血叶兰药材质量标准研究

Research in quality standards of Ludisia discolor

摘要

为制定血叶兰药材质量标准以控制血叶兰药材质量，依据《中国药典》2020年版附录相关方法，对血叶兰的药材性状、显微特征进行观察，并对其水分、总灰分、醇溶性浸出物及多糖含量进行测定。明确了血叶兰药材性状和显微结构特征，并建立了其专属性薄层色谱鉴别方法，拟规定血叶兰药材水分含量不得超过13.0%、总灰分含量不得超过17.5%、醇溶性浸出物含量不得少于19.0%、多糖含量不得少于10.0%。本研究制定出血叶兰药材质量标准，可为血叶兰药材的原料生产、市场流通及其产品开发提供检验检测依据。

Abstract

In order to establish a complete quality standard for Ludisia discolor， the medicinal properties and microscopic characteristics of Ludisia discolor were observed， and its moisture， total ash， alcohol⁃soluble extract and polysaccharide content were determined according to the relevant methods in the appendix of the 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia. We have clarified the properties and microstructure characteristics of Ludisia discolor and established its specific thin⁃layer chromatography identification method. Therefore， the water content and total ash content should not exceed 13.0% and 17.5% respectively， while alcohol⁃soluble extractive content and polysaccharide content should not be less than 19.0% and 10.0% correspondingly. This study established a complete quality standard for the medicinal herb of Ludisia discolor， which can provide inspection and testing basis for the raw material production， market circulation and product development.

Graphical abstract

关键词

血叶兰 / 多糖含量 / 质量标准

Key words

Ludisia discolor / polysaccharide content / quality standard

0 引 言

血叶兰为兰科（Orchidaceae）血叶兰属（Ludisia）的多年生草本植物血叶兰（Ludisia discolor（Ker：⁃Gawl.）A.Rich.）的干燥全草。味甘，性微凉，具有滋阴润肺、安神健脾等功效，主治肺痨咯血、食欲不振、神经衰弱等症^［1］。血叶兰以“公石松”之名始载于慈济宫保生大帝药签^［2］，因其根茎匍匐，茎节明显，又似蚕卧于石上，故又称“石蚕”或“石上藕”。主要分布于中国海南、福建；以及越南、马来西亚等国家^［3，4］。血叶兰药材除药用外，民间常以结合食疗法，达到消除无名肿毒、益气健身的作用；或以清水煎服，去肝火。有研究表明，从血叶兰的80%乙醇提取液中筛选出石油醚、正丁醇部位和水层具有较好的抗运动性疲劳活性^［5］，且血叶兰水提液高剂量组可降低血乳酸，延长小鼠负重游泳时间（P<0.005）^［6］。因此，血叶兰药材中抗运动性疲劳活性成分有待进一步研究。

目前，血叶兰的相关研究主要集中在植物生物学特征^［7~12］、观赏价值分析^［7］、野生分布状况及人工栽培繁殖^［13~17］等方面。对漳州的市场调查发现，漳州市面销售的血叶兰药材主要来自海南^［18］。为深入开发民间药材血叶兰，本研究对来自海南不同产区的10批血叶兰药材，从性状、显微特征、薄层色谱鉴别、浸出物、总灰分、水分及多糖含量方面进行研究，制定血叶兰药材质量标准。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

ECLIPSE80i型生物显微镜（尼康映像仪器销售有限公司），FURNACE1000c纤维马弗炉（天津市中环实验电炉有限公司），UV⁃2450紫外⁃可见光光度计（日本岛津制作所）。

D⁃葡萄糖（纯度≥99.8%）购自北京索莱宝科技有限公司。甲醇、乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），乙酸（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验材料

10批血叶兰药材分别采自海南省乐东、白沙、五指山、陵水、琼中、东方、万宁、昌江和保亭，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所郑希龙副研究员鉴定为兰科血叶兰属植物血叶兰，原植物腊叶标本和药材凭证标本保存于海南省中药材标本馆，样品信息见表1。每个采样点取适量植株，药材晒干后的干燥全草混匀粉碎备用。

1.2 方法

1.2.1 性状检定

采用《中国药典》^［19］2020年版（四部）通则0212项下的检定方法，对血叶兰药材的形状、大小、表面色泽与特征、质地、断面及气味等特征进行观察并描述。

1.2.2 显微与薄层色谱鉴别

显微鉴别：将血叶兰粉末过4#筛，挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液进行透化，加盖盖玻片，于生物显微镜下观察血叶兰药材显微结构。

薄层色谱鉴别：将血叶兰药材粉末过4#筛，分别取粉末1.0 g，置锥形瓶中，加乙醇15.0 mL，超声提取30 min，过滤，浓缩至2.0 mL，作为供试品溶液。另取血叶兰对照药材粉末1.0 g，同法制得对照药材溶液。分别吸取上述溶液各5~10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯⁃二氯甲烷⁃乙酸（V_乙酸乙酯∶V_二氯甲烷∶V_乙酸=6∶1∶0.01）为展开剂，展开至约8 cm，取出，晾干，喷以香草醛⁃硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

1.2.3 浸出物、总灰分、水分含量的测定

浸出物、总灰分、水分含量测定分别参照《中国药典》^［19］2020年版（四部）通则下的醇溶性浸出物测定法、总灰分测定法、烘干法进行测定。

1.2.4 多糖含量测定

血叶兰多糖含量的测定参考同科植物金线莲多糖的测定方法^［20］，并参照《中国药典》^［19］2020年版（四部）通则0401项下的紫外⁃可见光光度法，进行测定。

⑴对照品溶液的制备。精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖100.0 mg，置于100.0 mL容量瓶中，加水定容，配成1.0 mg/mL的标准溶液，即得。

⑵供试品溶液的制备。取本品粉末（过3#筛）约0.1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加水30.0 mL，于70 ℃的水浴条件下超声40 min，离心10 min（4 200 r/min），离心后取上清液0.5 mL加水定容到50.0 mL，摇匀，即得。

⑶方法学考察。①线性关系考察：精密吸取对照品溶液0.03、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置25.0 mL的容量瓶中，加水定容，摇匀。精密量取上述各溶液2.0 mL于具塞试管中，迅速精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再精密加硫酸7.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中保温30 min，取出，置冰浴中冷却5 min。照紫外⁃可见分光光度法（《中国药典》2020年版（四部）通则0401，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。②精密度实验：精密吸取同一供试品溶液，按上述同法操作，连续测定吸光度值6次，考察仪器精密度是否良好。③重复性实验：取同一批血叶兰药材平行制备供试品溶液6份，按上述同法操作，测定吸光度值，计算RSD值，考察该方法的重现性是否良好。④稳定性实验：取同一血叶兰药材供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h按上述同法操作，测定吸光度值，计算RSD值，考察供试品溶液在12 h内的稳定性。⑤加样回收率实验：精密称取已知浓度的同一批血叶兰药材6份，每份约0.1 g，分别精密加入适量标准葡萄糖溶液，按上述供试样品制备与测定方法的制备操作。测定并计算血叶兰多糖的加样回收率。

⑷样品的含量测定。按上述供试样品制备与测定方法的制备操作，测定吸光度，计算10批样品中血叶兰多糖的含量。

2 结果与分析

2.1 药材性状

血叶兰药材全长10~20 cm。根短，稍粗壮，被细密的绒毛状根毛；根茎伸长似蚕状，肉质，直径约3 mm，表面灰黄色，具纵皱纹，节明显，可见残留膜状或干枯成毛状的叶鞘。叶抱茎互生，纸质，多卷缩，展平后呈卵形至卵状披针形，长2~5 cm，宽1~3 cm，先端短急尖，基部近圆形，上表面深紫色或灰绿色，下表面紫红色或浅棕色，通常具5条脉，横脉红色或金黄色，叶柄延长成膜状鞘。有时可见花序与白色花，花序下部的花茎上具膜质苞片，花茎长10~12 cm。气微，味淡，微涩。见图1。

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别

血叶兰药材粉末呈褐色或紫褐色。根毛长，无色，基部平直，先端螺旋状。草酸钙针晶成束，有的散在。导管多为螺纹导管、梯纹导管、环纹导管。气孔多散在。淀粉粒单粒。花粉粒偶见，类球形，黄色，具3个萌发孔，见图2。

2.2.2 薄层色谱鉴别

于日光灯下检试。以X06乐东县尖峰岭采得的样品为对照，供试品与对照品药材在相应的位置上显示相同颜色的斑点，见图3。

2.3 浸出物、总灰分、水分的含量测定

10批血叶兰药材样品的醇溶性浸出物、总灰分和水分含量测定结果如表2所示。结果表明，不同批次血叶兰中水分、总灰分、浸出物含量差异均较大。

2.4 多糖的含量测定

2.4.1 方法学考察

（1）线性范围：以吸光度为纵坐标，多糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程为Y=0.061X+0.124（r=0.999），结果表明，血叶兰对照品在0.24~20.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

（2）精密度实验：测得吸光度值的RSD为0.46%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性实验：测得吸光度值的RSD为1.30%，表明该方法重复性良好。

（4）稳定性实验：测得吸光度值的RSD为1.86%，表明供试品溶液在12 h内的稳定性良好。

（5）加样回收率实验：测得血叶兰多糖平均加样回收率为113.70%，RSD为1.30%（表3）。

2.4.2 样品含量测定

按干燥品计，10批血叶兰药材多糖含量为（14.10±2.73）%，其中采自琼中县黎母山的血叶兰多糖含量最高，结果见表4。

3 讨 论

3.1 粉末显微特征鉴别

研究血叶兰的显微结构，发现草酸钙砂晶广泛存在于血叶兰药材的根茎、花、叶片、药材粉末中，叶片下表皮有环式气孔^［10］。在血叶兰药材粉末中可见草酸钙针晶束、长螺旋状根毛等显微特征^［11］。本研究对血叶兰药材粉末的显微观察发现，大量成束的草酸钙针晶，有的散在；气孔多散在，具有多种类型的导管，淀粉粒单粒，花粉粒有3个萌发孔，黄色类球形，但未观察到草酸钙砂晶。有研究发现，血叶兰药材叶上表面脉纹差异较大，推测是由于种内变异引起的，且有研究曾报道血叶兰的种内变异较大^［21］，有待进一步研究。

3.2 多糖含量测定

在民间，血叶兰常与金线莲混淆。目前仅在性状鉴别上对血叶兰和金线莲进行区别^［9，18］，本研究采用超声提取法测定血叶兰多糖提取得率为11.37%~16.83%，文献报道金线莲的多糖提取得率为1.73%~8.23%^［22~24］，由此可知，血叶兰与金线莲多糖含量上也存在显著差异。然而，通过优化提取工艺，获得金线莲多糖得率最高为26.68%^［25］，植物中多糖含量受多种因素影响，一方面受植物生长状况、采收时间的影响，另一方面也受提取工艺的影响。因此，对血叶兰和金线莲在多糖含量上的区别有待进一步研究。

3.3 血叶兰药材标准制定的意义

综上，本研究以2020年版《中国药典》为指导，对海南不同地区的血叶兰药材分别进行性状鉴别、薄层鉴别以及水分、总灰分、浸出物和多糖的含量测定，初步制定出了血叶兰药材质量标准，拟规定血叶兰药材水分不得超过13.0%、总灰分不得超过17.5%、醇溶性浸出物不得少于19.0%、多糖含量不得少于10.0%。一方面，可为血叶兰药材的原料生产、市场流通及其产品开发提供检验检测依据。另一方面，该标准的建立将有助于对血叶兰药材药用活性成分和药理作用方面的进一步研究。

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基金资助

海南省自然科学基金创新研究团队项目(2017CXTD022)