利用RAPD分子标记快速鉴定3个奇楠种质

Rapid identification of 3 Chi⁃Nan germplasms by RAPD molecular Markers

摘要

利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA， RAPD）分子标记技术，分析3个奇楠种质（Chi⁃Nan germplasm）亲缘关系，并快速鉴定。通过提取基因组DNA，筛选适用于奇楠种质分析的RAPD引物，PCR扩增获得扩增条带，分析奇楠种质的遗传多样性，并利用人工绘制品种鉴别示意图方法（manual cultivar identification diagram， MCID）将奇楠种质区分开来。从120条RAPD分子标记引物中筛选到10条适合于奇楠种质分析的引物，利用这10条引物发现奇楠种质在物种水平上遗传多样性高，3个奇楠种质不同居群间的遗传一致性高、遗传距离小，在聚类图上各自聚为一支；根据引物S63、S18和S100扩增的多态性谱带构建奇楠种质的MCID，很好地区分了3个奇楠种质。3个奇楠种质均具有特异性强、一致性好、稳定性高的特点，RAPD分子标记技术的MCID可以有效快速地鉴定区分3个奇楠种质。

Abstract

Rapid identification and genetic relationship of 3 Chi⁃Nan germplasms were analyzed by RAPD molecular markers. The genomic DNA was extracted， RAPD primers suitable for Chi⁃Nan germplasm analysis were screened， the amplified bands were obtained by PCR， and the genetic diversity of Chi⁃Nan germplasm was analyzed. Using MCID， 3 Chi⁃Nan germplasms were gradually and completely distinguished by RAPD primers. 10 primers were screened from 120 RAPD molecular marker primers which were suitable for analysis of Chi⁃Nan germplasm. It was found that the genetic diversity of Chi⁃Nan germplasm was high at the species level by these 10 primers. The 3 germplasms showed high genetic consistency and small genetic distance among different populations， and were clustered into one branch respectively in phylogenetic tree. The MCID of Chi⁃Nan germplasm was constructed according to the pleomorphic bands amplified by primers S63， S18 and S100， which could separate 3 Chi⁃Nan germplasms from each other. 3 Chi⁃Nan germplasms have the characteristics of strong specificity， good consistency and high stability. The MCID based on RAPD molecular marker is able to identify and distinguish 3 Chi⁃Nan germplasms efficiently and rapidly.

Graphical abstract

关键词

奇楠种质 / 随机扩增多态性DNA / 人工品种识别图 / 鉴定

Key words

Chi⁃Nan germplasm / RAPD / MCID / identification

0 引 言

沉香是传统珍稀濒危南药，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，可用于治疗腹胀、胃寒、肾虚、气喘等症状^［1］，广泛应用于中成药、 藏药和日本汉方药中^［2］。除药用外，沉香因香气浓郁，也作为定香剂被用于高级香水香料中，深受中国、日本、印度及其他东南亚国家追捧^［3］。沉香是一种含树脂木材，沉香物种来源丰富，全球分布着至少20种可产沉香的沉香属植物^［4］。我国所用沉香可分为国产和进口两种，国产沉香唯一基原植物是瑞香科（Thymelaeaeeae）沉香属（Aquilaria Lam.）植物白木香（Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg）^［1］，进口沉香来源较多，以奇楠沉香最为贵重，但其来源不明。

奇楠是品质优良的沉香，外表油润光滑、香味醇厚、味微苦麻辣清凉。中国产的奇楠沉香以野生采挖为主^［5］，香农在野外采香的过程中发现某些树种经轻微伤害后可以持续地形成奇楠沉香，但这种优良性状很难通过有性繁殖延续。近年来，香农将采挖的野生产奇楠树木进行嫁接扩繁，获得了可稳定遗传的奇楠种质（Chi⁃Nan germplasm），并成功地生产了奇楠沉香，嫁接树种生产的奇楠沉香已开始流通于市场。奇楠种质所产沉香含油量高、品质优良^［6］，但奇楠种质多样，各种质所产沉香间色泽、香味和成份均存在一定差异，如市场上广泛种植与流通的3种奇楠种质（A11、R21和B31）。这3种种质的叶型、果型均存在一定差异，但在区分方面具有主观偏向性，目前缺乏准确、科学、快速的种质区分鉴定方法。

RAPD（random amplified polymorphic DNA）是应用最早最为简易方便的一种DNA标记技术^［7］。能够简便快速地进行植物种质资源遗传评价、品种鉴定以及系谱分析^［8~12］。利用RAPD分子标记的MCID（manual cultivar identification diagram）能够快速鉴定区分葡萄、梅花等品种^［13~15］。鉴于RAPD分子标记简便、快速的优势，本研究通过优化RAPD体系，利用筛选出的10条具有稳定性和多态性的长度为11个碱基的随机引物，对市场广泛种植的A11、R21、B31 这3种奇楠种质进行PCR扩增，以期这3个奇楠种质在分子水平上快速地区分开。

1 材料与方法

1.1 供试材料

3种奇楠种质分别采自定安县龙湖镇基地、定安县龙门镇、澄迈县福山镇、澄迈县文儒镇、海口三门坡镇、海口旧州镇6个奇楠种质种植基地，对照白木香取自海南省海口市中国医学科学院药用植物研究所海南分所。每个奇楠种质随机选取3~5株，每株采集5片幼嫩叶片，共计56份样品，硅胶干燥保存备用。奇楠种质经DNA boarding技术鉴定为白木香（Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg）物种，故以白木香为对照。具体样品信息见表1。

1.2 基因组DNA提取与纯度检测

称取新鲜叶片100 mg，液氮研磨成粉，放入1.5 mL离心管中，按照植物总 DNA 提取试剂盒（OMEGA，中国）说明提取叶片基因组DNA，取5 μL DNA溶液进行琼脂糖（1.5%）凝胶电泳，Nanodrop2000（Thermo，美国）检测DNA浓度和纯度，浓度值要求在20 ng/μL以上，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}在1.8~2.0之间。

1.3 RAPD⁃PCR引物筛选

对120条RAPD随机引物进行筛选，引物由广州艾基生物有限公司合成，经多次PCR扩增后，从中筛选多态性好、扩增谱带清晰的随机引物用于后续遗传多样性分析。根据引物的理论退火温度值T_m，对筛选出来的引物分别设置（T_m ±2） ℃范围内的5个梯度退火温度，进行PCR扩增，1.5%琼脂糖电泳检测PCR反应产物，根据不同退火温度下引物扩增的条带数及清晰度确定最佳退火温度。

1.4 RAPD⁃PCR扩增

以奇楠种质和普通白木香种质DNA为模板，分别用筛选到的RAPD引物进行扩增，PCR反应体系20 μL：DNA模板1 μL，10 μm引物1 μL，2×EcoTaq PCR SuperMix 10 μL，ddH₂O 8 μL，采用梯度PCR仪（Biometra TProfessional，德国）进行梯度PCR，PCR扩增程序：94 ^oC预变性5 min，94 ^oC 30 s，退火温度下40 s，72 ^oC 110 s，循环40次，72 ^oC延伸10 min，15 ^oC保存。取扩增产物10 µL在1.5%琼脂糖进行电泳分析，凝胶成像系统下观察扩增条带并拍照。

1.5 数据统计与分析

统计扩增后多态性条带数及总条带数，标记电泳图谱上的每一条条带，以D2000 Marker条带迁移距离为标准。将所有的位点根据分子标记法标记“有”或“无”，通过二元数据表示，无带的记“0”，有带的记“1”（无论强弱），利用PopGene 32软件进行遗传多样性分析，NTsys 2.1软件的非加权组平均法（unweighted pair⁃group method with arithmetic means， UPGMA）建立聚类树，分析各引物扩增的奇楠种质特征性图谱，构建奇楠MCID图。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

供试材料提取的基因组DNA均较完整，经Nanodrop2000检测，其DNA的OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值为1.8~2.0，DNA质量较高。

2.2 RAPD引物筛选及最佳退火温度确定

对120条随机引物进行筛选，结果显示共有12条引物能在奇楠种质DNA中扩增出条带，并从中挑选出10条扩增清晰、重复性好的多态性条带的引物（S18，S24，S25，S39，S40，S43，S49，S50，S63，S100），用于遗传多样性分析及品种鉴定区分。

PCR技术扩增随机引物过程中，退火温度对扩增条带稳定性具有重要作用^［12］。本研究中对筛选到10条RAPD随机引物进行了退火温度优化（图1），经PCR扩增，各引物在不同退火温度下，扩增条带数和条带清晰度有显著差异，通过不同退火温度下扩增条带的数量和清晰度比较，最终确定各引物的最佳退火温度（表2）。

2.3 奇楠种质遗传多样性分析

运用筛选到的10个RAPD引物在奇楠种质中共扩增出79条清晰可重复的条带（图2），其中71条为多态性条带，多态性位点百分率（PPB）为89.87%（表3）。观察等位基因数（Na）为1.899，有效等位基因数（Ne）为1.534，Nei’s基因多样性指数（He）为0.307，Shannon多样性指数（I）为0.458；在居群水平上，PPB平均值为18.30%，Na为1.183，Ne为1.140，He为0.077，I为0.110，均低于物种水平值。说明奇楠种质物种水平遗传多样性比居群水平高。

从表3可以看出，在居群水平上，除R21⁃CM外，其他11个居群的PPB、Na、He和I普遍低于CK⁃YZS。R21⁃CM居群的PPB和Na值略高于CK⁃YZS，但Ne、He和I均低于CK⁃YZS，可见奇楠种质居群内RAPD条带多态性丰富度低于白木香，遗传多样性水平低。对比3个奇楠种质居群内遗传多样性，发现R21⁃CM居群的PPB、Na、Ne、He和I最高，说明其遗传多样性最高；B31⁃DA⁃F1的PPB、Na、He和I最低，说明其遗传多样性最低。

对白木香奇楠种质居群间和居群内的遗传变异及基因流分析显示，13个居群间总的遗传多样性（Ht）为0.308，居群内的遗传多样性（Hs）为0.077，根据Ht和Hs计算不同居群间的遗传分化系数Gst为0.751，即总的遗传变异中有75.14%的变异存在于居群间，24.86%的变异存在于居群内，说明奇楠种质居群内和居群间都存在一定的遗传变异，但居群间遗传变异远大于居群内。居群间个体的基因流系数（Nm）为0.166，表明居群间基因流动性水平较低。

2.4 遗传距离与聚类分析

遗传一致性和遗传距离可以反映群体间遗传亲缘关系，13个居群间的遗传距离与遗传一致性见表4，同一奇楠种质不同居群的遗传一致性均在0.85以上，遗传一致性高，遗传距离低，尤其是在F1和F2之间遗传一致性均在0.90以上，说明奇楠种质遗传稳定性较高。从表4看出，不同种质间遗传距离较大，遗传一致性低，如A11⁃DA⁃F1与B31⁃DA⁃F1的遗传距离为0.552，与R21⁃DA⁃F1的遗传距离为0.397。

根据遗传一致性，运用UPGMA方法聚类分析，如图3显示3个奇楠种质可明显聚类为三大支，同一种质的不同居群聚类在一起，明显与CK⁃YZS居群分离，说明3个奇楠种质特异性和一致性较高，在相似系数为0.782时，B31和R21聚在一起，A11与CK⁃YZS在相似系数为0.737时聚为一支，说明B31和R21亲缘关系较近，而A11和对照白木香亲缘关系较近。

2.5 3个奇楠种质MCID图绘制

利用筛选到的10个RAPD引物，区分鉴别3个奇楠种质，首先根据引物S40扩增的3个奇楠种质和1个对照普通白木香种质的DNA指纹图谱上大小为2 500 bp的特征性普带的有无将4个品种分成2组，其中有特征性谱带的用（+）表示，无特征性谱带的用（-）表示。第一组2 500 bp（-），包括A11和CK⁃YZS二种种质，第二组为2 500 bp（+），包括B31和R21二种种质（图4）。再进一步利用引物S18和S100鉴定以上2组所有种质，根据S18扩增的490 bp谱带有无可鉴定A11和CK⁃YZS（图2），而S100扩增的1 400 bp普带有无可以用于R21和B31二种种质的区分鉴定（图4）。根据DNA扩增图谱构建3个奇楠种质的MCID图（图5），快速科学地将3个奇楠种质逐一单独区分鉴别出来。

3 讨 论

本文利用RAPD分子标记技术对市场上广泛种植的3个奇楠种质进行了遗传多样性及亲缘关系分析，发现奇楠种质在物种水平上遗传多样性高，遗传分化程度也较高。经遗传距离和聚类分析，证实了A11、R21和B31这3种奇楠种质具有特异性强、一致性好、稳定性高的特点，与ISSR分子标记鉴定结果相一致^［15］，较符合林木品种审定的要求。

同时本研究基于RAPD分子标记的MCID法成功地鉴定区分了A11、R21和B31这3个市场上广泛种植的奇楠种质。MCID方法可以将DNA指纹信息转化为实用性强的鉴定大量品种资源的有效信息并利用尽可能少的引物进行PCR扩增将大量的品种鉴定开来^［9~14］。本研究仅利用筛选到的3个RAPD引物简便快速地区分开3个奇楠种质和1个普通白木香种质（图5），说明此方法可以快速的鉴定奇楠种质，奇楠种质MCID鉴定的品种范围可以随着后续鉴定品种的增加而扩大，有效实现所有搜集到的奇楠种质资源鉴定区分。本研究为奇楠种质鉴定提供新的信息资源，而且还为指导实际生产提供依据。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2018YFC1706400)

中央高校基本科研业务费(3332019086)

国家现代农业产业技术体系

海南省重点研发计划项目(ZDYF2020163)