不同基原的中药材溪黄草的安全性评价

Safety evaluation of Chinese herbal medicine Xihuangcao with different origins

摘要

为了评价中药材溪黄草的三种基原——线纹香茶菜〔Rabdosia lophanthoides（Buch.⁃Ham.ex D.Don） Hara〕、纤花（细花）线纹香茶菜〔Rabdosia lophanthoides var. graciliflora （Benth.） Hara〕与溪黄草〔Rabdosia serra （Maxim.） Hara〕的安全性，采用SPF级昆明种（KM）小鼠分别灌服以上三种植物的提取物，对其急性毒性进行评价。三种植物提取物的最大给药剂量为每天每公斤300 g生药（约为临床人拟用剂量的1 154倍），随后连续观察14 d。结果显示，线纹香茶菜、纤花（细花）线纹香茶菜与溪黄草对小鼠体重、摄食量均无明显影响，给药组至试验结束时小鼠无死亡或明显的毒性反应。实验结果提示中药材溪黄草3种基原植物的安全性良好。

Abstract

To investigate the safety of Rabdosia lophanthoides （Buch.⁃Ham.ex D.Don） Hara， Rabdosia lophanthoides var. graciliflora （Benth.） Hara and Rabdosia serra （Maxim.） Hara， the extracts of the above three plants were perfused to SPF Kunming mice to evaluate the acute toxicity. The maximum dosage of three plant extracts was 300 g crude drug per kg （1 154 times of the clinical dose）， then the mice were observed for 14 days. The results showed that the three plant extracts had significant effect on the body weight and food intake of the mice. There was no death or obvious toxicity effect in the herbal extract treated group during the experiment. This study reveals that three original plants of Chinese herbal medicine Xihuangcao are safe.

Graphical abstract

关键词

线纹香茶菜 / 纤花线纹香茶菜 / 溪黄草 / 急性毒性 / 安全性

Key words

Rabdosia lophanthoides （Buch.⁃Ham.ex D.Don） Hara / Rabdosia lophanthoides var. graciliflora （Benth.） Hara / Rabdosia serra （Maxim.） Hara / acute toxicity / safety

0 引 言

中药材溪黄草为民间习用草药，药用部位为干燥地上部分，清热利湿，常用于治疗急性胆囊炎，急性黄疸型肝炎，湿热泻痢等疾病，因喜生溪边，叶片揉搓有黄汁而得名，主产于长江以南的多个省份，在江西、广东、福建等地有种植，为中成药“消炎利胆片”的原料之一^［1~4］。目前，《中国药典》2020年版四部附录内所收载溪黄草药材的基原是溪黄草〔Isodon serra （Maxim.） Kudo〕，又写作Rabdosia serra（Maxim.） Hara；线纹香茶菜〔Isodon striatus （Benth.） Kudo〕，又写作Rabdosia lophanthoides（Buch.⁃Ham.ex D.Don） Hara^［5］；同时，在《广东省中药材标准》第二册^［6］中，所收载中药材溪黄草的基原除了上述两种，还有线纹香茶菜的变种纤花线纹香茶菜（又名：细花香茶菜）〔R.lophanthoides var.graciliflora （Benth.） Hara〕。溪黄草（R. serra）和线纹香茶菜（R. lophanthoides）为唇形科（Labiatae）香茶菜属（Rabdosia）下两个不同的种；线纹香茶菜和纤花（细花）线纹香茶菜的主要化学成分为苯丙素类化合物和松香烷（abietane）型二萜类化合物，溪黄草的主要化学成分为贝壳杉烷（kaurane）型二萜类化合物^［7~11］；另外，通过分子生物方法进行归类鉴别，线纹香茶菜、纤花（细花）线纹香茶菜可归为一类，溪黄草单独归为一类^［12~13］。因此，三者化学成分、市场价格、生药学特征等方面都有差异，是否能等同使用值得深入探讨。目前，三种基原植物均作为中药材溪黄草使用，本研究考察了三种基原植物的急性毒性，为其能否等同使用从安全性角度提供佐证。

1 材料

1.1 动物

SPF级昆明种（KM）小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（粤）2013⁃0020，经适应喂养，体重19~22 g。

1.2 试药

线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草由华南植物园叶华谷教授鉴定。上述三种植物的提取物由广州白云山和记黄埔中药有限公司根据《中国药典》2020版一部“消炎利胆片”项下^［14］所记载溪黄草提取工艺制得，颜色较深，闻之微苦。4 ℃保存，易沉淀，用之前需要加热混匀。

1.3 试剂与仪器

纯净水、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；LT320分析天平（常熟天量仪器有限公司）。

2 方法

2.1 试验设计的依据

2.1.1 临床拟用方法与剂量

依据文献中的有关规定^［15~17］设计本实验方法：参照中药材溪黄草制剂——消炎利胆片的口服剂量，折算成临床拟用剂量为每人每天15.6 g生药，成人体重按60 kg计算，则中药材溪黄草人临床服用量为每日每公斤0.26 g生药。

2.1.2 预实验结果

KM小鼠18只（体重18~22 g），SPF级，雌雄各半。24 h内3次灌胃给药，给药间隔4~5 h，给药（生药）浓度5 g/mL，给药容量20 mL/kg。小鼠灌胃后1 min精神状态较差，呼吸急促，3 min后逐渐恢复正常，1 h后无任何中毒症状。全部小鼠观察2 d，活动正常，精神状态较好。持续观察一周。考虑到药物的最大浓度和小鼠最大灌胃容量，预实验中小鼠最大给药量：5 g/mL×20 mL/kg×3=300 g生药/kg，约为临床拟用剂量的1 154倍。

2.2 剂量设计及分组

线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草毒性较低，无法用小鼠测出LD₅₀，故其急性毒性试验采取最大给药量方法。最大给药量指单次或24小时内多次（2~3次）给药所采用的最大给药剂量。最大给药量试验是指在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量给予实验动物，观察动物出现的反应。同时，考虑到在线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草提取物预配制过程中，既保证所配溶液均匀又使灌胃针能够抽取的最高浓度为5 g/mL流膏，本试验采取方法是：24 h内3次灌胃给药，给药浓度为5 g生药/mL流膏，给药容积为20 mL/kg（中药、天然药物急性毒性技术指导原则中对小鼠每次经口给药的最大给药容量），小鼠最大给药量：5 g/mL×20 mL/kg×3=300 g/kg，两次给药间隔4~5 h。

将检疫合格的48只小鼠（雌雄各半）按性别及体重随机分为溶媒（蒸馏水）对照组、线纹香茶菜组、纤花线纹香茶菜组、溪黄草组，每组12只，雌雄各6只，每组动物按照组名和性别进行编号。

2.3 供试品的配制

准确量取一定体积的三种不同基原的中药材溪黄草提取物，用蒸馏水配成5 g/mL药液。线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草药液24 h内3次给药，每次使用前配制，配制后常温保存。

2.4 给药途径和方法

经口给药；给药前禁食不禁水12 h，灌胃给药，给药顺序为先溶媒对照组，后给药组；24 h内3次给药，两次给药间隔4 h。

2.5 试验观察及测量

2.5.1 一般观察

测量小鼠体重，观察小鼠外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等，小鼠死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、出现的症状、症状起始的时间、严重程度、持续时间。每次药后4 h观察，每天上下午各观察一次，连续观察14 d（给药当天为D₀，之后观察D₁~D₁₄）。在第0、1、7、14 d记录体重，在第1、7、14 d记录摄食量。

2.5.2 病理学观察

中毒死亡小鼠和频死小鼠死亡后及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。

2.6 统计分析

2.6.1 体重

雌雄分开进行统计，以均数加减标准差表示（\overline{x}\pm s），并绘制体重增长曲线。使用SPSS统计软件。对于符合正态分布检验和方差齐性检验，则进行各组间的单因素方差分析和多重比较（SNK⁃q检验），不符合正态分布检验和方差齐性检验，则进行Kruskal⁃Wallis秩和检验。

2.6.2 摄食量

每笼鼠6只，每天每笼小鼠每10 g体重的食物消耗量（g），计算公式：摄食量（g·（10 g）^-1·d^-1）=（加料量-剩余量）（g）/每笼鼠总体重（g）×10。

3 结 果

3.1 一般临床观察

给药组36只小鼠（雌♀雄♂各18只）中毒症状一般出现在每次灌服线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草药液后约1 min到15 min。纤花线纹香茶菜组♀3号和♂2号小鼠在第1次灌胃给药后出现呼吸急促、少动症状；线纹香茶菜和溪黄草组动物在第2次灌胃给药后出现呼吸急促、自主活动减少；溪黄草♂4号小鼠在第3次灌胃给药后出现少动症状，以上症状持续时间从1~2 min。由试验开始至第3次灌胃给药后4 h，累计有6只小鼠共出现6次上述症状，分析原因可能与小鼠灌服高浓度大剂量的药液有关。给药组其他小鼠由试验开始至第3次灌胃给药后4 h未见明显中毒症状。给药组36只小鼠至试验结束无死亡，从D₁~D₁₄每天上、下午各观察1次；存活小鼠全部无异常。

3.2 体重、摄食量结果

给药组的摄食量变化与溶媒组相比无明显异常（见表1）。

给药组雌性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄的体重与溶媒组的体重相比，差异无显著性（P>0.05）；给药组雄性小鼠在D₁₄与溶媒组比较体重略有增加，差异有显著性（P<0.05），在D₀、D₁、D₇与溶媒组比较，差异无显著性（P>0.05）；

给药组雄性小鼠在D₁₄与溶媒组比较体重增加，差异有显著性（P<0.05），但在D₁₄摄食量与溶媒组比较，差异无显著性（P>0.05）；同理，给药组雌性小鼠在D₇与溶媒组比较摄食量增加，差异有显著性（P<0.05），但体重在D₇与溶媒组比较，差异无显著性（P>0.05）；体重变化趋势与摄食量变化趋势无相关性，提示与药物毒性作用无关。结果见表1、表2。

3.3 病理检查

小鼠在观察期结束时采取安乐死方式处死，随后解剖，整体观察结果如下：

给药组动物体表基本完整、被毛柔顺、无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔、胸腔无积水，脏器位置正常；各组织器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

病理检测结果由图1可见，溶媒组肝小叶中中央静脉和周围由肝细胞呈束状排列成的肝板结构，肝窦中可见内皮细胞和枯否氏细胞；线纹香茶菜组在肝小叶中可见中央静脉，肝小叶中肝细胞呈气球样变性，肝小叶结构完整；纤花线纹香茶菜组在肝小叶中可见中央静脉和周围的肝板结构，肝细胞有些肿胀，染色淡染。肝小叶结构完整；溪黄草组的肝小叶中可见点状坏死区域偶见气球样变性，肝细胞呈轻微的肿胀，其他病变不明显，肝小叶结构完整。肝脏病理检查未发现明显的组织病变，部分气球样肿胀变性可能是由于固定脏器较多，未完全固定造成。结合解剖时观察动物的脏器未出现明显病变。因此本实验未发现明显毒性反应。

4 讨 论

在本实验条件下，对KM小鼠24 h内3次灌胃给予线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草，累积最大灌胃剂量为每公斤300 g生药，为临床人拟用剂量的1 154倍；该剂量并未引起动物出现明显的毒性反应。在随后的14 d观察期内线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草对小鼠体重、摄食量的整体影响不大，无小鼠出现死亡。给药组小鼠观察期结束时按计划处死，大体解剖肉眼观察各组织器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。本次实验结果提示线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜与溪黄草三种基原植物的安全性良好。

参考文献

[1] 湖南省卫生厅. 湖南省中药材标准 [S].长沙: 湖南科技出版社,1993: 353.

[2] Department of Health, Province Hunan. Standards for Chinese medicinal materials in Hunan Province [S]. Changsha: Hunan Science and Technology Press,1993: 353.

[3] 广西壮族自治区卫生厅. 广西中药材标准(第二册) [S].南宁: 广西科技出版社,1996: 279.

[4] Guangxi Zhuang Autonomous Region Department of Health. Guangxi Traditional Chinese Medicine Standards (Volume II) [S].Nanning: Guangxi Science and Technology Press, 1996: 279.

[5] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(上册)[M].北京:人民卫生出版社,1978: 860.

[6] National compilation group of Chinese Herbal Medicine. National compilation of Chinese herbal medicine (Volume I) [M]. Beijing: People’s Health Press, 1978: 860.

[7] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海: 上海人民出版社,1977: 2511.

[8] Jiangsu New Medical College.Chinese Medicine Dictionary (Volume II) [M].Shanghai: Shanghai People’s Publishing House, 1977: 2511.

[9] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(第四部) [S]. 北京: 中国医药科技出版社,2020: 558.

[10] National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (Volume Ⅳ) [S].Beijing: China Pharmaceutical Science and Technology Press, 2020: 558.

[11] 广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准(第二册) [S].广州: 广东科技出版社,2011: 347⁃353.

[12] Guangdong Food and Drug Administration. Guangdong Traditional Chinese Medicine Standards (Volume II) [S].Guangzhou: Guangdong Science and Technology Press May, 2011: 347⁃353.

[13] 梁耀光,徐新亚,谢海辉,等.细花线纹香茶菜的化学成分研究[J].热带亚热带植物学报, 2010, 18: 564⁃568.

[14] Liang Y G, Xu X Y, Xie H H,et al. Chemical constituents from Isodon lophanthoides var. graciliflora [J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany,2010: 18,564⁃568.

[15] 郑琴, 崔炯谟, 傅宏征. 溪黄草的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(16): 2203⁃2206.

[16] Zheng Q, Cui J M, Fu H Z. Studies on chemical constituents of Rabdosia serra [J]. China Journal of Chinses Materia Mediea,2011, 36(16): 2203⁃2206.

[17] 赵治清,张雁冰,薛华珍,等.溪黄草化学成分研究[J].河南医科大学学报, 1997, 32(4): 77.

[18] Zhao Z Q, Zhang Y B, Xue H Z,et al. Studies on chemical constituents of Rabdosia serra [J].Journal of Henan Medical University, 1997, 32(4): 77.

[19] Liang Y G, Xie H H, Wu P, et al. Podocarpane, isopimarane, and abietane diterpenoids from Isodon lophanthoides var. graciliflorus [J]. Food Chem, 2013, 136: 1177⁃1182.

[20] 王兆全,许风呜,董华章,等.线纹香茶菜酸的化学结构[J].天然产物研究与开发,1995(4): 24⁃28.

[21] Wang Z Q, Xu F M, Dong H Z, et al. The chemical structure of lophanic acid [J]. Natural Product Research and Development, 1995(4): 24⁃28.

[22] 张慧晔,刘锋,王德勤,等.溪黄草DNA条形码鉴定研究[J].世界科学技术⁃中医药现代化,2014, 16(7): 1487⁃1490.

[23] Zhang H Y, Liu F, Wang D F,et al. Differentiation on original plants of Xi⁃Huang⁃Cao through DNA barcodes [J]. World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, 2014, 16(7): 1487⁃1490.

[24] 莫小路,曾庆钱,黄珊珊,等.应用RAPD技术对溪黄草基原植物分类鉴定[J].中药材,2012, 35(9): 1388⁃1391.

[25] Mo X L, Zeng Q Q, Huang S S,et al. Identification of Herba Rabdosiae Serrae from different plant resources by RAPD method [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2012, 35(9): 1388⁃1391.

[26] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) [S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 1530⁃1531.

[27] National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (I) [S]. Beijing: China Pharmaceutical Science and Technology Press, 2020: 1530⁃1531.

[28] 国家食品药品监督管理局. 药品注册管理办法[Z].2007⁃07⁃10.

[29] National Food and Drug Administration.Drug registration management approach [Z].2007⁃07⁃10.

[30] 《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》课题研究组.中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则[Z].2005⁃03{指导原则编号[z]GPT 3⁃1}.

[31] 《Technical guidelines for long⁃term toxicity study of traditional Chinese medicine and natural drugs》 project team. Technical guidelines for long⁃term toxicity studies of traditional Chinese medicine and natural medicines [Z].2005⁃03 {Guiding principle number [z] GPT 3⁃1}.

[32] 袁伯俊,廖明阳,李波. 药物毒理学实验方法与技术. [M].北京: 北京化学工业出版社,2007.

[33] Yuan B J, Liao M Y, Li B. Experimental methods and techniques of drug toxicology [M]. Beijing: Beijing Chemical Industry Publishing House, 2007.

基金资助

广东省特支计划(2016TQ03R510)

国家中医药管理局南药资源综合开发国际重点实验室-云浮研究室研发平台建设(2019A090302)