萝芙木的保育研究

Study on the conservation of Rauvolfia

摘要

萝芙木属（Rauvolfia Linn.）植物富含的单萜吲哚类生物碱在降压、抗心律失常、抗肿瘤等方面都有重要的药用价值。为缓解野生萝芙木资源濒危的状况，萝芙木的保育需要同时满足资源量和药用质量两种需求。对萝芙木保育的种子繁殖、扦插繁殖、组织培养、栽培管理、收获部位及药用质量评价进行了综述，着重梳理了建立萝芙木离体再生体系的最优组培条件和毛状根诱导及生产利血平等生物碱的研究进展，指出了目前萝芙木保育中存在的问题和未来的研究方向。

Abstract

The plants of genus Rauvolfia Linn. are rich in monoterpene indole alkaloids which have valuable antihypertensive， antiarrhythmic， antitumor properties. In order to alleviate the endangered situation of wild Rauvolfia， conservation of Rauvolfia needs the satisfaction of both resource quantity and medicinal quality. In this paper， the conservation of Rauvolfia， including its multiple propagation methods by seeding， cutting and tissue culture， cultivation management， the harvesting parts and medicinal quality evaluation is reviewed. The research progress of optimal tissue culture conditions for in vitro regeneration system， the induction of hairy root and the production for reserpine alkaloids are emphatically elaborated. The problems existed in the conservation of Rauvolfia and the future research directions are also discussed.

关键词

萝芙木 / 组织培养 / 毛状根 / 繁殖 / 栽培

Key words

Rauvolfia / tissue culture / hairy root / propagation / cultivation

0 引 言

萝芙木属（Rauvolfia Linn.）植物在降压、抗心律失常、抗肿瘤等方面具有重要的药用价值，有广阔的市场发展前景。对萝芙木的研究，国外以蛇根木〔R. serpentina（Linn.）Benth. ex Kurz〕和催吐萝芙木（R. vomitoria Afzel.）为主，国内则以云南萝芙木（R. yunnanensis Tsiang）、红果萝芙木〔R. verticillata （Lour.） Baill. var. rubrocarpa Tsiang〕和海南萝芙木〔R. verticillata （Lour.） Baill. var. hainanensis Tsiang〕为主^［1，2］。

蛇根木是《濒危动植物种国际贸易公约（CITES）》附录II的30种（类）药用植物之一，而国内的野生萝芙木资源也由于自然繁殖率低、生态环境破坏、过度利用等因素渐趋濒危；同时萝芙木的价格也在不断攀升，2016-2017年间萝芙木的市场统货价格在每公斤7~9元，而2020年已达每公斤24元左右。这些现况都迫切要求开展萝芙木人工繁育的保育技术研究。国外尤其是印度，因其是蛇根木的主要原产地，用药历史悠久，对蛇根木的生长习性、常规的种子和扦插繁殖、体外组织培养、人工合成种子等保育技术研究得比较系统^［3~6］；而中国从1950年才开始从国外引种和搜寻国内的野生萝芙木资源，且国产萝芙木属的物种与国外的优势种也不一样，故对国产萝芙木进行保育研究尤为必要。

中国对萝芙木的保育研究始于二十世纪五六十年代，在云南、广东、广西、海南等地搜集到不同种质资源的萝芙木（云南萝芙木、红果萝芙木和海南萝芙木）进行人工栽培种植。萝芙木的保育需要同时满足资源量和药用质量两种需求。本文对萝芙木保育的种子繁殖、扦插繁殖、组织培养、栽培管理、收获部位及药用质量评价进行了综述，以促进中国萝芙木的资源保存和可持续发展。

1 萝芙木的繁殖方法

1.1 种子繁殖

自然情况下萝芙木种子繁殖率低，主要的原因有三：一是萝芙木可孤雌生殖，种子空瘪率高，甚至高达90%；二是种子萌发率低（10%~40%），且种子发芽至出苗时间长（1~3个月），期间易受不良环境的影响；三是种子含萌发抑制物，有休眠特性，需要用GA₃处理、温水浸泡、湿沙层积、变温处理等措施打破种子的休眠并促进其萌发。

根据萝芙木种子的上述特性，为提高种子出苗率，播种前先对种子进行筛选，用6%的盐水选种可去掉漂浮的空瘪种子；播种时用湿沙层积催芽，一般一个月种子开始露白，大部分种子露白后即可播种。萝芙木的整地做畦应选择土层深厚、土质疏松肥沃、排灌良好，有遮阴设施的地块做育苗地，翻耕打碎，起畦宽80~100 cm，高约20 cm，畦长视地形而定，施入适量腐熟农家肥与畦面土拌匀、耙平；在畦面上以行距15 cm开沟，把种子均匀播入沟中，覆土2~3 cm，浇水，保持畦面湿润，盖好遮阴网；如气温较低，可用塑料薄膜覆盖保温。

经处理的种子，萝芙木发芽率较高，出苗较整齐，而且实生苗长势较旺盛，茎粗、根粗和根长均超过扦插苗，产量明显高于扦插苗^［7］。

1.2 扦插繁殖

常用的萝芙木扦插繁殖材料是茎而不是根，因为相比茎而言，根更难以获取而且根的萌芽能力也较差。萝芙木茎扦插繁殖成功的关键在于提高生根成活率，而穗条的选择、穗条保留节间数、激素处理、扦插季节等因素都会影响扦插生根。

生产上穗条一般选1~2年生健壮枝条，将枝条剪成长约15~20 cm、带2~5节的插条，上端剪平，下端剪成斜面；在沙床上按行距15 cm开沟，沟深15 cm，以株距5 cm斜摆放插条，覆沙，淋透水；扦插后15~50 d开始生根，30~90 d为生根高峰期。

生长素影响萝芙木的扦插生根率。100 mg/L α⁃萘乙酸（α⁃naphthalene acetic acid，NAA）浸泡处理4 h的插条，发根快，发根数是对照组的2倍，且根长比对照组长；但NAA浓度达到500 mg/L时处理的插条，生根反而受到抑制^［8］。研究还发现，生长素处理的同时，选择合适的穗条直径和穗条保留节间数也有利于提高萝芙木的扦插生根。如云南萝芙木的穗条直径在0.3~2 cm时生根率和一级生根数与穗条直径呈正相关^［9］；穗条节数保留2个节间并用0.75 g/L吲哚丁酸（indole⁃3⁃butyric acid，IBA）处理穗条可使云南萝芙木的扦插生根率达66.7%^［10］。季节也影响萝芙木的扦插生根，如云南萝芙木在春季（2月）和秋季（10月）扦插的生根成活率要高于夏季（6月）和冬季（12月）。

总之，扦插繁殖生根数量多，有利于培育壮苗，可提早出圃，在生产上可节约成本，提高土地利用率。

1.3 组织培养

组织培养具有繁殖率高，繁殖速度快，后代性状整齐，不受季节和地域限制等优点，故组织培养也是用来生产萝芙木优质种苗的一种方式。常用的萝芙木组织培养方式有三种：直接器官发生途径、间接器官发生途径和体细胞胚发生途径。直接器官发生途径是外植体直接分化出芽或根等器官后再生成植株，间接器官发生途径是外植体先脱分化为愈伤组织然后愈伤组织再经诱导分化再生成植株，而体细胞胚发生途径是经外植体或愈伤组织诱导产生体细胞胚结构后再生成植株。已有的研究主要是围绕通过各种培养条件的选择，诸如合适的外植体、培养基、温度、湿度、光照、植物激素种类与配比等，建立萝芙木的优化离体再生体系^{［3~6， 11］}（表1）。

萝芙木的组织培养还包括通过体细胞胚诱导出胚状体再制成人工种子，可用于种质繁育保存等目的。人工合成种子主要是对诸如茎尖生组织、体细胞胚等幼嫩或分生能力强的部位进行包被，包被材料的选择（人工种皮）和人工合成种子的培养（有的用人工胚乳提供营养）是关键^{［3， 12，13］}。其中，包被材料可选择胚乳、3%海藻酸钠或75~100 mmol/L CaCl₂；合成种子再生为植株，先用高比例的N⁶⁃苄基腺嘌呤（N⁶⁃enzyladenine，BA）与NAA培养出芽苗，然后再用吲哚乙酸（indole⁃3⁃acetic acid，IAA）或IBA生根；合成种子的贮存可在4 °C保存4周或在25 °C保存30天^{［3，12，13］}。萝芙木人工种子的研制较为困难，国内尚未见报道。

萝芙木的组织培养也常与多倍体诱导相结合培育种苗。萝芙木的多倍体诱导可用化学诱导和物理诱导，常用的化学诱导方法是将茎尖用0.5%秋水仙素处理48 h得到萝芙木的同源四倍体然后经组织培养扩繁生根成苗^［3］，但经物理辐射得到萝芙木多倍体的方法还未见报道。

在萝芙木的组织培养中，毛状根的诱导培养是其中关注和探讨较多的研究领域。毛状根培养的流程如下：选择合适的外植体和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株、活化农杆菌（根据菌液OD₆₀₀值确定活化程度）侵染外植体、二者共培养诱导产生毛状根、除去毛状根上残余的农杆菌后挑选毛状根继代培养、毛状根的筛选（根据表型选择，条数多长势旺的为好）和鉴定（在毛状根中鉴定到农杆菌的rol基因表明其已整合到植物基因组内）。

毛状根培养的目的有两方面：一是诱导再生植株，既可快繁种苗从而进行种质资源的改良与繁育，也可产生转基因植株从而解析和验证基因功能；二是产生次生代谢产物或重组蛋白，实现目标产物的大量富集^［14~17］。

对于萝芙木的保育来说，通过毛状根再生成植株培育种苗是一个很好的途径，研究已经证明毛状根再生的转基因植株能够保持正常的生长和遗传稳定性。菌株的选择影响了毛状根的转化频率，毛状根转化频率由高到低的发根农杆菌菌株为：A4（33%）、LBA 9402（26%）、SV2（18%）、SV4（12%）、ATCC 15834（11%）^［18］。毛状根已实现在实验室内的规模化生产，在配置有机械搅动装置的生物反应器（5 L）中培养毛状根11周得到的利血平含量高达0.045%（DW），预示了未来进行工业化生产的可能性^［18］。

通过构建萝芙木毛状根遗传转化体系解析和验证基因功能的研究，重点还是侧重于萜类吲哚生物碱合成途径中相关基因的改变对生物碱含量的影响。相关的研究如：将长春花异胡豆苷合成酶基因构建到含CaMV35S启动子的双价载体上，通过A4发根农杆菌侵染获得萝芙木转基因毛状根，该基因超表达的毛状根中利血平含量可达干重的1.367%^［19］；长春花的色氨酸脱羧酶在蛇根木毛状根中的异源表达提高了利血平和阿马里新（ajmalicine）生物碱的含量^［18］；这方面的研究随着对萝芙木生物碱合成途径认识的加深而不断扩展。

利用萝芙木毛状根培养生产生物碱的研究，多侧重于筛选合适的诱导子提高目标产物的含量。相关的研究如：诱导子为0.15 mmol/L CdCl₂，根中利血平含量达0.191 mg/g DW，愈伤诱导产生的萝芙木叶中阿马里新含量达0.131 mg/g DW^［20］；生物胁迫的诱导子为100 mg/L甘露糖时，阿吗灵含量增加2.9倍；非生物胁迫的诱导子为100 mmol/L NaCl时，阿马里新含量增加14.8倍^［21］。总之，实现目标产物的大量富集，是萝芙木毛状根培养的重点研究领域。

2 萝芙木的栽培管理

萝芙木的适宜种植密度为50 cm × 50 cm或40 cm × 100 cm，全株亩产量可达1 000~1 385.9 kg。光强是主要的影响因子，以50%~70%的自然光强为佳，此时萝芙木根部的生物碱含量较高。

对萝芙木配方施肥的研究表明：氮磷钾肥混施或磷钾肥混施的萝芙木根部生物碱含量及产量均比不施肥的处理要高^［22］；氮肥比钾肥和磷肥的增产效应更显著，最适施肥组合为腐熟猪粪12 000 kg/hm² +纯氮（N）150 kg/hm² +钾（K₂O）60 kg/hm^2［23］；在干季收获期前少量施用氮肥可获得最大根产量^［24］。其他的管理措施，如摘除部分花蕾可降低终年开花造成的养分消耗从而提高萝芙木根的产量和生物碱含量。

萝芙木生长时遇到的较严重的虫害是褐软蚧、朱砂叶螨，较严重的病害是煤烟病、根结线虫病；2008年研究人员还在蛇根木中首次发现了黄瓜花叶病毒^［25］（cucumber mosaic virus，CMV）。可以通过及时摘除销毁病叶、进行药剂防治、选择伴生植物、利用天敌等来有效防治萝芙木的病虫害。

萝芙木也可被种植在橡胶林下进行复合模式的生态种植〔橡胶（Hevea brasiliensis）⁃催吐萝芙木（R. vomitoria）⁃大叶千斤拔（Flemingia macrophylla）或降香黄檀（Dalbergia odorifera）〕^{［26，27］}，这种复合种植模式有利于生态环境的恢复和生物量与经济效益的增加。但是与在野生生境下生长的萝芙木相比，人工栽培的萝芙木药材大都没有明显的主根，可能的原因有：生产上的育苗移栽有可能损伤主根、扦插苗没有胚根无法形成主根。因此，人工栽培萝芙木虽然能够满足野生萝芙木资源量不足的问题，但其药用质量和市场价值可能会有所降低。

3 萝芙木的收获

萝芙木的收获要兼顾生物量和药用质量。通常萝芙木定植2~3年即可采挖，以10月份采收生物碱含量最高而3月份含量最低，采收后置阴凉、干燥、通风、清洁、遮光处保存，且为防止生物碱含量降低保存时间要小于6个月。

3.1 萝芙木的收获部位

萝芙木的收获部位取决于其药用部位。萝芙木的药用部位先前主要用根，后扩展至茎，主要用于提取总生物碱研制降血压和清热解毒的药物，民间也用其鲜叶捣碎来治疗跌打扭伤、毒蛇咬伤等。自1980年代中期开始，由于连年大量采挖造成资源紧缺，制药企业已把药用部位由根扩展到全株，主要基于以下两点：从药用价值看，萝芙木的茎（枝）、叶与根有相同的药理作用，不但在茎（枝）、叶中均检测到了利血平和育亨宾，而且秋季萝芙木叶中生物碱含量甚至要高于根和茎；从生物量分配看，茎的生物量最高，其次是根，而叶最低。因此，在生产上提倡提高萝芙木整株的利用率，增加对茎（枝）、叶的充分利用，以弥补较低的根生物量对产量和品质的影响。因此，根据萝芙木的药用部位，可在收获时进行分级采摘，以满足不同的市场需求。

3.2 萝芙木的药用质量评价

萝芙木的药用价值主要是具有降压、抗心律不齐、抗癌、抗氧化等植物化学活性成分，其中以脂溶性的吲哚类生物碱为主，如利血平类生物碱、育亨宾类生物碱、阿吗灵（ajmaline）类生物碱、萨巴晋（sarpagine）类生物碱等^{［28，29］}，而萝芙木的非吲哚类生物碱有替巴因（thebaine）、罂粟碱（papaverine）等，同时新的有活性的生物碱成分也在不断挖掘中^［30~32］。

萝芙木的药用质量评价通常以生物碱中含量最高的利血平的含量为参考指标，也有同时采用利血平和育亨宾的含量，还有用萝芙木总碱含量作为指标。萝芙木主要化学成分的含量因物种、地域、生长年限、生长部位、采集时间等而有差别。印度25个不同种群蛇根木根中总生物碱含量的变化范围在2.51%~4.82%，利血平的含量在0.040%~0.083%^［33］；而国产萝芙木中，云南不同产地的萝芙木药材（云南萝芙木、催吐萝芙木、蛇根木）根中利血平的含量在0.022%~0.117%，茎中利血平的含量在0.001 2%~0.006 5%，且植株最小的云南萝芙木利血平的含量要低于其余两种^［34］。在云南萝芙木规范化种植操作规程中，以云南萝芙木根的干燥品计算，总生物碱降压灵含量不得少于2%，利血平含量不低于0.1%，育亨宾含量不低于0.06%^［35］。

中药化学成分的药效也受到微量元素形态和含量的影响。用直流电弧光谱仪可从蛇根木的叶片和种子中检测到K、Na、Ca、Fe、Mn、Mg、Si、Ti、Sn、Al等20种元素，这些大量、微量和痕量元素影响了其药用价值^［36］；也有研究者在萝芙木中检测到了9种微量元素，其中含量最高的是Zn和Mn，Mn被认为是萝芙木中的特征元素，而Zn、Cr、Ni以溶解的有机态形式存在，被认为是影响药用功效的因素之一^［37］。总之，在生产上萝芙木的保育除了满足资源量的需求外，还要同时满足药用质量的需求。

4 结 语

萝芙木保育技术的研究从不同的繁殖栽培方法到栽种收获所需的关键技术等各方面已经形成了完整的框架，可根据实际生产的需求选择合适的保育策略。但是也存在诸多问题。目前虽然已经建立了优化的萝芙木离体再生体系，但体细胞胚、多倍体诱导、人工种子还是其中的薄弱环节，也还没有通过优质转基因株系、倍性育种和筛选优良变异等方法培育获得优良的萝芙木种质资源；其他诸如萝芙木组织培养中易发生的内生菌污染、酚类化合物氧化或细胞程序性死亡所致的褐化、组培苗玻璃化、细胞分化和脱分化过程以及继代次数增加造成的遗传变异等问题以及解决办法^{［12，17，38］}还没有具体研究；目前还未能通过萝芙木离体再生体系和人工种子实现工厂化育苗；毛状根培养利血平等药用生物碱也还处在实验室阶段不能进行规模化生产和商业化应用，这些都阻碍了萝芙木保育技术的进展，是今后需要重点关注的研究领域。

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基金资助

广西创新驱动发展专项资金项目“药用植物大数据中心建设”(桂科AA18242040)

广西壮族自治区药用植物园创新团队项目“药用植物种质资源超低温保存技术研究”(桂药创2019011)