26.15%大别山地区的占比最高,与其他三地的占比存在显著性差异(
P<0.05)。
2.3 不同地区石菖蒲挥发油黄樟醚含量
4个地区石菖蒲挥发油均未检测出黄樟醚。
3 讨 论
4个地区的石菖蒲挥发油中不同成分虽存在较大差异,但大部分成分含量相对较低,其中仅
α⁃细辛醚,
β⁃细辛醚,异丁香酚甲醚和甲基丁香酚四种成分占比较高。因此,对安徽不同地区石菖蒲质量评价应以
α⁃细辛醚、
β⁃细辛醚、异丁香酚甲醚和甲基丁香酚含量为参考指标。4个地区石菖蒲挥发油中
β⁃细辛醚含量均高于50%,含量最高为芜湖地区石菖蒲60.15%;4个地区石菖蒲挥发油中
α⁃细辛醚含量均高于20%,含量最高的为大别山地区石菖蒲32.18%,以往有研究报道石菖蒲中
β⁃细辛醚含量约占挥发油总量的63.25%~81.21%
[18],本研究与其有一定差距,可能与安徽省4个石菖蒲产地的海拔和地形不同造成的环境气候不同有关,但本研究结果与苗静琨
[19]等的研究观点一致,分析可能由于本次实验和苗静琨等研究的石菖蒲产地的海拔和地形差异等形成的环境因素影响了石菖蒲挥发油中各组分的含量,具体原因还有待探究。此外,本研究发现4个地区石菖蒲均不含黄樟醚,表明安徽地区石菖蒲安全性均较为优异。
对比以往相关报道
[20~22],本实验发现与其他地区不同,唯安徽产石菖蒲特有的化合物:
β⁃榄香烯、隐绿原酸、
α⁃柏木烯、丹香酚和异喇叭烯。其中,
β⁃榄香烯有研究
[23]证实其有促进细胞凋亡的作用,还可调控相关癌细胞基因表达、影响癌细胞内相关酶活性、抑制癌症细胞迁移及侵袭。此外,还可诱导细胞自噬性表达。隐绿原酸则有研究
[24]发现其有一定抗菌、抗病毒、抑制细胞突变及抗肿瘤作用。新成分的发现可对相关石菖蒲药理活性研究提供一定参考。
综上,安徽不同地区石菖蒲均不含黄樟醚,安全性较高,综合分析四种主要功效成分,大别山区石菖蒲最为优质。