骆驼刺内生真菌的分离、鉴定与抑菌活性初筛

Isolation， identification and primary screening of antibacterial activity of endophytic fungi of Alhagi sparsifolia Shap

摘要

本研究采集干旱沙漠植物骆驼刺（Alhagi sparsifolia Shap.）标本，采用匀浆涂布法分离培养骆驼刺内生真菌，共分离获得9株内生真菌，通过ITS序列测定的方法进行鉴定，其中7株（LTCZ2、LTCY1a、LTCY1b、P9、P10、P11、3P1）为外担菌纲（Exobasidiomycetes），2株（LTCY2、LTCY3）为不整囊菌纲（Eurotiomycetes）曲霉科（Eurotiaceae）曲霉菌属（Aspergillus）。采用菌饼法检测其抑菌活性，P9、P10、P11、LTCY1a、LTCY1b、LTCZ2、LTCY3对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有潜在抑菌活性，LTCY3、P10和LTCY2对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）有潜在抑菌活性，其中分离获得的一株曲霉属内生真菌LTCY3对临床常见的致病菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠球菌均具有潜在抑菌活性。本研究以期为今后开发利用新的微生物资源提供科学依据。

Abstract

In this study， the samples were collected from arid desert plant Alhagi sparsifolia Shap.， and its endophytic fungi were isolated and cultured by uniform coating method. 9 strains of endophytic fungi were isolated and identified by ITS sequencing， of which 7 strains（LTCZ2， LTCY1a， LTCY1b， P9， P10， P11， 3P1） belonged to Exobasidiomycetes and 2 strains（LTCY2， LTCY3） belonged to Aspergillus sp. The colony cake method was used to detect the antibacterial activity. P9， P10， P11， LTCY1a， LTCY1b， LTCZ2 and LTCY3 have potential antibacterial activity against Staphylococcus aureus， and LTCY3， P10 and LTCY2 have potential antibacterial activity against Enterococcus faecalis. We found an endophytic fungus LTCY3 （Aspergillus sp.） has obvious antibacterial activity against common clinical pathogens Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa， and Enterococcus faecalis. This study is expected to provide scientific basis for future development and utilization of new microbial resources.

Graphical abstract

关键词

内生真菌 / 骆驼刺 / 抑菌活性

Key words

endophytic fungus / Alhagi sparsifolia Shap. / antibacterial activity

0 引 言

植物内生真菌是指其生活史的部分或全部阶段生活于健康植物组织内部，与宿主植物共生但并不导致宿主植物表现出明显感染症状的一类微生物^［1］。内生真菌具有丰富的物种多样性，其分布主要受环境因素（季节、光照、温度、湿度等）、地理因素（气候类型、地理位置等）和宿主因素（植物种类、组织类型等）的影响。特殊环境的微生物具有特殊的代谢产物、机能和基因类型，具有潜在的科学研究应用价值，因而成为世界生物学研究的热点之一^［2，3］。内生真菌从植物体内获得足够氮源、碳源，并通过宿主植物的保护与宿主植物协同进化形成复杂而又稳定的生态关系^［4］。一方面，宿主植物给特定的内生真菌提供光合作用所必需的生态环境、营养成分和物质能量等，满足其自身的需要；另一方面，内生真菌依靠其自身的代谢产物和次级代谢产物刺激植物的生长发育并产生与植物相同或相似的活性物质^［5，6］。这些物质作为新兴的微生物资源可能成为新的抗菌药物研究的基础，加之植物内生真菌自身繁殖快且具有多样性高的特点，极大地促进了植物内生真菌药用资源的开发和利用^［7］。

骆驼刺（Alhagi sparsifolia Shap.）是一种自然生长的豆科（Leguminosae sp.）草本耐旱植物，在医药方面可以治疗神经性头痛、牙疼、痢疾腹泻、口舌生疮等疾病^［8，9］。有研究检测发现骆驼刺中总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有抑菌作用^［10］，还有研究表明骆驼刺甲醇提取物能够显著抑制大肠埃希菌（Escherichia coli）的生物活性^［11］。对骆驼刺的研究多为对植物本身，目前对其的内生真菌抑菌活性的研究未见报道。

因此，本研究采集骆驼刺标本，对其内生真菌进行分离、培养、纯化和鉴定，目的是得到一批资源开发价值的内生真菌，通过形态学和分子生物学技术对菌株进行鉴定，并对菌株抑菌活性进行初步筛查。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试植物

标本来源于新疆维吾尔自治区克拉玛依盐碱戈壁（北纬45°16’，东经85°2’），按“S”形采样法多点采集骆驼刺植株，10个样点的样品共同组成一个混合样。

1.1.2 抗菌活性供试菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、大肠埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）均购于上海博顿生物化工公司。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离、培养、纯化

骆驼刺样本消毒后，加入无菌水充分用研钵研磨，将研磨好的组织匀浆均匀涂布于PDA培养基上，28 ℃环境下培养7 d后观察菌落，根据菌落的形态各异挑取单个菌落进行分区划线，28 ℃培养72~120 h后并再次挑取单个菌落继续分区划线培养，使平板上的菌落进一步纯化。

1.2.2 形态学观察

根据分离纯化好的9株骆驼刺内生真菌的单个菌落（包括菌落正面和背面的颜色、大小、形状）进行形态学的描述。同时把在PDA平板上分离纯化好的骆驼刺内生真菌放入全自动菌落计数仪，调整光源强度，进行拍照并保存。同时用盖玻片蘸取真菌孢子直接贴在载玻片，在载玻片上滴加1滴乳酸酚棉蓝染液进行染色，染色后把载玻片放到显微镜下观察并记录内生真菌显微形态。

1.2.3 分子生物学鉴定

取对数生长期纯化的内生真菌，使用Omega Bio⁃tek公司D3195试剂盒提取DNA后，检测DNA浓度以及OD_{260 nm}/OD_{280 nm}吸光度的比值。DNA浓度>20 ng/µL，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}比值在1.8~2.0之间，进行PCR扩增。PCR扩增的引物为ITS1：5'⁃TCC GTA GGTGAA CCT GCG G⁃3' 和ITS4：5'⁃TCC TCC GCT TATTGA TAT GC⁃3'。PCR扩增的反应体系总体积为25 μL：Premix Taq DNA聚合酶12.5 μL，模板DNA 5 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，双蒸水5.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，再通过32个循环后，获得PCR产物。扩增完的产物送上海美吉生物医药科技公司测序。

1.2.4 ITS序列比对

测序获得的内生真菌ITSDNA序列与在NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库中已知道的序列进行BLAST序列比对分析。

1.2.5 抑菌活性初筛

采用菌饼法进行初筛，用0.45%无菌生理盐水配置各试验用标准菌株菌悬液至浊度为0.5麦氏单位，均匀涂布于平板培养基上，然后在被测试真菌培养物上切取直径大小为6 mm的圆形菌饼，反贴在已涂布好标准菌株的平板培养基上，置28 ℃培养24 h后，测量抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 形态学描述

2.1.1 菌落形态描述

通过内生真菌的分离、纯化，共获得9株骆驼刺内生真菌，并根据分离纯化好的9株骆驼刺内生真菌的单个菌落（包括菌落正面和反面颜色、大小、形状）进行形态学的描述，详见表1和图1。

2.1.2 显微形态描述

用乳酸酚棉蓝染液进行染色后把载玻片放到高倍显微镜下观察9株内生真菌显微形态，对其菌体和菌丝的形态进行描述，详见表2和图2。

2.2 PCR扩增产物

琼脂糖凝胶电泳结果表明，骆驼刺内生真菌菌株DNA片段大小在500~750 bp，见图3。

2.3 ITS序列测定

9株内生真菌和NCBI数据库中已公布的相关菌种ITS序列的相似度在98.5%~100%，以97%的相似度为界，详见表3。

2.4 抑菌活性初筛

结果发现除了3P1外，有8株真菌均有一定的潜在抑菌活性。其中P10、P9、P11、LTCY1a、TCY1b、LTCZ2、LTCY3均对金黄色葡萄球菌有抑制作用，P10、LTCY3和LTCY2对粪肠球菌有抑制作用，而LTCY3对临床常见四种细菌的标准菌株均有抑制作用。详见表4、图4。

3 讨 论

内生真菌与宿主之间存在长期且互惠的共生关系，植物自身的药用价值及生物学活性也可以通过药用植物宿主的内生真菌表达出来，因此骆驼刺植物体内内生真菌所含的代谢产物和生物活性有可能跟骆驼刺植物内所含的代谢产物和生物活性密切相关。

本课题组前期通过可培养的方法获得50株内生菌，选择的培养基为LB培养基，获得的50株内生菌均为内生细菌^［12］。而本实验从骆驼刺分离出9株内生真菌，选择的培养基为PDA培养基，LB培养基可以被认为是细菌培养基，是一种广泛的用于培养细菌常用的一种培养基。PDA培养基又称马铃薯葡萄糖琼脂，是培养真菌常用的培养基，由于培养基的用途和营养成分不同，内生菌的代谢条件和培养条件条件有所不同，导致培养的内生菌有所差异。本实验分离获得7株为担子菌门（Basidiomycotina）外担菌纲（Exobasidiomycetes），属于本实验分离的优势内生真菌群，有研究发现南方异担子菌（Heterobasidion australe）发酵物在一定浓度范围下对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌均有显著的抑菌效果，且抑菌活性具有良好的热稳定性^［13］。还有专家学者发现担子菌真菌灵芝全粉对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、变形杆菌（Proteus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）这5种供试菌株均有较强的抑菌活性^［14］。本实验发现其中6株对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，1株对粪肠球菌有抑菌活性。由此可见，骆驼刺担子菌门内生真菌药用价值有待于进一步开发。曲霉属是自然界分布广泛的一类微生物，在抑菌活性方面，从柴胡中分离到的曲霉属对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌显示出抑菌活性^［15］；有研究发现海洋真菌Aspergillus sp. SCS⁃KFD66对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌能产生一定的抑菌活性^［16］；从荒漠植物牛心朴子中分离出2株高活性曲霉属菌株（CKEFL003和CKEFS001），对多种病原菌拮抗作用明显^［17］；从北极海泥中筛选出1株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及临床常见耐药菌均有不同程度的抑制活性，且活性产物多、热稳定性较好^［18］。从海洋中分离到的1株黑曲霉2HL⁃M⁃8的次级代谢产物进行研究发现对人肿瘤细胞具有抑制作用^［19］。本实验分离出的2株曲霉属真菌，其中1株对4种标准菌株均有抑菌活性，1株对粪肠球菌有抑菌活性，由此可见曲霉菌内生真菌在医药方面极具开发和利用的价值。丰富多样的内生真菌的筛选有待传统条件筛选的改进，新型的技术和筛选方法可对充分挖掘植物内生真菌资源起到一定优势^［20］。

骆驼刺生长在内陆沙荒地，因生长环境的受限导致培养的菌群数量和种类有限，所以本实验仅分离出9株内生真菌，借助现代微生物技术，对其进行高通量测序，可以了解该植物中内生真菌的多样性。本研究有时间因素的限制，发酵液的制备、最小抑菌活性的筛选以及抑菌活性物质的提取与鉴定等进一步证实骆驼刺内生真菌的抑菌活性还有待研究。

参考文献

[1] Yan L, Zhao H, Zhao X, et al. Production of bioproducts by endophytic fungi: chemical ecology, biotechnological applications, bottlenecks, and solutions [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(15): 6279⁃6298.

[2] Luo S L, Dang L Z, Li J F, et al. Biotransformation of saponins byendophytes isolated from panax notoginseng [J]. Chemistry & Biodiversity, 2013, 10(11): 2021⁃2031.

[3] Khan A L, Gilani S A, Waqas M, et al. Endophytes from medicinal plants and their potential for producing indole acetic acid,improving seed germination and mitigating oxidative stress [J]. Journal of Zhejiang University. Science, 2017, 18(2): 125⁃137.

[4] 杨镇,曹君.植物内生菌及其次级代谢产物的研究进展[J].微生物学杂志,2016, 36(4): 1⁃6.

[5] Yang Z, Cao J. Advances in research on endophytes and their secondary metabolite [J]. Journal of Microbiology, 2016, 36(4): 1⁃6.

[6] Brader G, Compant S, Mitter B, et al. Metabolic potential of endophytic bacteria [J]. Curr Opin Biotechnol, 2014, 27: 30⁃37.

[7] 王利梅,角建林,陈丽玲,等.金叶女贞内生真菌分离及抑菌活性[J].昆明医科大学学报, 2016, 37(3): 18⁃21.

[8] Wang L M, Jiao J J, Chen L L, et al. Isolation and antifungal activity of endophytic fungi from Ligustrum lucidum Ait [J]. Journal of Kunming Medical University, 2016, 37(3): 18⁃21.

[9] 郭钦,杨中铎,孙建慧.5种药用内生真菌的分离纯化及生物活性研究[J].甘肃科学学报, 2020, 32(5): 22⁃24.

[10] Guo Q, Yang Z D, Sun J H. Isolation, purification and bioactivity study of five medicinal endophytic fungi [J]. Journal of Gansu Science, 2020, 32(5): 22⁃24.

[11] 任璐.西北沙漠植物的生物活性成分及作用研究进展[J].食品研究, 2018, 36(16): 208⁃209.

[12] Ren L. Advances in bioactive constituents and their functions of desert plants in northwest China [J]. Food Research, 2018, 36(16): 208⁃209.

[13] 刘雪松,魏红雁,石磊岭,等.骆驼刺提取物对腹泻型肠易激综合征模型大鼠水液代谢和胃肠激素水平的影响[J].中国新药与临床杂志,2019, 38(3): 169⁃173.

[14] Liu X S, Wei H Y, Shi L L, et al. Effects of Alhagi extract on fluid metabolism and gastrointestinal hormones in diarrhea⁃predominant irritable bowel syndrome rats [J]. Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies, 2019, 38(3): 169⁃173.

[15] 陈军民,王雪峰,魏红雁,等.骆驼刺总黄酮提取物对五种控制菌抑菌性的比较[J].新疆中医药,2014, 32(2): 50⁃53.

[16] Chen J M, Wang X F, Wei H Y, et al. Comparison of bacteriostasis of total flavonoids extracts from Alhagi against five kinds of control bacteria [J]. Xinjiang Traditional Chinese Medicine, 2014, 32(2): 50⁃53.

[17] Pinheiro E A, Pina J R, Feitosa A O, et al. Bioprospecting of antimicrobial activity of extracts of endophytic fungi from Bauhinia guianensis [J]. Revista Argentina De Microbiologia, 2017, 49(1): 3⁃6.

[18] 张晓波,马燕,熊文娟,等.盐碱戈壁药用植物骆驼刺内生菌的分离、培养与鉴定[J].生物资源, 2019, 41(1): 53⁃60.

[19] Zhang X B, Ma Y, Xiong W J, et al. Isolation, culture and identification of endophytic bacteria from the medicinal plant Alhagi [J]. Biological Resources, 2019, 41(1): 53⁃60.

[20] 张国利,程艳芳,金静,等.南方异担子菌发酵产物抑菌活性的研究[J].时珍国医国药, 2016, 27(6): 1324⁃1326.

[21] Zhang G L, Cheng Y F, Jin J, et al. Study on antibacterial activity of fermentation products of Heterobasidium from southern China [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2016, 27(6): 1324⁃1326.

[22] 王红岩,汪璐,谢鲲鹏,等.灵芝全粉的抑菌作用和抗氧化作用[J].中国生化药物杂志, 2017, 37(3): 52⁃56.

[23] Wang H Y, Wang L, Xie K P, et al. Antibacterial and antioxidant activities of Lingzhi mushroom powder [J]. Chinese Journal of Biochemical Medicine, 2017, 37(3): 52⁃56.

[24] 李玲玲,罗合春,张先淑.柴胡内生真菌鉴定与抑菌活性筛选[J].生物技术通报, 2015, 31(10): 165⁃170.

[25] Li L L, Luo H C, Zhang X S. Identification and antifungal activity screening of endophytic fungi from Bupleurum chinense DC [J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(10): 165⁃170.

[26] 安昶亮,孔凡栋,马青云,等.海洋真菌Aspergillus sp. SCS⁃KFD66的次级代谢产物研究[J].中草药, 2019, 50(13): 3001⁃3007.

[27] An C L, Kong F D, Ma Q Y, et al. The marine fungus Aspergillus sp. secondary metabolite of SCS⁃KFD66 [J]. Chinese Herbal Medicine, 2019, 50(13): 3001⁃3007.

[28] 毕江涛,潘润霞,李乐,等.牛心朴子内生真菌的分离及其抑菌活性分析[J].草地学报, 2014, 22(1): 189⁃191.

[29] Bi J T, Pan R X, Li L, et al. Isolation and antifungal activity analysis of endophytic fungi from Cynanchum komarovii [J]. Journal of Grassland Science, 2014, 22(1): 189⁃191.

[30] 倪孟祥,胡颖.北极海泥来源抗菌活性真菌的筛选及菌株H5的初步研究[J].化学与生物工程, 2013(5): 61⁃64.

[31] Ni M X, Hu Y. Screening of antifungal fungi from Arctic Sea mud and preliminary study on strain H5 [J]. Chemical and Biological Engineering, 2013(5): 61⁃64.

[32] 关丽萍,周婷婷,李达翃,等.海洋真菌黑曲霉2HL⁃M⁃8次级代谢产物的分离鉴定及抗肿瘤活性[J].中国药物化学杂志, 2016(1): 49⁃55.

[33] Guan L P, Zhou T T, Li D, et al. Isolation, identification and antitumor activity of marine fungus Aspergillus niger 2 hl⁃m⁃8 secondary metabolite [J]. Chinese Journal of Medicinal Chemistry, 2016(1): 49⁃55.

[34] 郭顺星.药用植物内生真菌研究现状和发展趋势[J].菌物学报, 2018(1): 1⁃13.

[35] Guo S X. Research status and development trend of endophytic fungi in medicinal plants [J]. Journal of Bacteriology, 2018(1): 1⁃13.

基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D07C212)