明代古沉船饱水木材的原核微生物多样性分析

Prokaryotic microbial diversities of archaeological waterlogged wood from Ming dynasty shipwreck

摘要

微生物是引起饱水木材降解劣化的主要因素之一。本文利用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析明代“南澳Ⅰ号”古沉船船体饱水木材样品的原核微生物群落多样性，探讨饱水木材的原核微生物降解机制。结果表明：饱水木材样品与沉积物中的原核微生物种群丰富，且在含量上存在一定差异。在门水平上存在7个共有的优势菌门，分别为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）和奇古菌门（Thaumarchaeota）。海底现场取的木材样品的菌群种类相似，存在丰富的厌氧、可以降解木材的菌群，但是含量存在着明显的差异；海底沉积物的细菌多样性及含量与木材样品存在明显的差异。脱盐过程中的木材样品含有大量好氧的铁氧化细菌（Ferritrophicum， 8%）和脱硫菌（Desulfurivibrio，5.27%），可能参与铁硫元素的转化。结果表明原核微生物多样性是饱水木材保护过程中需重点关注的问题。

Abstract

Microbial biodegradation is one of the main reasons for waterlogged wood degradation. To analyze the prokaryotic microbial diversities of the waterlogged wood from the Nan’ao Ⅰ shipwreck of Ming dynasty， Illumia Miseq high⁃throughput sequencing technique was used. The results showed that different waterlogged wood samples and sediment samples had abundant bacterial communities， and there were some difference in the content. The common predominant phyla were Proteobacteria， Chloroflexi， Bacteroidetes， Spirochaetes， Firmicutes， Acidobacteria， and Thaumarchaeota. The bacterial communities in the waterlogged wood samples were similar， and there were abundant anaerobic bacteria that could degrade waterlogged wood， but the content was obviously different. There were significant differences in bacterial diversities and content between seafloor sediments and waterlogged wood samples. A large number of aerobic iron⁃oxidizing bacteria （Ferritrophicum，8.38%）and desulfurizing bacteria （Desulfurivibrio，5.27%）may be responsible for sulfur and iron cycling in waterlogged wood samples during desalination. These results indicate that prokaryotic microbial diversities should be taken in consideration during the conservation of waterlogged wood.

Graphical abstract

关键词

饱水木材 / 细菌群落 / 高通量测序技术 / “南澳Ⅰ号”古沉船

Key words

waterlogged wood / bacterial community / high⁃throughput sequencing technology / Nan’ao Ⅰ shipwreck

0 引 言

随着近几年水下考古事业的发展，越来越多的古代沉船被发现并打捞出水。由于古沉船船体大多数是脆弱的有机质材料的木材，因此极易遭受到微生物的侵蚀，尤其是在微生物丰富的海水环境中（海洋微生物的总量占全球生物总量10%以上）^［1］，有机质的木质古船体是海洋微生物生长代谢的最佳营养源，丰富的微生物活动导致了木材的降解劣化。此外，当古沉船打捞出水后，从高盐、低氧、高压、低温、低光照的海洋环境转为低盐、高氧、低压、高温、高光照的陆地环境，这种剧烈的环境变化过程更易引起木材中微生物种群的变化，从而导致木材的进一步劣化。因此，研究饱水木材中微生物的多样性及代谢活动对饱水木材的保护具有重要意义^［2］。

木材中的微生物最初只是关注真菌，后来发现细菌才是最普遍存在于木材上的菌群，并且在有氧和无氧条件下都能生存。国外从20世纪50~60年代开始研究细菌与木材之间的关系^［3］，发现细菌对木材的影响是长期而缓慢的，甚至难以觉察到木材的降解，但是实际上4~6周时间细菌就会完全的渗透木材的结构^［4］。科学家利用透射电镜和扫描电镜等方法逐渐研究清楚细菌对木材的侵蚀破坏机制^［5~7］。Rogers and Baecker^［8］于1991年首先利用传统分离培养法分离出一种引起木材腐朽的细菌——梭状芽胞杆菌（Clostridium xylanolyticum），后来在欧洲关于木材细菌腐朽的报道也越来越多。但是由于传统培养的局限性，仅分离识别很少种类的细菌。随着分子生物学技术的发展，直接从各种不同环境（包括土壤、海洋）中取样，利用16S rRNA测序方法研究木材中降解细菌的多样性。例如2004年， 丹麦的Helm^［9］利用16S rRNA的方法从1 700年前的木材中分离培养并鉴定出21种细菌。Landy^［10］等直接从欧洲不同地方的木材样品中提取DNA，发现了56个独立的分子指纹图谱。欧洲的BACPOLES 项目也是将传统的分离技术与DNA分子技术结合来鉴定木材中的细菌。此外，变性梯度凝胶电泳（PCR⁃DGGE）、荧光原位杂交等技术方法也都开始逐渐应用，并且鉴定出大量的不能传统培养的降解木材的细菌菌群^［11］。近几年，高通量测序技术可直接研究自然状态下微生物种群结构，并且能从环境获得更加完整的DNA，极大地拓展了对微生物种群结构的认识。利用高通量测序的方法研究了南海Ⅰ号宋代古沉船中的细菌类群，发现德沃氏菌属（Devosia）、甲基娇养杆菌属（Methylotenera）、鼠尾菌属（Muricauda）是相对丰度含量较高的菌属^［12］。

本研究主要以明代古沉船“南澳Ⅰ号”为研究对象，“南澳Ⅰ号”沉船（简称“南澳Ⅰ号”）是2007年5月在广东省汕头市南澳县三点金海域的乌屿和半潮礁之间发现的一艘明代古沉船，2010年开始开展水下考古发掘，2012年完成整个船载文物的考古发掘，船体采取原址保护方法保留至原遗址。以考古发掘过程中采集的古船木样品以及后期脱盐过程中的船木为样品，利用Illumina MiSeq 高通量测序技术对样品中的细菌进行群落结构分析，了解其微生物的种群结构，为评估出水木质文物的保护提供重要的参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品材料

从明代“南澳Ⅰ号”古沉船的船体上取样，在海底古沉船S4和N13区域分别取两个船体木材样品，同时从船体所在位置取海底的底泥样品。所有样品在海底取样后直接封至取样袋中，-20 ℃冷藏保存至实验室，两个船木样品分别编号为S4和N13，海洋底泥的样品编号为N sediment。测试前，在无菌条件下用灭菌的解剖刀分别对S4和N13从表面0~5 mm，以及距表面15~20 mm处取样分装，分别编号为S4outer、N13outer、S4inner、N13inner。另外将古沉船船体的样品在实验室利用去离子水浸泡脱盐，并用在线电导率仪每30 min测量脱盐池的电导率，当数值稳定时再更换水。如此反复，大约3个月后，电导率稳定到与去离子水相同时，取样编号为W desalition。以上6个样品做Illumina MiSeq 高通量测序分析。所有样品编号见表1。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取及PCR扩增

利用DNA提取试剂盒（Tiangen）提取饱水木材样品的总DNA，0.8%凝胶电泳和分光光度法检测（260/280 nm）总DNA的浓度和纯度。使用16S rRNA的V3和V4区引物（5′–CCT ACG GRR BGC ASC AGK VRV GAAT–3′和5′–GGA CTA CNY VGG GTW TCTAAT CC–3′）进行PCR扩增。反应条件为：预变性94 ℃ 3 min×1，变性94 °C 5 s，退火57 ℃ 90 s，延伸72 ℃10 s，终延伸72 ℃ 5min， 24个循环。另外，通过PCR向16S rRNA的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行NGS测序。使用Illumina MiSeq平台（苏州金唯智生物科技有限公司）进行测序。通过Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen， Carlsbad， CA）检测文库浓度，将文库定量到10nM，按Illumina MiSeq（Illumina， San Diego，CA，USA）仪器使用说明书进行PE250/FE300双端测序，由MiSeq自带的MiSeq Control Software（MCS）读取序列信息。

1.2.2 数据分析

双端测序得到的正反向reads首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列，用Qiime（v1.7）平台软件^［13］使用UCLUST方法进行OTU（Operational Taxonomic Units，物种操作单元）聚类^［14］。用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样本的群落组成，比对数据库为Silva_111 16S rRNA database（http：//www.arb-silva.de/）。基于OTU分析结果，采用对样本序列进行随机抽样的方法，分别计算Shannon、Chao1等α多样性指数，并作出稀释曲线。基于Brary⁃Curtis样本间距离矩阵用于PCoA（principal co⁃ordinates analysis）可视化图展示β多样性^［15］。所有的序列信息提交至NCBI，获得的序列号为PRJNA691671。

2 结果与分析

2.1 测序结果及质量分析

对6个样品的原核微生物16S rRNA 基因进行Illumina MiSeq高通量测序。基于Observed OTUs 数，构建的稀释曲线见图1，每个样品的序列条数均大于60 000，且最终所有样品的稀释曲线都趋于平缓，表示这些样品的测序数据量较为合理。

2.2 细菌群落的α多样性分析

α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。对序列采用随机抽样的方法，以抽到的有效序列进行OTU分析，并计算各α多样性指数，Chao1、ACE、Shannon指数、Simpson指数等参数，结果见表2。表2中Chao1值、Shannon指数和Simpson指数的数值显示出，木材样品的原核微生物群落的丰富度高于海洋沉积物的多样性；特别是木材样品外表面（N13oute和S4outer）的细菌群落丰富度明显高于木材样品内部（N13inner和S4inner）以及海洋沉积物中细菌群落的丰富度。此外，表2显示，6个样品的覆盖度（Good’s_coverage）均高于97%， 表明本研究中的测序数量足以反映样品中绝大多数细菌群落信息。

2.3 原核微生物群落组成分析

本研究中测序的数据使用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的 OTU代表序列进行分类学分析，比对Silva_111 16S rRNA database数据库后，每个样本在不同分类水平下（门、纲、目、科、属）物种种类数目统计表为表3。本研究检测到样品中N13outer涉及的原核微生物类群最多达48门，733属，海洋沉积物N样品的群落组成量相对较低，仅33门、326属。

从海洋中直接取样的2个饱水木材样品的表面及内部OTU的Venn图结果显示（图2）木材样品N13样品表面与内部共同的OTU为3 750个，S4样品表面与内部共有的OTU为5 063个，作为同一种样品的不同位置虽然共有OTU数目量很大，但是Venn图中显示表面与内部两个样品各自不同位置的非共有性OTU量也很大，木材表面样品中的菌群种类明显比内部的丰富，这可能是由于木材表面接触海底的沉积物，受到海洋沉积物中各种因素的影响。

为更形象对比显示每个样品中的物种差异，以门、纲、属三分类水平下不同物种占各自全部物种的百分数做物种分布柱状（图3、4、5）。

图3 为6个样品在原核微生物门水平上的物种丰度柱状图，发现物种相对丰度最高的细菌门为变形菌门（Proteobacteria），尤其在木材W样品中占75.73%；绿弯菌门（Chloroflexi）次之，在S4outer样品中占51.13%，其他丰度较高的细菌门分别为拟杆菌门（Bacteroidetes）（10.68%）、螺旋体门（Spirochaetes）（27.78%）、厚壁菌门（Firmicutes）（19.88%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（11.68%）、奇古菌门（Thaumarchaeota）（7.28%）、浮霉菌门（Planctomycetes）（3.08%）、广古菌门（Euryarchaeota）（2.88%）和放线菌门（Actinobcteria）等。其中变形菌门（Proteobacteria）在6个样品中相对丰度都很高，分布为12.14%、48.60%、70.35%、50.12%、26.01%、75.73%；N13inner样品中的螺旋体门（Spirochaetes）含量最高，达27.78%。

细菌在纲水平的物种分布（图4）显示，γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）是相对丰度最高的菌群，在沉积物N样品中含量高达65.80%；其次为β⁃变形菌纲（Betaproteobacteria），在木材w样品中含量为43.50%；其他丰度较高为螺旋菌纲（Spirochaetes）、α⁃变形菌纲（Alphaproteobacteria）和δ⁃变形菌纲（Deltapeoteobacteria）、芽胞杆菌纲（Bacilli）、厌氧绳菌纲（Anaerolineae）、酸杆菌纲（Acidobacteria）和黄杆菌纲（Flavobacteria）。

在属的水平上（图5），优势菌属为嗜冷杆菌属（Psychrobacter），在沉积物N样品中相对丰度高达63.39%；假单胞菌属（Pseudoalteromonas）在S4inner样品中相对丰度为19.01%，在木材W样品中占7.41%；铁氧化细菌属（Ferritrophicum）在木材W样品中占8.38%；Amphritea在S4inner样品中占7.09%。其他还有螺旋菌属（Spirochaeta）、脱硫杆菌属（Desulfurivibrio）、Candidatus_Parvarchaeum、屈挠杆菌属（Flexibacter）、硝化细菌属（Thauera）和酸杆菌属（Actibacter）。图4只显示前20位占优势的菌属，实际上除了前面几种丰度百分比相对比较高外，10位之后的多数菌属丰度小于1%。图中大面积的灰色区域是含量更低的，甚至未知的菌属。

2.4 细菌群落结构相似性比较

PCoA图（图6）中四个木材样品（S4outer、S4inner、N13outer、N13outer）的矩阵距离很近，说明这些样品具有相似的细菌群落组成。海底沉积物泥样N与脱盐后的木材样品W矩阵距离较远，与四个木材样品也相距很远，这结果显示这些样品之间细菌群落结构组成相差较大。

3 讨 论

本研究利用Illumina Miseq测序平台对从广东省东端南澳岛三点金位置“南澳Ⅰ号”明代古沉船遗址打捞的古船木样品以及遗址处的海底沉积物样品进行了原核微生物群落特征和多样性的初步研究，列出了古船木以及沉积物中微生物门、纲、目、科、属不同分类等级上的优势群落类型和相对丰度。虽然本次研究所采集船木样本的数量有限，但是高通量测序技术的应用为研究海洋沉船原址中饱水木材样品的微生物多样性以及微生物对木材的降解积累了一定的经验和新的技术支撑。

样品采集于南海海洋环境中，测试结果中N13outer样品涵盖了多至48门、129纲、267个目、423科和733属，其他样品也测试出300至600余属，由于不同样品中细菌种群还存在着差异，因此该沉船木材样品中的细菌具有非常高的生物多样性。此外，海洋出水木材样品中原核微生物多样性与海洋沉积物中原核微生物多样性在门分类水平上存在着很大的相似性。木材样品中细菌的群落主要为变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、螺旋体门、厚壁菌门、酸杆菌门、奇古菌门、浮霉菌门、广古菌门和硝化螺旋菌门等。这些菌群均都在南海海洋环境中发现，且存在着较大的优势^［16］。

饱水木材在深海环境中主要以细菌降解为主，结构上木材细胞壁的纤维素、半纤维素、木质素均是细菌的主要碳源。这些细菌以二种方式腐蚀降解木材，一种是侵蚀细菌（erosion bacteria，EB），在细胞壁的腔体表面形成腐蚀槽或凹槽；一种是隧道细菌（tunneling bacteria，TB），除去细胞壁中的多糖成分和部分木质素，使木材变软变黑；隧道细菌还可导致细胞壁空腔。这两类细菌相互配合最终导致木材的降解腐蚀^［7，17］。欧洲已经报道了很多木材腐蚀的侵蚀细菌，常见的有分解纤维素的需氧菌，如噬细胞菌属（Cytophaga）和纤维弧菌属（Cellvibrio）；厌氧菌如梭菌属（Clostridium），或者无处不在的芽胞杆菌属（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）和螺旋菌（Spirillum）^［18~20］。Landy^［11］等利用DGGE方法研究108个欧洲不同国家、不同年代（70至1900年前）、不同树种（橡木、白杨、松木、银杉、云杉）的出水木材，发现引起出水木材腐蚀的菌群主要属于噬细胞菌⁃黄杆菌聚集体。本次结果中发现N13inner、N13outer、S4inner和S4outer 4种木材样品中的主要菌群是假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、螺旋体菌属（Spirochaeta）、单胞菌属（Pseudomonas）、酸杆菌（Actibacter），这与国外报道的结果类似，这些菌群都以纤维素为碳源生存，且多为厌氧菌，在海洋中广泛存在，它们的代谢生长造成木材的缓慢降解。

从PCoA结果显示，虽然都是木材样品，但脱盐后的木材W样品与直接从海洋中取样的4种木材样品的细菌群落存在显著差异，与海洋沉积物N的细菌群落也不相同。脱盐木材W样品中铁氧化细菌属（Ferritrophicum，8.38%）和脱硫菌属（Desulfurivibrio，5.27%）占优势，其他5个样品中这两种菌属的含量都很低，这可能是木材W样品从海水中打捞出水后，脱盐过程为富氧的淡水环境，木材内部发生了一系列的化学反应，木材中的菌群也随之发生了显著的变化。铁氧化细菌（Ferritrophicum）属于β⁃变形菌（Betapropeobacteria），为嗜中性微好氧铁氧化菌，生活于淡水，能够将二价态的铁离子氧化成三价的铁化合物。脱硫菌（Desulfurivibrio）在有氧的条件下与硫化合物的氧化还原有关。铁是一种分布比较广泛的金属元素，一般以二价态存在于缺氧的水环境中，一旦暴露于空气中，极易氧化成三价态。硫也主要以硫酸盐、硫酸盐矿物和硫化物形式存在于海水中，硫酸盐在无氧条件下被硫酸盐还原菌还原成H₂S，继而与海洋中的铁生成黄铁矿。此外，海洋中还存在一些有机态的硫。因此，所有海水打捞的有机质文物几乎都会有硫铁化合物的沉积，特别是黄铁矿以及有机态的硫结合物。无氧环境下，脱硫杆菌可将硫化合物转化为H₂S，有氧的环境下继而氧化成硫酸，这个过程将引起木材的酸化，加速木材的降解劣化。木材中铁硫化合物导致木材酸化的问题是近几年海洋饱水木材保护中的一个重要关注点^［21］，这个过程主要是因为铁硫循环引起的，而铁氧化菌、脱硫杆菌在这一化学过程中起重要作用。本次研究结果中脱盐后的木材样品含有大量的铁氧化细菌和脱硫菌群也再次证明这一点，因此在木材脱盐保护中，可以从微生物角度来监测或者考虑去除铁硫等元素。

海洋环境中具有丰富的化学物质，是一个非常复杂的生态环境。尤其是沉船位于海底的沉积物中，各种的环境因子、生物因子相互作用，导致船木样品中的微生物群落存在着丰富的多样性。船木样品中还发现了丰度较高的奇古菌门和广古菌门。这两类细菌都属于古菌，古菌是海洋微生物群落中的重要组成部分，广泛分布于海洋环境中，在海洋生物地球化学循环中占有重要的地位。奇古菌门主要在氮的循环起重要作用，广古菌门与海洋中甲烷的代谢有关。图5中反硝化菌（Thauera）（1.66%）亚硫酸盐杆菌（Sulfurimonas）（1.16%）和海杆菌（Marinicella）（1.01%）这些菌群会涉及到海洋环境的氮的代谢过程中，包括固氮作用、硝化作用、氨化作用和反硝化作用。这些菌群或许不会引起出水木材的降解，但引起木材腐蚀的侵蚀细菌并不是单独存在，都是依附于整个微生物大生态菌群中共存。因此，未来研究的主要问题除了知道哪种菌群对木材的降解劣化负责，哪种对其它过程负责（例如，硫和铁的循环），寻找关键的影响饱水木材劣化的菌群，还要更关注微生物的整体生态群落的平衡以及环境的影响。

本研究结果虽然检测出了大量的细菌种类，但是仍然有更多的物种还未知，甚至已知的菌群占的比例也很低，例如，样品S4outer在属水平上只有3.2%是可测到的已知菌属，N13inner 为5.58%，N13outer 为12.12%，S4inner为35.58%，W为29.83%等，那些未检出的都是比对已知细菌的同源性低于97%的，推断可能是些未知的微生物。因此，研究饱水木材中的微生物多样性是一项长期复杂的工作，木材中的菌群并不是一成不变的，会因样品不同、环境的差异而发生变化，如本次研究检测的结果与 “南海Ⅰ号”古沉船中菌群的群落，在门的分类上相似，在属分类上还是存在着一些差异，这可能是两艘沉船所处的海域环境、以及沉船的年代等存在差异的结果。总之，关注饱水木材中菌群的动态变化、可及时防止因微生物菌群的生态平衡变化导致的木材进一步劣化，将有助于更好的保护这些出水木质文物。

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基金资助

广东省文化繁荣发展专项资金(粤财教〔2018〕197号)