纳米丝素蛋白微球的制备及性能研究

Preparation and properties of nano⁃scale silk fibroin microspheres

摘要

以家蚕丝素蛋白为原料，基于丝素自组装理论，通过酶解⁃干燥⁃溶解法制备不同尺寸的丝素蛋白微球，制备出的微球具有良好的水不溶性和稳定的分散性。对微球的形貌和结构表征结果表明，用该方法制备的丝素蛋白微球为纳米微球，当酶的添加量为2%且蛋白自组装时间为4 h时，丝素蛋白微球的平均粒径最小，仅为（32±11） nm。红外光谱（FT⁃IR）和X射线衍射（XRD）结果显示，微球中β⁃折叠结构的多少决定了微球晶体的大小，β⁃折叠越多，微球中晶体的体积越大。通过调控丝素蛋白自组装过程，可以制备平均粒径在30~140 nm之间的纳米丝素蛋白微球，且不引入任何有机溶剂和无机溶剂，制备过程绿色环保，制备出的丝素蛋白微球安全无毒。

Abstract

Bombyx mori silk fibroin of silk fibroin was used as raw material， and based on the theory of silk fibroin self⁃assembly， silk fibroin microspheres of different sizes were prepared by enzymatic hydrolysis⁃drying⁃dissolution method， and the prepared microspheres had good water insolubility and stable dispersion. The morphology and structure of the microspheres were characterized， and the results showed that the silk fibroin microspheres prepared by enzymatic hydrolysis belong to nano⁃microspheres. When the amount of enzyme was 2% and the time of protein self⁃assembly was 4h， the average particle size of silk fibroin microspheres was the smallest， only （32±11） nm. Infrared spectroscopy （FT⁃IR） and X⁃ray diffraction （XRD） results show that the number of β⁃sheet structures in the microspheres determines the size of the microsphere crystals. The more β⁃sheets， the larger the volume of the crystals in the microspheres. By regulating the self⁃assembly process of silk fibroin protein， nano⁃silk fibroin protein microspheres with average particle size of 30~140 nm can be prepared without any organic and inorganic solvents or complex instruments. The preparation process is green and environmental friendly， and the prepared silk fibroin protein microspheres are safe and non⁃toxic.

Graphical abstract

关键词

丝素蛋白 / 纳米微球 / 自组装 / 酶解

Key words

silk fibroin / nanosphere / self⁃assembly / enzymatic hydrolysis

0 引 言

近年来，随着人们对药物控释材料需求的日益增长，丝素蛋白在其中的应用也越来越多。丝素蛋白含有数种人体必需的氨基酸，安全无毒且具有良好的生物相容性和生物降解性^［1］，基于丝素蛋白所制备出的动物丝蛋白基材料在生物医用领域受到了广泛的重视，例如丝素蛋白微球。丝素蛋白微球的颗粒大小具有可调节性，能适应通过生物体内不同的传输屏障；其抗原性低于其他常用的生物降解性聚合物，如高分子聚乳酸和天然大分子胶原蛋白等^［2］。另外，基于丝蛋白两亲性的特征，丝素蛋白微球既可以负载水溶性的药物又可以负载非水溶性的药物。因此，近年来对丝素蛋白微球载药的研究工作有着较大的进展。例如，利用脂质体微囊作为模板制备平均粒径为2 μm再生丝素蛋白微球，在循环冷冻过程中负载模型蛋白质药物——辣根过氧化酶，酶的活性被很好地保留^［3］。采用水∕油∕水型复合乳液技术制备平均粒径在5.8~86.3 μm之间再生丝素蛋白微球，对维生素C的载药率为6.9%，负载率为41.5%^［4］。将水溶性抗肿瘤药物氟尿嘧啶通过冻融负载到粒径在200~500 nm之间的丝素蛋白微球表面，最佳条件下载药率约为6.8%，体外释放时间为2天^［5］。从上述文献可知，丝素蛋白微球确实具有用于载药的潜力。制备三种不同尺寸的丝素蛋白微球，用来吸附表面牛血清蛋白时发现，吸附量随粒径的减小而增加^［6］。这说明丝素蛋白微球的粒径影响着微球的吸附率和载药率，若能制备出平均粒径较小的丝素蛋白微球，则能提高微球的吸附率和载药率。

制备丝素蛋白微球的方法主要有以下六种：乳液法，自组装法，离子凝聚法，相分离法，微制备法，碾磨法。其中，乳液法制得的微球，粒径一般都在微米级别以上且粒径分布较宽；离子凝聚法和相分离法的制备过程中会引入大量的盐离子和有机化合物^［7，8］；微制备法步骤繁琐且需要精密的仪器^［9，10］；碾磨法形成的蛋白粒子形貌很不规整且颗粒之间容易相互粘连^{［11，12］}。与其余五种方法相比，自组装法的原理是基于家蚕丝成形的自组装理论，即构成丝纤维的蛋白质分子的双亲性导致了其自组装的发生，在溶液中形成类似胶束的结构^［13］。因此，自组装法制备丝素蛋白微球的过程中，既不会引入各种有机溶剂和无机溶剂，也不需要昂贵的仪器设备。

本文通过LiBr体系降解丝素蛋白，使丝素蛋白的分子量适当降低，暴露出部分酶切位点，加入碱性蛋白酶，将丝素蛋白大分子降解为短肽^{［14，15］}。在丝素蛋白自组装过程中，蛋白质分子链开始向β⁃折叠转变并形成组装体，然后在冷冻条件下抑制转变过程，使得这些组装体不能进一步聚集扩大；同时也借助水结冰过程中强大的剪切力作用，促使这些丝素蛋白组装体转变为完全水不溶性的β⁃折叠结构，从而制备出了平均粒径在30~140 nm之间的丝素蛋白微球。同时，微球的形貌规整，具有良好的水不溶性和分散性。与其他制备方法相比，本实验制备出的微球安全无毒，且微球的最小尺寸仅为（32±11） nm，能有效提高微球的吸附量。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

① 碱性蛋白酶（alcalase，来源于地衣芽胞杆菌）、溴化锂（LiBr）、碳酸氢钠（NaHCO₃）、碳酸钠（Na₂CO₃）、无水乙醇（C₂H₅OH）均购自国药集团化学试剂有限公司；桑蚕丝由中国农业科学院蚕业研究所提供。

② 电子天平（Mettler Toledo，精密仪器有限公司）；磁力搅拌器（DF⁃101S，巩义予华仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海荣丰科学仪器有限公司）；超纯水系统（法国Millipore公司）；数显恒温水浴锅（HH⁃S，中国金坛市医疗仪器厂）；冷冻离心机（Multifuge XIR，美国Thermo Scientific公司）；冷冻干燥机（上海豫明仪器有限公司）；扫描电镜（S⁃4800，日本Hitachi公司）；傅里叶变换红外光谱仪（IFS Bruker 66 v/s）；X射线衍射光谱仪（SmartLab 9KW，日本理学公司）；生物培养箱（LHS⁃50CH）；Zeta电位仪（Zetasizer WT）。

1.2 丝素蛋白微球的制备

1.2.1 脱胶丝的获取

将0.5 g的Na₂CO₃溶解在1 L超纯水中，加入5~7 g的蚕丝。在100 ºС下不停搅拌，30 min后取出蚕丝用60 ℃超纯水洗涤以去除丝胶蛋白和残留离子，重复上述操作三次。脱胶结束后，将蚕丝团拉松，在45 ºС的烘箱中烘干，获得脱胶丝。

1.2.2 脱胶蚕丝的溶解

采用二元体系（LiBr⁃H₂O）溶解丝素蛋白。称取1 g脱胶丝放入离心管中，加入10 mL的9.3 mol/L的溴化锂溶液，剧烈摇晃1 min后将溶液放入60 ℃水浴加热30 min，得到透明粘稠状的丝素蛋白溶液。将得到的丝素蛋白溶液在离心机中以5 000 r/min的转速离心10 min，除去溶液中的不溶物和气泡后装入透析袋中用超纯水透析三天，以完全除去溶液中的Li ⁺ 和Br^—，得到纯净的丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液在-80 ℃冰箱内预冷冻12 h，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥48 h后得到丝素蛋白纤维。

1.2.3 丝素蛋白纳米微球的制备

选取碱性蛋白酶（酶活2.4 u/g，密度1.17 g/mL）进行实验。取一定量的丝素蛋白纤维，加入pH=8.5的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，使底物质量分数为5%。再加入一定量的碱性蛋白酶，使得E/S分别为1%，2%，3%（E为酶的质量，S为底物质量）。将溶液放入60 ℃的水浴锅中反应3 h；反应结束后升温到100 ℃维持10 min，以便使酶灭活。丝素蛋白在溶液中自组装12 h后，放入-80 ℃冰箱中预冷冻12 h，通过冷冻干燥制得最终产物丝素蛋白微球。

1.3 丝素蛋白微球的表征和性能测试

1.3.1 丝素蛋白微球的形貌

将冻干的丝素蛋白微球分散在超纯水中，轻轻晃动使其分散均匀，取一滴溶液滴到硅片上，待液滴干燥后将硅片放入扫描电镜仪中进行微球形貌的表征。

1.3.2 丝素蛋白微球的结构

利用红外光谱仪和X射线衍射仪测定丝素蛋白微球的二级结构。将丝素蛋白微球与KBr混合，碾磨压制成盐片，使用IFS Bruker 66 v/s傅里叶变换红外光谱仪进行测试，光圈大小：10 μm×10 μm，光谱范围：600~4 000 cm^-1，光谱分辨率：0.4 cm^-1。采用日本理学公司的SmartLab 9KW型号X射线衍射仪进行测试，辐射源：铜靶（CuKa，λ=0.154 2），电压：40 KV，范围：4~60°。

1.3.3 丝素蛋白微球的性能

将不同粒径的丝素蛋白微球分别记为微球1~5，分别称量10 mg的微球放在恒温恒湿的生物培养箱中，设定温度为24 ℃，湿度为70%，每隔24 h取出称重一次，记录丝素蛋白微球的吸水量。另外，将微球均匀分散在纯水中，配置成浓度为1 mg/mL的溶液，利用Zeta电位仪测量溶液的电位，以表征微球在溶液中的分散性。

2 结果与分析

2.1 丝素蛋白微球的形貌

微球一般是指高分子聚合而成的微小球状实体，一般为球形或类球形，分为纳米级微球和微米级微球。微球的粒径小的可以是几纳米，大的可以是几百微米。其中粒径小于100 nm的，通常被称为纳米球或纳米粒，属于胶体的范畴^［16］。

图1为丝素蛋白微球（E/S=2%）的扫描电镜图，从图中可以看出，酶解⁃干燥⁃溶解法制备出的丝素蛋白微球为纳米球，形状比较规整，大多数呈球形。

采用Zeta电位仪测量丝素蛋白微球的平均粒径。微球在水性介质中分散，f（Ka）=1.5，符合Smoluchowski模型^［17］。在测量过程中，粒子的尺寸越大产生的散射光越强，所需的浓度越低。蛋白与水的折光指数差很小，所以选择1 mg/mL的浓度进行测试。图2和表1为不同制备条件下丝素蛋白微球平均粒径的大小。

由图2和表1可知，在相同的组装时间下，酶的添加量越多，形成的丝素蛋白微球粒径越小。当酶的添加量为1%时，微球的平均粒径最大，为（131±10） nm。当酶的添加量为3%时，图中出现了双峰，说明这时候溶液中存在两种粒径差距极大的粒子。这表示如果丝素蛋白被酶解的太彻底的话，可能会导致自组装过程的不稳定，不能得到粒径较为均一的丝素蛋白微球。同时，我们还研究了组装时间对丝素蛋白微球的影响。当酶的添加量固定为2%时，随着自组装时间的延长，微球的粒径逐渐变大。当组装时间为4 h时，溶液中微球的平均粒径为（32±11） nm，方差较大，说明微球的粒径分布较广，粒径不均一。因此，制备丝素蛋白微球时，要注意控制酶的添加量和自组装时间，防止微球粒径差距较大。

2.2 丝素蛋白微球的二级结构

2.2.1 傅里叶变换红外光谱（FT⁃IR）表征结果

FT⁃IR一直被广泛应用于有机物、高聚物和其他复杂化合物的结构测定，所以采用红外光谱来研究丝素蛋白微球的结构。红外光谱主要用来观察蛋白的酰胺谱带，本实验中主要分析蛋白的酰胺Ⅲ区（主要是C—N伸缩振动并具有N—H平面中弯曲的贡献^［18］），其中重点分析1 230 cm^-1（归因于无规卷曲或α/旋或两者兼有），1 260 cm^-1（归因于β⁃折叠）这两个明显的特征峰^{［19，20］}。丝素蛋白微球的红外图谱和二级含量结构图分别如图3、4所示。

从图4中可知，丝素蛋白微球的β⁃折叠的含量与酶的添加量有关，同时自组装时间的长短也对β⁃折叠的含量产生影响。这是因为丝素蛋白自组装时，水溶液中的蛋白质分子链发生由无规卷曲/α⁃螺旋向β⁃折叠的转变，自组装的时间越长，溶液中β⁃折叠的聚集体越大，丝素蛋白微球的粒径就越大。

2.2.2 X射线衍射表征结果

当X射线与晶体相遇时能发生衍射现象，而衍射线在空间分布的方位和强度则与晶体结构密切相关，所以X射线衍射是研究丝素蛋白中结晶区域的有力工具之一^［21］。如图5（a，b）所示，（200）、（210）、（002）三个晶面分别对应a、b、c轴，晶粒尺寸由Debye⁃Scherrer公式计算所得。

对丝素蛋白微球的XRD谱图进行半定量分析，结果如表2所示。从表中可知，添加的酶量越多，形成的微球的晶体体积越小。自组装的时间同样对晶体体积产生影响，在自组装过程中，丝素蛋白水溶液中的蛋白质分子链发生向β⁃折叠的转变并形成亚微米级的组装体，随着组装时间的增加，这些β⁃折叠组装体进一步聚集变大，使得微球中的晶体体积变大。XRD表征结果也验证了这一点，随着组装时间的增加，2%酶解的丝素蛋白微球的晶粒体积从1.09 nm³增加到3.79 nm³。

2.3 丝素蛋白微球的性能

2.3.1 丝素蛋白微球的水不溶性

测试丝素蛋白微球的水不溶性可以根据丝素蛋白微球的吸水率或者溶胀率来简单表征^［22］。本实验采用吸水率来表征丝素蛋白微球的水不溶性，结果如表3所示。

W=（B-G）/G×100%^［23］

W为吸水率（%），G为试样干燥后的重量，B为试样饱含水分以后的重量。

从表3中可以看出，丝素蛋白微球的吸水率随着粒径的增大而减小。丝素蛋白制品的水不溶性主要来自其聚集态结构中的β⁃折叠区域，规整的β⁃折叠（晶区）具有很强的疏水性^［24］，少量的β⁃折叠（5%以下）就可使丝蛋白不溶于水。这与FT⁃IR结果一致，FT⁃IR结果显示，微球的粒径越大，微球中含有的β⁃折叠结构就越多，因此，微球的水不溶性就越好。

2.3.2 丝素蛋白微球的分散性

样品的Zeta电位大小表明液体中的粒子是稳定存在还是趋向于絮凝，因此采用Zeta电位仪来表征丝素蛋白微球在溶液中的分散性，结果如图6和表4所示。一般情况下，Zeta电位仪直接测定的是电泳迁移率，再转化为Zeta电位，Zeta电位是通过Henry方程^［17］推导出来的。

U_E= 2εζf（ka）/3η

其中ζ：Zeta电位；U_E：电泳迁移率；ε：介电常数；η：粘度；f （Ka） ：Henry函数 （1.5或1.0）。

由图6可以看出，不同粒径丝素蛋白微球在溶液中的分散性都很稳定，没有出现多峰现象。表4显示，随着微球粒径的减小，平均电位的绝对值也随之减小，微球在溶液中的分散性变差。这是因为在分子链有足够的运动空间的情况下，若微球的初始聚集态结构以无序态/SilkⅠ为主，其依然能够缓慢地向SilkⅡ结构转变^［25］。这一定程度上容易造成丝素蛋白微球之间粘连，进而不容易再次在水中分散^［26］。

3 结 论

本文依据丝素蛋白自组装理论，采用酶解⁃干燥⁃溶解法制备出了不同粒径的纳米丝素蛋白微球。在相同的自组装时间下，随着碱性蛋白酶添加量的增加，制备出的丝素蛋白微球粒径逐渐减小；在相同的酶量下，随着自组装时间的增加，制备出的丝素蛋白微球粒径逐渐增大。本实验制备出的丝素蛋白微球的平均粒径在30~140 nm之间，Srisuwan等^［6］的研究证明，丝素蛋白微球的尺寸越小，吸附量越大，所以本研究制备出的小粒径丝素蛋白微球增加了丝素蛋白微球载药的潜力。

FT⁃IR和XRD测试结果表明，丝素蛋白微球的粒径与β⁃折叠的含量和晶粒的大小密切相关，微球中β⁃折叠的含量越少，晶粒的体积就越小，微球的粒径也随之变小。β⁃折叠的含量同时还影响着微球的水不溶性和分散性，因为丝素蛋白制品的水不溶主要来自其聚集态结构中的β⁃折叠区域，规整的β⁃折叠（晶区）具有很强的疏水性。因此，β⁃折叠的含量越多，丝素蛋白微球的水不溶性就越好。同时，完全水不溶性的β⁃折叠结构也有利于制得单分散性良好的丝素蛋白微球。

此外，本实验制备丝素蛋白微球的过程完全不引入任何有机溶剂和无机溶剂，也不使用复杂的仪器设备，整个制备过程绿色环保，制备出的丝素蛋白微球安全无毒。因此，本方法制备的纳米丝素蛋白微球在医药领域具有较好的应用潜力。

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基金资助

江苏省特聘教授专项基金项目(苏教师［2015］17)