水稻颖壳颜色的研究及进展

Recent progress in the rice hull color

摘要

水稻是世界上一半以上人口的主食，对于我国乃至世界的粮食安全具有举足轻重的作用。颖壳是水稻的重要花器官结构，主要由内、外稃组成。目前最常见颖壳颜色为黄色，而黑色、金黄色、褐色等较为少见，研究表明这主要是由于类黄酮的积累不同导致的。通过分析水稻黑色颖壳性状的遗传机制，并以当前报道的两种异常颖壳（金黄壳、褐壳）突变体为对象，解析了相应颜色颖壳的呈色机理；阐述了类黄酮生物合成基因对颖壳颜色的影响，为剖析水稻颖壳的色素沉积模式提供理论参考；对有色稻壳的应用前景做了分析，为观赏稻的选育指明了方向。

Abstract

Rice is the staple food of more than half of the world's population， and it plays a decisive role in the food security of our country and the world. The hull is an important floral organ structure of rice，mainly composed of palea and lemma. At present， the most common hull color is yellow， while black， golden yellow， brown， etc. are relatively rare. Studies have shown that this is mainly caused by the accumulation of flavonoids. By analyzing the genetic mechanism of rice black hull traits， and using the currently reported two abnormal hull （golden and brown hulls） mutants as objects， the coloring mechanism of the corresponding colored hulls is analyzed. The effect of flavonoid biosynthesis genes on the color of hull is described， which provides a theoretical reference for analyzing the pigment deposition patterns of rice hulls. The application prospects of colored rice hulls are analyzed， which points out the direction for the selection and breeding of ornamental rice.

Graphical abstract

关键词

颖壳 / 色素 / 类黄酮 / 观赏稻

Key words

hull / pigment / flavonoid / ornamental rice

0 引 言

野生稻（Oryza rufipogon）由于黑色素沉积而呈现黑壳颖壳，经过长期的作物驯化，栽培稻多表现为黄壳。而育种学家在利用籼粳材料培育高产水稻新品种时又频繁出现黑壳，被认为是“野化”现象，例如，本课题组把粳稻品种巴利拉（Balilla）分别与绵恢725（MH725）、粤泰B、9311抗等籼稻品种杂交，F₁后代均表现出黑色颖壳（图1）。研究发现，野生稻在各类组织中积累了大量的花青素，大多数野生稻的芒、稃尖、果皮、柱头、叶柄、叶鞘、叶片、节间和颖壳上都有紫色、黑色或红色的色素，但栽培稻由于人工选择而失去了这些色素^［1］。花青素等类黄酮生物合成途径主要存在于野生稻中，而在大多数栽培稻品种中不存在，表明人类对该性状进行了强烈的负选择，但目前对水稻花青素合成产生负选择的原因尚不清楚，且水稻颖壳花青素的生物合成及其调控途径也未得到广泛的研究^［2］。本文对黑色颖壳的遗传机制、两种异常壳色突变体的研究现状进行总结，并分析了花青素等类黄酮色素对水稻颖壳色泽的影响，以期为水稻特定部位的色素沉积途径提供参考和理论依据。

1 水稻黑色颖壳性状的遗传分析

OsBh4是目前唯一被克隆的调控水稻黑色颖壳表型的基因，该基因位于4号染色体。与黑壳野生稻W1943相比，栽培稻广陆矮4号和日本晴中OsBh4的第三外显子发生22 bp缺失，该缺失引起了移码突变，导致提前终止，这可能是导致颖壳变为黄色的主要原因；同时对27个栽培稻的测序发现，OsBh4基因存在两种变异，一是第二外显子存在1 bp的缺失，二是密码子由TCG突变为TAG导致第三外显子提前终止，表明驯化基因OsBh4存在多种起源方式^［3］。

也有报道表明控制黑壳表型的基因不止一个。对杂草稻进行数量性状位点（QTL）分析时发现，qHC4和qHC7分别是控制颖壳颜色的主效基因和修饰基因，而qHC4可能是OsBh4的等位基因^［4］。通过测定颖壳反射光谱以分析水稻颖壳颜色相关的QTL，共发现12个QTL，其中贡献率最高的2个主效QTL分别位于RM204和RM273附近，RM273位于水稻4号染色体上，而RM204位于6号染色体^［5］。基因OsPhr1位于4号染色体，编码多酚氧化酶，该酶能够氧化植物组织中的酚类物质，从而产生黑色化合物^［6］。研究者提出只有同时具有OsBh4和OsPhr1双功能基因的植株才呈现出黑壳表型，但相关证据还不足。调控水稻黑色颖壳的基因数目仍存在争议，研究发现OsBh4基因功能完全的水稻仍为黄壳，所以多基因控制颖壳颜色的观点更能解释这一现象，随着遗传机制的深入研究，颖壳黑色素沉积的调控机理也会逐步揭示。

2 水稻异常颖壳突变体的研究进展

水稻颖壳因天然色素沉积而呈现颜色，根据颜色可以将其分为黑壳、紫黑壳、褐壳、黄壳和金黄壳等。目前发现的异常颖壳颜色突变体集中在金黄壳和褐壳上，因此我们从相关基因和呈色机理进行了总结。

2.1 金黄色颖壳相关基因与呈色机理

当前已报道的金黄色颖壳突变体有6个，分别是gh1、gh2、gh3、gh5、gh6和gh881，其中，突变体gh3、gh5、gh6相关基因未被克隆，而gh1、gh2 和gh881突变体的呈色原因已被阐明。研究者克隆了基因GH2，该基因编码肉桂醛脱氢酶2（CAD2）。该酶催化苯丙烷代谢途径的最后一步，主要参与木质素在次生细胞壁的沉积^［7］。由于GH2基因结构改变导致肉桂醇脱氢酶（CAD）以及芥子醇脱氢酶（SAD）活性丧失，使木质素合成受阻，引起颖壳红棕色素的积累，进而表现出金黄色颖壳表型。水稻编码12个CAD基因，其中CAD2的酶催化活性最高^［8］。研究发现的gh881突变体也是由于OsCAD2基因突变导致的，表明肉桂醛脱氢酶在调控水稻颖壳颜色中发挥着重要作用^［9］。在研究突变体gh1时发现一个长7.3 kb的Dasheng逆转录转座子插入到OsCHI基因上游的UTR区，导致该基因编码的查尔酮异构酶功能缺失，从而导致gh1的颖壳变为金黄色^［10］。查尔酮异构酶是第一个被报道的参与类黄酮生物合成途径的关键酶，它催化查尔酮形成柚皮素，而柚皮素是花青素等植物色素合成的最初底物^{［11，12］}。综上所述，肉桂醛脱氢酶和查尔酮异构酶分别是木质素、类黄酮合成途径中的关键酶，木质素和类黄酮起源于苯丙烷类代谢通路，它们都是植物中重要的次级代谢产物，类黄酮的种类和含量影响植物组织中色素的积累，而目前木质素影响颜色的相关报道较少。

2.2 褐色颖壳相关基因与呈色机理

目前发现了5个褐色颖壳突变体，分别是ibf1、bh6、bh1、fb1和M47286。早在1917年，有研究者发现栽培稻基因组中含有OsBF和OsIBF两类基因，OsBF负责颖壳沟纹处褐色素的沉积，而OsIBF能够抑制OsBF的作用，从而维持颖壳黄色的表型^［13］。2007年发现一株ibf褐沟突变体，研究者克隆并验证了该表型受OsKF1基因的控制^［14］，同时发现与野生型相比，褐壳突变体中的总黄酮和花青素含量显著升高，而基因OsKF1在染色体上的位置是否与OsIBF一致，还没有准确的报道^［13］。研究者提出基因OsFBX310^bh6 是OsIBF的新等位基因，该基因存在一个单碱基突变，使其失去抑制OsBF的功能，从而表现出褐色颖壳^［15］。对褐壳突变体bh1的遗传分析发现，该表型由一对隐性基因调控，并将该基因定位在2号染色体长臂上^［16］。fb1突变体植株开花后颖壳逐渐变为褐色，到达成熟期呈现灰褐色，遗传分析发现该性状受一对隐性核基因调控，并将其定位在1号染色体上^［17］。在M47286突变体中，研究者发现由于T⁃DNA插入到色氨酸脱羧酶TDC⁃1和TDC⁃3基因的表达激活位置，引起基因过表达，而TDC使色氨酸脱羧后转变为色胺，进一步形成血清素，血清素二聚体通过级联积累引起褐色素的富集，从而导致突变体颖壳表现为深褐色。此外，对拟南芥施加外源血清素，出现了类似的深褐色表型，表明在单双子叶植物中，血清素的积累均会使颖壳发生颜色变化^［18］。研究发现稻瘟病菌侵染部位存在褐色素的沉积，而且在该部位检测到高水平的血清素二聚体，说明血清素不仅与呈色有关，而且能够通过色素沉积以限制病原菌的生长，从而抵御病原菌的侵害^［19］。

3 类黄酮化合物影响颖壳的颜色

类黄酮化合物是天然植物色素的主要来源，它广泛存在于植物体内，是最大的次级代谢产物群体之一，参与植物生长发育，存在于植物的各个部位^［20］。类黄酮类化合物的基本骨架结构是C6⁃C3⁃C6，三个碳原子连接左右两个苯环结构，按照分子结构和氧化性分为八大类别：查尔酮类、黄酮类、异类黄酮、黄酮醇类、黄烷酮类、黄烷醇类、原花青素类以及花青素类^{［21， 22］}。类黄酮化合物呈现的色泽十分广泛，查尔酮类多呈现深黄色，黄酮类和黄酮醇类呈现淡黄色，而花青素类从粉红色到蓝紫色不等^［21］。类黄酮化合物是植物花、果实、种子等器官色素的重要组成成分，且在植物抗逆、抗氧化、清除自由基、抵御病虫害等方面发挥着重要作用；不仅影响植物果实的农艺品质，而且对于人类的健康有关键作用^［23］。当前，越来越多的研究表明颖壳颜色与花青素等类黄酮化合物的关系密切。类黄酮色素的研究十分广泛，其合成不仅受结构基因和调节基因（转录因子）内在因素影响，还受到环境作用的外在影响，这里，我们总结了影响类黄酮合成的内在因素，为水稻颖壳色素沉积模式提供理论参考。

3.1 类黄酮合成的结构基因

植物类黄酮化合物的合成途径已被基本阐明，苯丙烷代谢途径的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A是类黄酮的最初底物，一分子的香豆酰和3分子丙二酰在CHS（查尔酮合成酶）的催化下形成查尔酮，然后查尔酮在CHI（查尔酮异构酶）的作用下生成柚皮素（无色物质），柚皮素是其他类黄酮合成代谢的必经之路，比如花青素类的天竺素，黄酮类的麦黄酮等^［21］。

大多数种子植物的种子部位都呈现不同的颜色，这主要是由于花青素的沉积^［24］，目前已发现100多种花青素，植物中常见的六种花青素为：天竺葵花青素、矢车菊花青素、飞燕草花青素、芍药花青素、牵牛花花青素、锦葵花青素^{［25，26］}。花青素在自然状态下一般是和糖类结合，形成花色苷而得以稳定地存在于植物器官中。研究表明，花色苷含量与植物器官颜色变化相关^{［27，28］}。柚皮素依次在结构基因F3H（黄烷酮⁃3⁃羟化酶）、F3’H（类黄酮3’羟化酶）、DFR（二氢黄酮醇还原酶）、ANS（花青素合酶）的催化下，形成各种类型的花青素化合物，随后在类黄酮葡萄糖基转移酶（UFGT）的糖基化和甲基转移酶（MT）的甲基化作用下形成花色苷^［29~31］。图2是类黄酮合成代谢的重要通路^{［21，29~31］}。

类黄酮合成中任意结构基因表达的改变都会影响色素的形成。近年，研究者提出一种C⁃S⁃A的基因模型，用来表示水稻颖壳色素的沉着机制。在该基因模型中，C1代表产生颜色的基因，它编码R2R3MYB转录因子，S1为组织特异性表达基因，编码bHLH蛋白。A1编码花青素合成途径中的DFR蛋白，C1和S1相互作用能够激活A1的表达，CSA三个基因均功能完全，表现出紫壳；CSa型水稻表现棕壳；CsA型水稻仅壳尖呈现紫色；Csa型水稻仅壳尖呈现棕色；而缺乏C基因的水稻表现正常的黄色颖壳。CSA型水稻颖壳呈现紫色的原因是花青素⁃O⁃葡萄糖苷的大量积累，而颖壳呈现棕色的原因是橙皮苷⁃5⁃O⁃葡萄糖苷、芦丁等黄酮类化合物的积累所致^［30］。该基因模型为解析颖壳色素的沉积机制提供了系统性的参考，同时指出调节基因在调控壳色功能上的关键作用。

3.2 调控类黄酮合成的转录因子

植物中类黄酮合成代谢中涉及的酶由一系列结构基因编码，并由各类转录因子所调控^［32］。转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录^［33］。研究发现调控类黄酮合成的转录因子主要有MYB、bHLH、WD40三大类家族，以及NAC、HD⁃Zip I等^［34］。

3.2.1 MYB转录因子

MYB转录因子可以分为1RMYB、R2R3⁃MYB、3R⁃MYB、4R⁃MYB四个亚家族，水稻中约有230个MYB因子，第一个植物转录因子是玉米中的c⁃MYB^{［35， 36］}。MYB转录因子家族在植物次级代谢产物的调控中发挥重要作用，可正向或负向调控类黄酮化合物的积累；研究发现R1⁃MYB通过调控CHS8的表达从而影响大豆中异黄酮的合成，是正向调控因子^［37］；而AtMYBL2和PhMYB27均是花青素合成的负调控因子^［38］。

3.2.2 bHLH转录因子

bHLH转录因子家族的结构域一般由60个氨基酸组成，N端序列是DNA结合的位点，C端有一个HLH区（即碱性螺旋⁃环⁃螺旋），该区域能够与其他蛋白结合，通过形成同源或异源二聚体来发挥功能，水稻中约有167个bHLH转录因子，第一个报道的转录因子同样来源于玉米^{［39， 40］}。水稻果皮颜色调控基因Rc就是一类bHLH转录因子，该基因功能缺失导致果皮颜色改变^［41］；玉米中的基因In1编码bHLH蛋白，该基因突变导致类黄酮的大量积累^［42］。

3.2.3 WD40重复蛋白

WD40重复蛋白的内部有一段40个氨基酸左右的基序，且该基序终止位点是色氨酸（W）和天冬氨酸（D）组成的二聚肽，WD重复蛋白指的是此基序的重复，一般有4~16个重复基序^［43］。MYB、bHLH和WD40转录因子常常形成MBW三元复合物共同发挥调节功能，如MrWD40⁃1、MrMYB1与MrbHLH1相互作用以调控花青素的积累^［44］。LcbHLH3和LcMYB1互作，能够激活花青素合成中的结构基因的表达^［45］，但没有依赖WD40。

3.2.4 其他转录因子

NAC转录因子家族是植物所特有的，该因子由保守的N端结构域和高度可变的C端转录激活域组成^［33］。MdNAC52转录因子可以和MdMYB9以及MdMYB11的启动子结合，以促进花青素的合成^［46］；LcNAC13可以抑制果实中花青素合成相关结构基因的表达，而LcR1MYB1能够与LcNAC13发生物理作用而逆转该抑制作用^［47］。HD⁃Zip I由HD（同源框结构域）和Zip（相关亮氨酸拉链）组成。MdHB1是一类HD⁃Zip I转录因子，该因子的沉默会导致花青素大量积累；相反，其过表达则会降低花青素含量^［48］。

与玉米和拟南芥相比，在水稻中花青素生物合成的调控因子研究较少，通过水稻与玉米的比较定位，从水稻中分离出5个花青素合成调控基因，包括1个R2R3⁃MYB基因OsC1和4个bHLH基因Ra1/OsB1、Rb、Ra2、OsB2，其中基因OsC1是水稻稃尖部位花青素合成的决定因子，也是栽培稻色素丢失的驯化基因^［2］。目前，水稻中花青素合成的调控系统还没有阐释清楚，未来有很大的研究空间。

4 有色稻壳种质的培育前景

4.1 观赏稻

育种学家在长期的育种过程中发现，栽培稻壳颜色不总是黄色，叶片颜色也不只是绿色，随着农村农业和旅游业的发展，人们开始关注水稻的观赏价值。栽培稻成熟期水稻叶片为枯黄色，稻穗为黄色，没有明显的观赏性；而拥有紫壳、粉壳、黑壳等颜色的稻穗具有更明显的观赏特征。研究者选育出两种稳定的观赏稻，并按照颖壳的颜色赋予其有趣的名字，分别是壳色为紫红褐的“紫云”和粉红褐的“玉叶红妆”^［49］。这两个稻种在抽穗至灌浆期间的色泽不断变化，使其观赏时长大大增加。因此，观赏稻种可以根据产量效益的高低选择农田种植，或以盆栽、插花的形式融入人们的生活，保证生产、观赏两不误。

4.2 高品质饲料

稻壳作为水稻的副产品，是动物饲料重要的原料之一。水稻紫色颖壳含有大量的花青素⁃O⁃葡萄糖苷，而棕色颖壳富含橙皮苷⁃5⁃O⁃葡萄糖苷、芦丁等黄酮类化合物^［30］。研究发现花青素可以作为添加剂用于饲料中，与基础饲料相比，用含花青素的饲料喂养肉鸡能够明显提高其生长速度；而且实验组肉鸡的T淋巴细胞总数大于对照组，说明花青素在提高动物免疫力方面具有重要的作用^［50］。花青素不仅能够促进禽畜类的生长，而且无毒无害，保障了动物的健康。而当今不良商贩使用含抗生素的饲料以缩短饲养动物的生长周期，导致相应元素残留，会引发食品安全问题，危害人类健康。因此在水稻选育过程中，富含花青素的稻壳将是良好的动物饲料。稻壳产量大，价格低廉，用作饲料时配合麸皮、米糠等为动物提供营养物质，但美中不足的是稻壳中纤维素含量比较高，可能更适用于反刍动物的食用。

5 总结与展望

作物驯化对于人类的生产生活具有重要影响，驯化水稻是关系国计民生和粮食安全的重要事件。水稻是超过35亿人饮食和生计的重要组成部分，未来30年全球人口预计将增长30亿，世界各地的科学家正在研究驯化水稻物种及其野生亲缘之间的遗传变异，目的是确定基因位点，以便开发新一代可持续作物绿色超级稻^{［51， 52］}。野生稻的黑壳因富含植物天然色素而具有多种功能，研究发现含类黄酮色素的水稻能够抵御鞘翅目等害虫的生物胁迫，又能吸引昆虫传粉，还能对抗氧化应激以及发挥生长调节剂的功能^［53］。因此，杂交过程中“野化”现象的出现势必引起研究学者的关注，阐明黑壳基因的遗传机制对于理解栽培稻的起源与驯化具有重要意义。

随着生物技术的迅猛发展，水稻中花青素的生理功能逐渐被揭示。解析颖壳部位花青素合成途径，对于理解水稻种皮等其他部位的花青素合成途径提供思路，为丰富水稻种质资源奠定基础。当前的研究表明黄酮类化合物对于人类健康具有重要的功能：花青素与预防某些癌症、心血管疾病和其他慢性人类疾病有关^［54］。糖尿病肾病（DN）是糖尿病的严重并发症之一，它是糖尿病患者死亡的主要原因之一，而花青素⁃3⁃葡萄糖苷（C3G）可以通过抑制氧化应激和炎症反应来改善DN^［55］。花青素具有清除自由基、刺激Ⅱ期解毒酶、减少细胞增殖、炎症、诱导细胞凋亡和分化等潜在的抗癌活性，而且膳食花青素可抑制胃肠道癌，局部应用花青素可抑制皮肤癌^［56］。综上所述，有色稻壳种质富含类黄酮，是良好的色素资源，可以提取花青素等化合物用于人类保健。

如今中国的实力大幅提升，乡村农业和旅游业逐渐兴盛，观赏稻的培育不仅能够促进旅游业的发展，而且艳丽的稻穗能够以花卉装饰的形式融入人们的生活，创新了花卉资源。湖南张家界武陵源黄龙洞风景区已栽培观赏稻，打造的田园式生态区吸引了众多游客。观赏稻无需刻意培育，对现有的彩色稻穗扩大栽培即可，而且成熟期可以正常收种，未来观赏稻将造福于人类。

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基金资助

国家自然科学基金(31771746)