不同来源家蝇幼虫蛋白粉的水解与抗氧化性

Hydrolysis and antioxidant properties of housefly larva protein powder from different sources

摘要

本研究比较不同来源、不同酶解物浓度的家蝇幼虫蛋白及其抗氧化活性。以来自猪粪源和鸡粪源家蝇幼虫为原料制备蛋白粉，用胰蛋白酶水解蛋白粉制备水解产物，以·OH和O₂^-·清除率为指标评价两种蛋白酶解物的抗氧化活性。结果显示，家蝇幼虫蛋白水解物在4 h达水解度最高值，其水解物的·OH清除率在5 h达到最大为59.02%，其水解物的O₂^-·清除率在4 h达到最大为73.24%；随着两种水解物浓度增加，其抗氧化效果越强，当猪粪源和鸡粪源家蝇幼虫酶解物浓度为10 mg/mL时，两者O₂^-·清除率达到最大分别为70%和80%；·OH清除率分别为45%和52%。由此可见，家蝇幼虫酶水解物对超氧阴离子、羟自由基均有清除能力，鸡粪源家蝇幼虫酶解物优于猪粪源。

Abstract

To compare hydrolysate and antioxidant activity of housefly larva protein from pig manure and chicken manure resources， trypsin was used to hydrolyze fly maggot protein to prepare antioxidant hydrolysate. The antioxidant activities were evaluated by control ·OH and O₂^- scanvenge rate. The results showed that the hydrolysis degree of the housefly larva hydrolysates reached the highest hydrolysis value at 4 h， the ·OH removal rate of 59.02% at 5 h， and the O₂^-· clearance rate of 73.24% at 4 h. With the increase of the concentration of the two hydrolysates， the stronger the antioxidant effect is. When the hydrolysate concentration at 10 mg/mL of pig and chicken manure source larvae， the maximum O₂^-· scavenging rates of the two hydrolysates were 70% and 80%， and the ·OH scavenging rates were 45% and 52%， respectively. The enzymatic protein of Musca domestica larvae can scavenge super oxide anion and hydroxyl radical， and the antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from chicken manure was better than that of the pigs.

Graphical abstract

关键词

家蝇幼虫粉 / 酶法水解 / 抗氧化性

Key words

Musca domestica larva powder / enzymatic hydrolysis / antioxidation

0 引 言

家蝇（Musca domestica）是种类最多样化的完全变态昆虫资源之一，分布广泛，常见于垃圾堆、粪中，具有周期短、生命力强、繁殖力强、营养丰富等特征^［1］，因诸多优点应用在饲料资源开发方面受到关注^［2］。自由基和活性氧是引起组织损伤造成疾病的恶化介质，体内过多的自由基和活性氧会引起疾病的突发^［3］，从动植物中提取低毒、高效、易吸收的抗氧化肽成为研究的热点^［4，5］。国内外对家蝇的研究发现，家蝇幼虫抗菌肽可对小鼠烫伤创面进行治疗，降低伤口的感染率，促进烫伤的痊愈^［6，7］，小鼠体内可获取良好耐受性的抗氧化多肽^［8］。且有研究发现蝇蛆酶解物具有清除自由基的能力^［9］，而家蝇种类很多，其幼虫所产生的抗菌肽是否具有一样活力目前国内外鲜有学者研究。因此，为了进一步探究不同来源的家蝇幼虫酶解物的抗氧化性以及对自由基的清除效果，本研究以猪粪源和鸡粪源家蝇幼虫作为研究对象，探讨家蝇蛋白水解液的抗氧化活性差别，为家蝇幼虫优良蛋白资源开发及畜禽饲料业的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

家蝇幼虫粉（A：猪源家蝇幼虫粉，猪场猪粪饲养；B：鸡源家蝇幼虫粉，鸡场鸡粪饲养）；胰蛋白酶、无水乙醚、2⁃脱氧⁃D⁃核糖为Amerisco公司产品；邻苯三酚、90%乙醇、磷酸、Tris、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、过氧化氢、EDTA；硫酸亚铁、抗坏血酸、盐酸、中性红等均为国产分析纯生化试剂。

1.2 主要仪器与设备

索氏脂肪提取器、DK⁃S12型电热恒温水浴锅、微型粉碎机、T6新世纪紫外可见分光光度计、DELTA320型精密pH计、ESJ120型电子天平等实验仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 家蝇幼虫酶解物的制备

将温度、pH、底物浓度等调到最佳条件，参照姜宁^［9］测定家蝇幼虫粉成分方法将家蝇幼虫蛋白分别水解3、4、5和6 h，并对酶解上清液进行蛋白浓度和水解度的测定。

烘干家蝇幼虫后放在索氏脂肪提取器中加入无水乙醚100 mL，在65 ℃的水浴锅上加热8 h。在干燥通风处将瓷盘内残留乙醚脱脂的家蝇幼虫自然挥发过夜。次日将其放在烘箱中烘干1 h。将脱脂家蝇幼虫粉放入粉碎机内粉碎后溶于适量的蒸馏水中，摇匀，调pH于定值并放入水浴锅中维持适温，加入所需2 500 U/g的酶并低速搅拌，开始水解。在水解至预定时间的过程中保持pH恒定，随后沸水浴灭活10 min，终止反应。冷却后调节pH至7.0，2 000 r/min离心20 min取上清液，即得到家蝇幼虫酶解液^［10］。

1.3.2 水解度的测定

本试验指标采用甲醛法测定^［11］，取蒸馏水稀释5 mL样品至25 mL，用1 mol/L的HCl、NaOH调溶液pH至7.0，加入10 mL甲醛（pH=9.0），搅拌均匀，用1 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH为9.0。在搅拌过程观察pH值读数不变时不再滴定标准液。记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，样品和对照均做3次平行试验。

样品中总氨基氮（mg/mL）=（V₁-V₂）×C_NaOH×14×25/（1 000×2.5）

公式中V₁为滴定待测液耗用氢氧化钠标准溶液的平均毫升数；V₂为滴定对照液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数；C_NaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。

水解度（DH，%）=氨基氮含量/样品总含氮量（每克蛋白质中肽键的克摩尔数取7.38）

1.3.3 蛋白质浓度的测定

用考马斯亮蓝法^［12］测样品蛋白质浓度，取干净的试管，用100 μg/mL浓度的标准溶液，取体积分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL配制标准溶液。取样绘制样品蛋白质浓度标准曲线及测定蛋白浓度。吸取样品提取液0.1 mL，放入具塞刻度试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G⁃250试剂充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

结果计算：样品蛋白质含量（mg/g）=CV/aw

式中，C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V为提取液总体积（mL）；a为测定所取得提取液体积（mL）；w为取样量（g）。

1.3.4 超氧阴离子清除能力的检测

采用邻苯三酚法^［12］，取Tris⁃HCl缓冲液（pH 8.2）4.5 mL，置于25 ℃的水浴锅中预热20 min，分别加入1 mL不同条件下的待测样品和0.4 mL的25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后25 ℃水浴锅中反应5 min，加入1 mL的8 mol/L盐酸终止反应。以蒸馏水作为空白对照（A₀），于299 nm处时测定吸光度（A_i），每个条件的样品取3个平行检测。结果按下列公式进行计算：

O₂^-·清除率（%）=（A_i -A_o）/A_i×100%

1.3.5 羟自由基清除能力的测定

采用文献［13］中的α⁃脱氧核糖法，取0.2 mL的FeSO₄⁃EDTA混合液（10 mmol/L）于具塞试管中，加入0.2 mL的α⁃脱氧核糖法溶液（20 mmol/L），然后再加入0.2 mL测试样品，并用磷酸缓冲液（pH=7.4）定容至1.8 mL，最后加0.2 mL的H₂O₂（10 mmol/L），37 ℃水浴1 h，然后加入1 mL 2.8%的三氯乙酸终止反应，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥酸（TBA），混匀后沸水浴中加热10 min，冷却后532 nm处测吸光度A_S。每个浓度样品取三个平行样，不加样品，同样操作处理，测定其对比吸光度A_C。结果代入下列公式：

·OH自由基清除力（%）=（A_S -A_C ）/A_S ×100%

1.4 统计分析

采用Microsoft Excel与GraphPad Prism 8软件进行数据统计、方差分析和t⁃检验^［14］。

2 结果与分析

2.1 不同酶解时间对水解度的影响

根据预实验数据结果并结合一些试验研究筛选出3、4、5、6 h这四个时间点进行试验研究。图1结果显示，在水解反应起始时，水解液中水解度（DH）随时间的增加上升迅速，在4 h时DH达到最大为10%，随反应速度及水解液的DH增加变缓。酶解时间从短到长，这四个时间段猪粪源的水解度平均值分别为：8%、10%、9%、9%；鸡粪源样品的水解度平均值分别为：8.29%、11.02%、11.26%、11.19%。

2.2 不同酶解时间对羟基及超氧离子自由基的清除能力影响

图2a结果显示，水解反应起始时，猪粪源家蝇幼虫酶解肽的·OH的清除能力随酶解时间有增有减，O₂^-·的清除能力呈递增，在5 h时两者清除率差别最大。这四个酶解时间猪粪源家蝇幼虫酶解物·OH及O₂^-·的清除能力由大到小分别为：5 h、6 h、4 h、3 h及6 h、5 h、4 h、3 h。相比O₂^-·，·OH清除效果较好。图2b结果显示，水解反应起始时，鸡粪源家蝇幼虫酶解肽的·OH及O₂^-·的清除能力随酶解时间有增有减，在4 h时两者清除率差别最大。这四个酶解时间鸡粪源家蝇幼虫酶解物·OH及O₂^-·的清除能力由大到小分别为：5 h、6 h、3 h、4 h及4 h、6 h、5 h、3 h。相比·OH，O₂^-·清除效果较好。

2.3 家蝇幼虫酶解液浓度对超氧阴离子自由基清除能力的影响

从图3结果显示，鸡粪源家蝇蛋白酶解液（B）对O₂^-·清除力显著强于猪粪源家蝇蛋白酶解液（A）（P<0.05），且随着蛋白酶解液浓度的增大而两者活性也增大，呈现量效关系。本试验中，酶解液浓度达到10 mg/mL时，两种产物的超氧阴离子清除能力没有差别，达最强。最高时的清除率分别是70%和80%；而酶解液浓度超过10 mg/mL时，其清除率呈下降趋势，但鸡粪源仍优于猪粪源。

2.4 家蝇幼虫酶解液浓度对羟基自由基的清除能力影响

图4结果显示，蛋白酶浓度2~6 mg/mL时，鸡粪源家蝇幼虫粉蛋白酶解液（B）对·OH清除力显著强于猪粪源家蝇幼虫粉蛋白酶解液（A）。当蛋白酶浓度为14 mg/mL时，清除力效果最佳，猪粪源家蝇幼虫粉蛋白酶解液（A）对·OH清除力强于B，但差异不显著。

3 讨 论

有研究认为采用酶解法制备家蝇幼虫酶解物过程中水解度越大，越易造成肽键断裂，过度分解蛋白影响其风味，会影响在饲料添加剂中的应用效果^［15］。而家蝇幼虫粉在酶解过程中，酶种类、酶添加量、底物浓度、pH值、酶解温度和酶解时间是影响水解度及水解产物活性的主要因素。本试验探究时间对水解度的影响，当水解在4 h之后水解液DH趋于增加变缓，可能是由于水解时间的延长部分酶失去活性，水解产物的累积也会促使反应进入动态平衡状态^［16］。其猪粪源家蝇幼虫粉酶解过程与相关研究中鸡粪源家蝇幼虫粉酶解过程水解度的趋势相一致^［17］。与对酶解温度、时间和酶添加量条件下能有效制得强抗氧化活性物质的研究结果相似^［18］，本研究表明不同浓度的家蝇幼虫提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基均有清除效果，与家蝇酶解物浓度呈正相关，原因可能是酶解物分解过程中产生抗菌肽物质越多，抗氧化性愈强。在酶解物浓度10 mg/mL水解条件下，两种家蝇幼虫酶解物有很强的清除能力，对蝇蛆肽具有较好的抗氧化活性，其可能通过增强机体内抗氧化物酶活性和自由基的清除，从而减少脂质过氧化物的生成，与发挥抗脂质过氧化作用探究结果相近^［19］。蝇蛆粉作为添加剂在饲料中添加8%可降低腹泻小鼠肠道中大肠杆菌和总菌数量，提高血清中抗氧化酶、消化相关酶活性、消化机能及抗氧化功能^{［20，21］}。还有研究表明不同家蝇幼虫肽可改善黄羽肉仔鸡肠道菌群、提高营养物质利用率，具有制成饲料或饲料添加剂的潜力^［22］。

本试验比较来源不同的家蝇幼虫粉的抗氧化能力，可知家蝇幼虫粉具有较强的抗氧化性，由于鸡粪源和猪粪源家蝇生长环境不同，可能导致家蝇蛋白粉对自由基清除能力的差别^{［23，24］}。家蝇幼虫在鸡粪和猪粪堆生长发育的过程中分泌有抗菌功能的物质，并在粪渣中保持较长时间的抗菌活性，有利于家蝇幼虫的生长发育^［25］。在鸡粪中成活率高于猪粪，与粪堆中微生物相互作用提高了家蝇幼虫体内抗菌活性物质分泌量，鸡粪源优于猪粪源的抗氧化性^［26］。对蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的研究表明^［27］，其自由基的清除达到81.83%，高于本试验中60%的羟自由基清除率趋势相一致，具有较强的抗氧化活性，由于经超滤和SePhadex G25柱层析2次纯化后，会提高其清除效果及抗氧化活性。

4 结 论

本研究在酶解时间5 h、酶解浓度10 mg/mL的条件下，猪粪源和鸡粪源家蝇幼虫酶解产物对超氧化阴离子、羟自由基均有清除能力和抗氧化效果，且鸡粪源家蝇幼虫酶解产物（B）抗氧化性优于猪粪源家蝇幼虫酶解产物（A）。探索家蝇蛋白水解液的抗氧化活性差别，促进工业化生产抗菌肽产品的进程 。为开发家蝇幼虫优质蛋白资源及畜禽饲料业的应用提供理论基础。

参考文献

[1] Li H, Inoue A, Taniguchi S, et al. Multifunctional biological activities of water extract of housefly larvae (Musca domestica) [J]. Pharma Nutrition, 2017, 5(4) : 119⁃126.

[2] Hashizume A, Ido A, Ohta T, et al. Housefly (Musca domestica) larvae preparations after removing the hydrophobic fraction are effective alternatives to fish meal in aquaculture feed for red seabream (Pagrus major) [J]. Fishes, 2019, 4(3): 38.

[3] Cai S, Lu C, Liu Z, et al. Derivatives of gecko cathelicidin⁃related antioxidant peptide facilitate skin wound healing [J]. European Journal of Pharmacology, 2021, 890: 173649.

[4] Chintalchere J M, Dar M A, Shaha C, et al. Impact of essential oils on Musca domestica larvae: oxidative stress and antioxidant responses [J]. International Journal of Tropical Insect Science, 2020, 41(1): 821⁃830.

[5] 张丰文,董超,周丽亚,等.抗氧化多肽来源、提取及检测的研究进展[J].生物技术, 2021, 31(1): 96⁃103, 64.

[6] Zhang F W, Dong C, Zhou L Y, et al. Research progress of antioxidant peptides [J]. Biotechnology, 2021, 31(1): 96⁃103, 64.

[7] Zhang J A, Liu J, Wu H J, et al. The effects of antimicrobial peptides and hyaluronic acid compound mask on wound healing after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing [J]. Journal of Cosmetic & Laser Therapy, 2018, 21(4): 217⁃224.

[8] 谢治梅,刘流,贺莉芳,等.家蝇幼虫抗菌蛋白对小鼠烫伤创面愈合的影响[J].中国现代医生,2020, 58(13): 27⁃30, 193.

[9] Xie Z M, Liu L, He L F, et al. Effect of antibacterial protein from Musca domestica larvae on scald wound healing in mice [J]. China Modern Doctor, 2020, 58(13): 27⁃30, 193.

[10] 黄靖怡,柯德森.家蝇幼虫耐高温抗氧化蛋白的筛选及其功能研究[J].中国油脂, 2020, 45(2): 69⁃75.

[11] Huang J Y, Ke D S. Screening of high temperature resistant and antioxidant proteins from housefly larvae and their functions [J]. China Oils and Fats, 2020, 45(2): 69⁃75.

[12] 姜宁.家蝇幼虫肽制备与抗氧化活性的研究[D].哈尔滨: 东北农业大学, 2009.

[13] Jiang N. Study on the preparation and antioxidant activity of housefly larval peptides [D]. Harbin:　 Northeast Agricultural University, 2009.

[14] Chintalchere J M, Dar M A, Shaha C, et al. Impact of essential oils on Musca domestica larvae: oxidative stress and antioxidant responses　[J]. Int J Trop Insect Sci, 2021, 41(1): 821⁃830.

[15] Zhang Y, Zhou X L, Ji L S, et al. Enzymatic single⁃step preparation and antioxidant activity of hetero⁃chitooligosaccharides using non⁃pretreated housefly larvae powder　[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 172: 113⁃119.

[16] 贾维宝,刘良忠,黄婷,等.几种用于肽粉中蛋白质含量测定方法的比较[J].武汉轻工大学学报,2016, 35(1): 17⁃20.

[17] Jia W B, Liu L Z, Huang T, et al.Comparison of several methods for determination of protein content in peptide powder　[J]. Journal of Wuhan University of Light Industry,2016, 35(1): 17⁃20.

[18] 贾红玉,王亚森,田晓辉,等.邻苯三酚自氧化法在SOD活性测定中的应用[J].河北大学学报(自然科学版), 2018, 38(3): 284⁃290.

[19] Jia H Y, Wang Y S, Tian X H, et al. Pyrogallol autoxidation and its application to SOD activity assay　[J]. Journal of Hebei University　Natural Science Edition, 2018, 38(3): 284⁃290.

[20] 余海忠,刘统,林丹洁,等.鄂西北产鱼腥草提取物体外抗氧化性的四种化学方法评价[J].中国野生植物资源,2012, 31(1): 22⁃25.

[21] Yu H Z, Liu T, Lin D J, et al. In vitro antioxidant activity evaluating of extracts of Houttuynia cordata from northwestern Hubei based on four chemical methods [J]. Chinese Wild Plant Resources, 2012, 31(1): 22⁃25.

[22] 赵楠.Microsoft Excel数据管理功能的实例分析[J].信息与电脑(理论版), 2015(7): 58⁃59.

[23] Zhao N.Example analysis of Microsoft Excel data management function [J]. Information and Computer (Theoretical Edition), 2015(7): 58⁃59.

[24] 李希宇,杨怀谷,唐道邦,等.牛肉蛋白水解及活性肽功能特性的研究进展[J/OL].食品工业科技:1⁃11[2021⁃03⁃24].

[25] Li X Y, Yang H G, Tang D B, et al. Research Progress on beef proteolysis and functional properties of active peptides [J/OL]. Science and Technology of Food Industry: 1⁃11[2021⁃03⁃24].

[26] Frame C A, Elisabeth H L, Kerr B J,et al. Feeding oxidized chicken byproduct meal impacts digestibility more than performance and oxidative status in nursery pigs　[J]. Journal of Animal Science, 2021, 99(2) : 1⁃9.

[27] 孙婷婷,杨文哲,张思晨,等.家蝇蛹的营养成分分析及抗氧化肽制备工艺研究[J]. 饲料工业, 2019, 40(18): 30⁃37

[28] Sun T T, Yang W Z, Zhang S C, et al. Composition analysis of Musca domestica pupa and preparation of antioxidant peptides [J]. Feed Industry, 2019, 40(18): 30⁃37.

[29] 赵春江,魏洪,夏冰天,等.蝇蛆肽对衰老小鼠的抗氧化作用[J].中国老年学杂志, 2018, 38(5): 1209⁃1212.

[30] Zhao C J, Wei H, Xia B T, et al. Antioxidant effect of fly maggot peptide on aging mice [J]. Chinese Journal of Gerontology, 2018, 38(5): 1209⁃1212.

[31] Sun H X, Chen L Q, Zhang J, et al. Anti⁃tumor and immunomodulatory activity of peptide fraction from the larvae of Musca domestica 　[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2014, 153(3): 831⁃839.

[32] 张玉栋,王巧利,申红,等.蝇蛆粉对腹泻小鼠肠道大肠杆菌数量及血清抗氧化酶和消化相关酶活性的影响[J].动物营养学报, 2020, 32(2): 890⁃897.

[33] Zhang Y D, Wang Q L, Shen H, et al.Effects of fly maggot powder on intestinal Escherichia coli count and serum antioxidant enzymes and digestion⁃related enzymes activities of diarrhea mice [J].Chinese Journal Of Animal Nutrition, 2020, 32(2): 890⁃897.

[34] 张爱忠,姜宁,张婷,等.不同家蝇幼虫制品对黄羽肉仔鸡营养物质可利用率、肠道菌群和血清生化指标的影响[J].动物营养学报, 2012, 24(5): 911⁃917.

[35] Zhang A Z, Jiang N, Zhang T, et al. Effects of different housefly larvae products on growth performance, antioxidant and immune indices in yellow⁃feathered broilers [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2012, 24(5): 911⁃917.

[36] Loenhout J V, Peeters M, Bogaerts A, et al. Oxidative stress⁃inducing anticancer therapies: taking a closer look at their immunomodulating effects　[J]. Antioxidants (Basel, Switzerland), 2020, 9(12): 1188.

[37] Ojianwuna C C, Surveyor F I. The efficacy of Zingiber officinale (ginger⁃Zingiberaceae) crude extracts applied as individual and mixed with Dennettia tripetala (pepperfruit⁃Annonaceae) against Musca domestica (housefly) larvae　[J]. Journal of Experimental Agriculture International, 2017, 17(5): 1⁃9.

[38] Mxl A, Xsh B, Jian T C, et al. Influence of moisture content on chicken manure stabilization during microbial agent⁃enhanced composting [J]. Chemosphere, 2021, 264.

[39] Zhu F X, Hong C L, Wang W P, et al. A microbial agent effectively reduces ammonia volatilization and ensures good maggot yield from pig manure composted via housefly larvae cultivation　[J]. Journal of Cleaner Production, 2020, 270(1): 122373.

[40] 巫春旭,卢雪梅,褚夫江,等.蝇蛆抗氧化肽的制备及其纯化[J].农业与技术, 2016, 36(19): 6⁃9, 22.

[41] Wu C X, Lu X M, Zhu F J, et al. Preparation and purification of fly maggot antioxidant peptides [J]. Agriculture Technology, 2016, 36(19): 6⁃9, 22

基金资助

国家自然科学基金项目(32072759)

黑龙江省农垦总局重点科研计划项(HKKYZD190311)