温郁金萜类合酶基因CwTPS4的克隆和表达特征

Cloning and expression feature of CwTPS4 gene from Curcuma wenyujin

摘要

温郁金是著名的"浙八味"之一,药用价值高、应用广泛,萜类化合物是其主要的药用成分。萜类合酶是植物萜类化合物生物合成途径中的关键酶。依据温郁金根茎的转录组数据,采用反转录PCR获得了1个萜类合酶基因CwTPS4(GenBank登录号:MW774935),其开放阅读框长1 515 bp,编码504个氨基酸,含有萜类合酶特有的结构域和保守序列RXR、DDXXD等;生物信息学分析表明CwTPS4编码的蛋白定位在细胞质中、无跨膜区域,为水溶性的稳定蛋白,属于萜类合酶的TPS-a亚家族成员。实时荧光定量分析表明,CwTPS4基因主要在生长旺盛的叶片中表达,其次在根茎膨大初期的根茎中表达量较高,而在成熟或衰老的组织中表达量较低。本研究从温郁金中克隆得到1个新的萜类合酶基因CwTPS4,经生物信息学分析表明CwTPS4可能参与了温郁金中倍半萜类化合物的合成,为下一步研究其在温郁金萜类物质合成中的功能奠定了一定的基础。

Abstract

As one of the eight famous genuine regional drugs in Zhejiang province， Curcuma wenyujin is widely applied with high medicinal value. Terpene compounds are the main medicinal ingredients of C. wenyujin. Terpenoid synthase （TPS） is the key enzyme for terpene biosynthesis. According to the transcriptome database of C. wenyujin， a TPS gene was cloned by reverse transcription PCR （RT⁃PCR）. The TPS gene was named CwTPS4 with an open reading frame （ORF） of 1 515 bp and encoding 504 amino acids. The GenBank registration number was MW774935.The CwTPS4 protein had a conservative TPS domain and conserved motifs （RXR、DDXXD）. It was predicted that the protein located in the cytoplasm and had no transmembrane regions. Further analysis revealed that the CwTPS4 belonged to TPS⁃a subgroup of plant TPS family. The real⁃time PCR results showed that CwTPS4 was mainly expressed in vigorous leaves， followed by expanded rhizome， and lower in the mature or aging tissues. The cloning， bioinformatics analysis of CwTPS4 and its expression patterns will provide a foundation for further research on its function in terpene biosynthesis of C. wenyujin.

Graphical abstract

关键词

温郁金 / 萜类合酶基因 / 基因克隆 / 表达特征

0 引 言

萜类化合物是由异戊二烯（C₅）以头头或头尾方式连接而成的一类天然化合物的统称，目前已分离和鉴定的种类达60 000多种^［1］。萜类化合物在人类的生活中发挥着重要的作用，比如很多萜类化合物因具有独特的香气和风味，被广泛应用于化妆品和食品等行业^［1］；一些萜类化合物，如多萜类物质橡胶被用于工业生产中；更重要的是，一些萜类化合物因具有高效的药理活性，为治疗人类疾病提供了新的方向^［2］。从青花蒿中提取的青蒿素是国际上治疗疟疾的特效药^［3］，从温郁金中分离出的倍半萜化合物榄香烯已使国内外100多万癌症患者受益^［4］。

目前，萜类化合物主要从植物中提取获得，但其含量在植物中普遍较低、且化学结构复杂难以人工合成，如青蒿素仅占青花蒿叶片干重的0.1%~1.0%^［3］，榄香烯在温郁金中的含量不到千分之二^［5］。为了提高植物中目标萜类化合物的含量，国内外学者对萜类化合物的生物合成途径做了大量的研究，现已基本阐明其合成途径。萜类化合物的生物合成途径主要由3个阶段组成：① 前体物质异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基二磷脂（DMAPP）的生成；② 牦牛儿基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）和牦牛儿牦牛儿基焦磷酸（GGPP）等直接前体的生成。③ 萜类化合物的生成及修饰。前2个阶段已经研究得比较清楚，第三阶段具有种属特异性^［2，6］。总的来说，萜类前体化合物的合成途径在不同的植物中比较保守，基因的数量和催化功能差异不大，而决定化合物结构的萜类合酶虽然序列上具有一定的保守性，但它们的催化活性和产物差异巨大^［7］，萜类合酶是萜类化合物合成的关键酶，是自然界萜类化合物结构多样性的主要原因^［8，9］。因此，植物中萜类合酶基因的挖掘和功能分析是解析萜类化合物代谢调控机制的关键。

温郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）属姜科（Zingiberaceae）姜黄属（Curcuma）植物，原产于浙江温州，是著名的“浙八味”之一^［4］。温郁金根茎或块根经过不同的炮制后可分别制成“温莪术”“片姜黄”和“温郁金”三种常用中药材^［10］。温郁金具有抗癌、抗病毒、抗炎和治疗心脑血管疾病等药理活性^［11］，含有的100多种萜类化合物是其主要的药效物质。以温郁金根茎中的萜类物质为主要活性成分的“保妇康栓”年销售额达4亿元以上；从温郁金中分离得到的倍半萜类化合物——β⁃榄香烯是国家二类抗肿瘤新药^［4］。有学者从多个角度阐述了温郁金可能具有治疗新冠病毒的疗效，以萜类化合物为主要药效成分的莪术注射液成为浙江省新冠肺炎临床诊断推荐用药^［12］。温郁金作为传统重要中药材来源的药用植物，越来越显示出巨大的开发潜力。目前在温郁金中只报道了一个有关β‑榄香烯的倍半萜合酶基因^［5］，有关其萜类物质代谢调控的机制了解的还很少，严重限制了温郁金中高价值萜类化合物的开发和利用。本文在前期转录组分析的基础上，首次从温郁金中克隆、鉴定出1个新的萜类合酶基因，并对它的组织表达特性进行了分析，以期为下一步研究其在温郁金萜类物质合成中的功能提供参考，为解析温郁金中萜类化合物的生物合成机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采自海南碧凯药业有限公司莪术种植示范基地，样品经中国医学科学院药用植物研究所海南分所朱平老师鉴定为温郁金（C. wenyujin Y. H. Chen et C. Ling），同时作者通过DNA条形码技术证明了该基地种植的基原植物是温郁金^［13］，保证了取材的准确性。按照陶正明等^［14］对温郁金发育时期的划分，在叶丛期采集温郁金的根、根茎、叶片、叶颈和叶鞘等组织后迅速置入液氮中，于-80 ℃冰箱保存备用；进入根茎膨大期后，采集不同发育时期的根茎，洗净后放入液氮中速冻，放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成

每个样品取100 mg 在液氮中研磨成粉末，利用EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒（Aidlab RN38，中国）提取总RNA。提取的RNA用OD_260nm/OD_280nm比值法和1%琼脂糖凝胶电泳法检测合格后，按照TransScript One⁃Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix试剂盒（TransGen AT311， 中国）合成cDNA。

1.2.2 目的片段的克隆

根据温郁金转录组数据筛选出的酶基因序列，运用DNAMAN8软件设计包含ORF全长的正反引物（表1），以cDNA为模板，运用EcoTap PCR SuperMix试剂盒（Transgen AS151，中国）进行PCR扩增。PCR反应体系30 µL：2x PCR SuperMix15 µL，正反引物各0.6 µL，cDNA 1.5 µL，ddH₂O 12.3 µL。PCR扩增程序：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 变性30 s，53 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，36个循环；72 ℃ 10 min终止反应。

1.2.3 PCR产物纯化及克隆测序

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根DP209，中国）回收、纯化目的片段，用T4 DNA连接酶连接到pSmart⁃HCKan⁃T载体上，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑取阳性克隆进行 PCR验证，最后在北京六合华大基因科技有限公司完成测序。

1.2.4 生物信息学分析

利用NCBI的Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线工具对获得的DNA序列进行序列比对和结构域预测。分别采用ExPASy⁃ProtPara tool （http：//web.expasy.org/protparam）、WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）等在线工具对其酶蛋白的理化性质、亚细胞定位和跨膜结构进行预测。利用预测的氨基酸序列，从拟南芥数据库（https：//www.arabidopsis.org/）中获取拟南芥萜类合酶的氨基酸序列，利用MEGA 6.0软件构建NJ系统树。

1.2.5 组织表达分析

根据获得的萜类合酶基因的编码区序列设计荧光定量PCR引物（表1）。分别以温郁金的叶片、叶颈、叶鞘和根以及不同发育时期根茎的cDNA为模板，利用Top Green qPCR Supermix试剂盒（TransGen AQ131，中国）进行荧光定量实时PCR （Roche LightCycler96，瑞士），每个样品重复3次。选取温郁金GADPH基因作为内参基因。

2 结果与分析

2.1 温郁金CwTPS4基因的克隆及鉴定

为了深入研究温郁金萜类化合物生物合成的分子机制，本研究从温郁金根茎的转录组数据中筛选到了1条表达量较高的注释为萜类合酶的序列C66011。根据温郁金转录组数据设计引物进行PCR扩增，获得了一条清晰的目的条带，通过纯化、克隆和测序等技术，获得了1条完整的开放阅读框（ORF），其序列全长为1 515 bp，编码504个氨基酸（图1）。利用上述基因的核酸序列为探针，在NCBI中进行Blastn分析，结果显示与红球姜（Zingiber zerumbet）的倍半萜合酶基因ZSS4最相似，总得分（total score）为2 156，一致性（identities）为92.34，因此将该基因命名为CwTPS4（Curcuma wenyujin Terpenoid Synthase）。

通过NCBI的Conserved Domain工具分析显示，CwTPS4序列含有萜类合酶结构域，如天冬氨酸富集区、底物⁃Mg²⁺结合位点（图2）；将温郁金的CwTPS4氨基酸序列作为查询序列，在NCBI的非冗余数据库中通过Blastp搜索同源蛋白，提取得分最靠前的5个物种的氨基酸序列与CwTPS4进行比对分析（图1），结果表明该序列中含有萜类合酶的保守基序（conserved motifs）RXR、DDXXD和NSE/DTE ［即（N/D）DXX（S/T）XXXE］等（图1）。这些进一步说明克隆获得的CwTPS4基因属于萜类合酶基因。

2.2 生物信息学分析

ExPASy在线工具分析显示，CwTPS4蛋白分子式为C₂₆₆₇H₄₁₆₉N₆₈₁O₇₇₈S₂₃，相对分子量为58 960，理论等电点为5.28，不稳定系数为32.42，属于稳定蛋白质，总平均亲水性系数为-0.192，属亲水性蛋白。TargetP 1.1 Server和WoLFPSORT等工具分析显示，CwTPS4不含有信号肽，位于细胞质中的可能性最大。TMHMM工具分析显示，该蛋白没有跨膜结构域。

Chen等^［9］在2011年根据氨基酸序列的相似性，将植物的萜类合酶划分为TPS⁃a， b， c， d， e/f， g和h 7个亚家族，其中TPS⁃a亚家族主要含有被子植物倍半萜类合酶。本文将CwTPS4的氨基酸序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana）萜类合酶^［15］的氨基酸序列构建系统进化树（图3）。从图中可以看出，CwTPS4与拟南芥TPS⁃a亚家族中的萜类合酶聚在一个分支上。上述结果表明，CwTPS4在温郁金中可能参与了倍半萜化合物的生物合成。

2.3 CwTPS4基因的组织表达特性分析

温郁金为一年生植物，根据温郁金的生长特点，陶正明等^［14］将温郁金的生长发育过程分成5个时期：发根发芽期、苗期、叶丛期、根茎膨大期和干物质积累期。其中前三个时期以地上部分生长为主，进入根茎膨大期后，地上部分生长减缓、温郁金根茎迅速膨大，进入干物质积累期后地上部分逐渐枯死，地下部分重量明显增大。本研究运用实时荧光定量PCR技术研究了CwTPS4基因在叶丛期末期、根茎膨大期中期不同组织中的表达情况，结果显示CwTPS4基因在叶丛期（10月7日）和根茎膨大期（11月7日）叶片中的相对表达量最高，同时在不同组织中叶丛期时的CwTPS4基因的相对表达量均高于根茎膨大期（图4）。

根茎是温郁金主要的药用部位，我们进一步研究了CwTPS4基因在不同发育时期根茎中的表达特性，结果显示CwTPS4基因主要在迅速膨大的根茎中表达，例如在大头的迅速膨大期（9月26日）和二头的迅速膨大期（11月7日）中相对表达量最高；在根茎进入成熟期后该基因的相对表达量相对较低，例如处于干物质积累期（1月12日）的大头和二头中表达量明显降低（图5）。

3 讨 论

温郁金是典型的以萜类化合物为主要药用成分的植物，是著名的“浙八味”之一，需求量大、应用广泛^［11］。但温郁金中高活性萜类化合物含量低，且与许多结构相似的萜类化合物混杂在一起，分离困难，如榄香烯在温郁金中的含量不足千分之二，其市场售价高达每克3 000元以上^［5］。萜类合酶种类和功能决定了植物中萜类物质的多样性^［2，6］，因此萜类合酶的挖掘和功能分析，是研究萜类化合物生物合成和代谢调控的重点^［5］。除拟南芥^［15］等模式植物外，目前科学家已在青花蒿^［3］、姜花（Hedychium coronarium）^［6］、石斛（Dendrobium nobile）^［16］和合欢（Albizia julibrissin）^［17］等药用植物中克隆获得了上百个萜类合酶基因，但温郁金中的萜类合酶基因仍少有报道。

本研究首次从温郁金中克隆获得了1个新的萜类合酶基因CwTPS4，并对其进行了生物信息学分析。通过序列比对发现，CwTPS4基因与红球姜的倍半萜合酶基因ZSS4最相似，同时该基因编码的氨基酸序列具有典型的萜类合酶的结构域和保守基序。聚类分析显示CwTPS4分布在植物萜类合酶的TPS⁃a亚家族中，而TPS⁃a亚家族中主要以被子植物的倍半萜合酶为主。基于以上分析，我们认为CwTPS4基因参与了温郁金中倍半萜类化合物的合成。在植物细胞中，倍半萜类化合物主要通过细胞质中的MVA途径合成前体化合物FPP，然后经倍半萜合酶催化形成结构各异的倍半萜类化合物^［8］。本研究的结果证明CwTPS4位于细胞质中，从亚细胞定位的角度也支持该基因编码的蛋白可能参与了倍半萜类化合物的合成。但是这些分析仅从系统进化的角度证明CwTPS4是倍半萜合酶基因，并不能说明CwTPS4基因究竟参与了哪种倍半萜的合成。针对这个问题，下一步我们将利用体外酶促活性分析等验证CwTPS4蛋白的催化活性。

萜类化合物经常在特定的环境或发育阶段，从特定的植物组织中产生，这主要是由于萜类合酶基因的时空特异表达造成的，如金鱼草中月桂烯和罗勒烯，主要在花的上唇瓣和下唇瓣部位释放，是因为相应的萜类合酶基因在这些部位表达量高有关^［18］。本文中的实时荧光定量PCR结果表明，CwTPS4基因主要在温郁金的叶片和迅速膨大的根茎中表达，同时在健壮叶片中的相对表达量高于衰老的叶片，幼嫩的根茎高于成熟的根茎，因此我们推测CwTPS4蛋白催化形成的倍半萜类化合物可能与植物的生长发育相关。本研究的开展为下一步研究CwTPS4基因的功能和调控机制奠定了基础，为进一步探索温郁金中萜类化合物的生物合成机制提供了一定的依据。

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