草酸二甲酯对小鼠亚急性吸入毒性的实验研究

Study on subacute inhalation toxicity of dimethyl oxalate in mice

摘要

为了研究草酸二甲酯吸入染毒对小鼠的急性毒性，观察吸入染毒后小鼠活动状况、记录心电图、计算LD₅₀，实验结束后取血、检测血液学、血液cTnI和生化指标；取脏器，计算脑、心、肝、脾、肺、肾、卵巢、睾丸、附睾脏器系数，观察其病理组织学改变。结果显示，小鼠吸入草酸二甲酯后出现抽搐、烦躁不安、心电图异常等中毒反应，LD₅₀为2.065 4×10^-4 g/cm³，脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢脏器系数明显升高，血液学、血生化指标和cTnI水平出现了异常变化，与对照组比较具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；心、肺、肝、小肠和肾组织出现了严重受损。由此可见，草酸二甲酯吸入染毒具有较强的毒性，可引起小鼠心电图、血液中cTnI水平、血液学和血生化指标异常改变，可导致心、肺、肝、小肠和肾脏出现病变。本实验为乙二醇合成过程中产生的碳酸二甲酯职业危害防治提供实验依据。

Abstract

To study the acute toxicity of dimethyl oxalate inhalation in mice， the activity of mice after inhalation was observed， ECG was recorded and LD₅₀ was calculated. After the experiment， the blood samples were taken to detect hematology， cTnI and biochemical indexes. The coefficients of brain， heart， liver， spleen， lung， kidney， ovary， testis and epididymis were calculated. After inhalation of dimethyl oxalate， mice developed convulsions， restlessness， abnormal ECG and other toxic reactions， LD₅₀ was 2.0654×10^-4 g/cm³. The organ coefficients of brain， heart， liver， spleen， lung， kidney， testis and ovary were significantly increased， hematology， blood biochemical indexes and cTnI levels showed abnormal changes， and there were significant differences compared with the control （P<0.05 or P<0.01）. The heart， lung， liver， small intestine and kidney were severely damaged. The inhalation of dimethyl oxalate has strong toxicity， which can cause abnormal changes of ECG， cTnI level in blood， hematology and blood biochemical indexes in mice， and lead to pathological changes of heart， lung， liver， small intestine and kidney. This experiment provides experimental basis for the prevention and control of occupational hazards of dimethyl carbonate produced in the process of ethylene glycol synthesis.

Graphical abstract

关键词

草酸二甲酯 / 小鼠 / 急性毒性

Key words

dimethyl oxalate / mouse / acute toxicity

0 引 言

乙二醇（ethylene glycol， EG）是一种重要的有机化工原料，广泛应用于聚酯纤维等重要化工产品的生产^［1］。由于EG市场的持续看好，有力地推动了EG产业的迅猛发展^［2，3］。但是，无论是使用乙烯法还是草酸酯法合成EG，均不可避免地会产生草酸二甲酯、亚硝酸甲酯等中间产物和碳酸二甲酯、草酸单乙酯等副产物。由于它们多以气体形式存在于工作场所的空气中，自EG工业化生产以来，我国就不断有职业性中毒事故的报道。草酸二甲酯作为EG合成过程中的重要中间产物，在我国的《工作场所有害因素职业接触限值第1部分：化学害素》（GBZ2.1⁃2007）^［4］中已列出了相关EG产品（如乙二醇二硝酸酯等）的空气中容许浓度和职业接触限值，但是草酸二甲酸酯并未列出，而它恰恰是合成气制EG过程中重要的副产物和职业性化学有害因素。近十年来，职业性草酸二甲酯亚急性中毒所致肾损伤成为关注焦点，但其毒性机制尚未完全阐明。对草酸二甲酯中毒的防治主要以血液净化联合抗氧化应激、护肝、营养支持等对症治疗来恢复肝肾功能^［5~8］。因此，迫切需要了解草酸二甲酯对接触者可能造成的伤害。当前国内外尚未制定草酸二甲酯的职业接触限值标准，对其毒理学的基础研究鲜见涉足。本文对草酸二甲酯吸入染毒的急性毒性进行了初步研究，为深入开展其毒性机制的研究和开展EG生产过程中的职业防护提供参考。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

草酸二甲酯由中石化湖北化肥分公司提供。血常规试剂（拜耳医药保健有限公司）；肌钙蛋白I（cTnI，南京建成生物工程研究所）；生化试剂：肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes， CK⁃MB）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性和血糖（glucose， GLU）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine， CREA）、总胆固醇（cholesterol，CHOL）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、总蛋白（total protein， TP）等购于北京利德曼公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 动物

体质量为18~22 g的SPF级昆明小鼠，雌雄各半（体质量无显著性差异），由三峡大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2017⁃0061。实验小鼠饲养于SPF屏障系统中，饲养温度为20~22 ℃，相对湿度40%~70%，12 h/12 h昼夜明暗交替。实验研究按照《化学品毒性鉴定技术规范》^［9］进行操作并在三峡大学伦理委员会指导下进行。

1.3 仪器

电子天平（梅特勒⁃托利多）；电子秤（上海力衡）；多导生理记录仪（美国BIOPAC）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；全自动生化分析仪（美国西门子）；血细胞分析仪（美国雅培）；多功能酶标仪（瑞士TECAN）；超薄切片机（奥地利莱卡）；显微镜（日本Nikcon）；脱水机、显微图像分析系统（德国Leica）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组和染毒处理

将120只实验小鼠随机分为对照组和A、B、C、D、E共5个草酸二甲酯剂量组，根据预实验结果将草酸二甲酯的梯度依次设置为12.42、15.52、19.40、24.26和30.32 g，每组20只，雌雄各半。实验前禁食12 h，不禁水。实验时分别依次将各组小鼠置于吸入染毒装置内（体积为97.5 L），染毒2 h后，移至观察室观察小鼠一般状况。

1.4.2 一般状况观察

观察动物中毒表现、死亡数及死亡时间，将濒临死亡动物（主要表现为体重下降、丧失食欲、虚弱及无法自行摄食、饮水等特征）立即取出、记录其心电图（ECG）后取血，进行血液学检测；然后摘取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大小肠、子宫、卵巢、睾丸等脏器，观测其病理变化，并计算脏器系数，其计算公式为：脏器系数=器官质量（mg）/体质量（g）。

1.4.3 心电图检测

小鼠吸入染毒草酸二甲酯2 h后，用乙醚麻醉、记录实验小鼠ECG指标变化。

1.4.4 血液学指标检测

观察小鼠7 d后，取血、检测血液中白细胞（white blood cells， WBC）、红细胞（red blood cells， RBC）、血红蛋白（hemoglobin， HGB）、淋巴细胞（lymphocytes， LYM）比率、嗜酸性粒细胞（eosinophagocytes， EOS）比率、嗜碱性粒细胞（basophilic granulocytes， BASO）比率、单核细胞（monocytes， MONO）比率及血小板（platelets， PLT）/中性粒细胞（neutrophils， NEU）比率。

1.4.5 血液cTn和生化指标检测

分离血清、检测血液中cTnI、CK⁃MB、AST、ALT、LDH活性和GLU、TBIL、TP、ALP、CHOL、BUN及CREA含量。

1.4.6 组织病理学苏木素⁃伊红（HE）染色

解剖将脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大小肠、子宫、卵巢、睾丸取出后，用多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片和HE染色后，在光学显微镜下观察组织形态学。

1.4.7 数据统计分析

实验数据用（均数±标准差）（\overline{x}±s）表示，在SPSS 21.0统计软件包上进行分析，以单因素方差分析进行多组间差异的比较，以Dunnett⁃t检验比较两组间均数的差异；P<0.05被认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 草酸二甲酯染毒后小鼠一般情况

草酸二甲酯30.32 g组小鼠出现抽搐、烦躁不安等中毒反应，并在2 h内全部死亡；24.26 g和19.40 g组也出现痉挛、烦躁不安等中毒反应，给药2 h后各死亡2只；15.52 g组在染毒2 h内虽有上述中毒反应，但无小鼠死亡，未死亡小鼠约在1 h后恢复自主活动。吸入染毒草酸二甲酯LD₅₀为2.0654×10^-4 g/cm³，95%置信区间为1.759×10^-4 g/cm³~2.441×10^-4 g/cm³ （表1）。

2.2 草酸二甲酯染毒后对小鼠ECG的影响

草酸二甲酯染毒2 h后，小鼠心率明显升高、P⁃R间期（心房开始除极到心室开始除极的时间）和QRS波（反映左、右心室除极电位和时间的变化，第一个向下的波为Q波，向上的波为R波，接着向下的波是S波）时限明显延长、J点（心电图上QRS波群与ST段交界处一个突发性的转折点，它标志着心室除极的结束，复极的开始）明显上移，与正常组比较具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且呈明显的量效关系（表2）。

2.3 草酸二甲酯染毒后对小鼠血液中血液学及生化指标的影响

草酸二甲酯染毒组中小鼠血液中的CK⁃MB、LDH、ALT、ALT活性、cTnI、TBIL、TP、ALP、BUN、CREA含量、WBC、LYM、EOS、BASO、MONO数目均明显升高，RBC、PLT、NEU数目和HGB含量明显降低，与对照组小鼠比较具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且呈明显的量效关系（表3~5）。

2.4 草酸二甲酯染毒后对小鼠脏器系数的影响

草酸二甲酯染毒组小鼠脑、心、肝、肺、肾等脏器系数均明显升高，与对照组比较具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且呈明显的量效关系，其余脏器系数未见有明显改变（表6）。

2.5 草酸二甲酯染毒后对小鼠脏器组织形态学的影响

2.5.1 草酸二甲酯染毒后对小鼠肺组织形态学的影响

对照组小鼠肺泡上皮细胞结构完整、纤毛排列整齐。草酸二甲酯染毒后可见小鼠肺泡上皮细胞充血水肿，并可见炎性浸润，且随着草酸二甲酯染毒剂量增加损伤更为严重（图1）。

2.5.2 草酸二甲酯染毒后对小鼠心脏组织形态学的影响

对照组小鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐、结构清楚，胞核清晰完整；草酸二甲酯染毒后可见心肌凋亡坏死、心肌纤维排列紊乱、胞核破碎溶解，且随着草酸二甲酯染毒剂量增加损伤更为严重（图2）。

2.5.3 草酸二甲酯染毒后对小鼠肝组织形态学的影响

对照组小鼠可见肝细胞呈索状，围绕中央静脉呈放射状排列、肝血窦结构规整、胞核清晰完整；草酸二甲酯染毒后可见肝细胞排列紊乱、呈片状坏死、胞核破碎溶解，且随着草酸二甲酯染毒剂量增加损伤更为严重（图3）。

2.5.4 草酸二甲酯染毒后对小鼠小肠组织形态学的影响

对照组小鼠上皮细胞结构完整、细胞间连接紧密、杯状细胞及腺体排列整齐；草酸二甲酯染毒后可见上皮细胞充血水肿、且排列杂乱，杯状细胞及腺体减少，且随着草酸二甲酯染毒剂量增加损伤也趋于严重（图4）。

2.5.5 草酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肾脏组织形态学的影响

对照组小鼠肾小管上皮细胞排列整齐规则，肾小球结构正常；草酸二甲酯染毒的小鼠可见其肾小管上皮细胞排列紊乱、呈片状坏死、肾小球结构紊乱，且随着草酸二甲酯染毒剂量增加损伤更为严重（图5）。

3 讨 论

3.1 草酸二甲酯心肌毒性分析

cTnI和CK⁃MB是临床诊断心肌损伤的重要标志物^{［10，11］}。正常情况下，血液中cTnI和CK⁃MB活性较低；当心肌细胞遭受到化学、生物或缺血、缺氧刺激时，心肌细胞膜结构受损，使得胞浆内cTnI和CK⁃MB迅速释放入血液，进而导致血液中cTnI和CK⁃MB水平异常升高^{［12，13］}；此外，在心肌损伤病情未得到改善或者加重时，血液中cTnI和CK⁃MB也会处在高水平状态。因此，通过分析血液中cTnI和CK⁃MB水平可判断心肌损伤程度、也可以用来预测治疗效果^{［14，15］}。在实验中我们发现，小鼠用草酸二甲酯吸入染毒后血液中CK⁃MB和cTnI含量明显升高，与正常组比较具有显著性差异，此结果与ECG异常变化和心脏脏器系数升高，心肌凋亡坏死、心肌纤维排列紊乱、胞核破碎溶解的形态学损伤结果相一致。

3.2 草酸二甲酯肝脏毒性分析

AST和ALT是评估肝细胞损伤最为敏感和特异的指标^［16］。当肝脏受到化学性等损伤时，肝细胞膜的通透性明显增加，原来存在于肝细胞胞浆内AST和ALT就会快速释放入血液，使得血液中AST和ALT水平快速升高^［17］；此外，血液中LDH、ALP主要来自肝脏，它们在肝细胞受损时，也会通过受损的细胞膜释放进入血液中^{［18，19］}。本研究结果显示，小鼠用草酸二甲酯吸入染毒后肝脏脏器系数高于正常组，血液中AST和ALT、LDH和ALP活性也均高于正常组，提示草酸二甲酯具有肝脏毒性，可导致肝细胞排列紊乱、呈片状坏死、胞核破碎溶解等器质性改变和肝功能受损。

3.3 草酸二甲酯肾脏毒性分析

BUN和CREA是人体蛋白质代谢的主要终末产物，主要通过肾脏排泄。当肾脏受到化学、生物等损伤时，会导致滤过能力下降，进而引起血液中BUN、CREA迅速升高^{［20，21］}；因此，通过分析血液中BUN、CREA可判断肾脏损伤程度、预测治疗效果。在临床报道的急性草酸二甲酯中毒的病例中，急性肾功能衰竭为其主要表现之一^［5］。这一点与我们的实验结果相一致。在实验中，我们发现草酸二甲酯染毒小鼠的肾脏脏器系数、血液中BUN、CREA含量较正常组明显升高，提示草酸二甲酯具有较强的肾脏毒性；肾脏组织形态学分析也进一步证实染毒后的小鼠肾脏肾小管上皮细胞出现了排列紊乱、呈片状坏死、肾小球结构紊乱。以上结果也与刘鲁川等^［6~8］报道的急性草酸二甲酯中毒患者肾功能进行性恶化、肾活检显示急性肾损伤及草酸盐晶体沉积的结果和文献报道一致^［22］。

3.4 其他器官毒性分析

在实验中，还发现草酸二甲酯染毒的小鼠小肠上皮细胞出现了充血水肿、且排列杂乱，杯状细胞及腺体减少等病理性损伤。我们推测该损伤因草酸二甲酯经肺吸入进入血液循环后所导致，可能也证实小肠也可能是其损伤的靶器官之一。此外，我们还发现血液中WBC、LYM、EOS、BASO、MONO、RBC、PLT、NEU数目和HGB含量较正常组也均出现了异常改变。我们推测草酸二甲酯可能是对血液系统造成伤害。

综上所述，草酸二甲酯吸入染毒具有较强的毒性，可引起实验小鼠ECG和血液学指标异常改变，可导致心、肺、肝、小肠和肾脏出现病理学改变。本实验为EG合成过程中产生草酸二甲酯中间产物的职业危害防治提供实验依据。

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基金资助

中国石油化工股份有限公司湖北化肥分公司合作项目(SDHZ2019079)

三峡大学硕士学位论文培优基金(2020SSPY144)

三峡大学硕士学位论文培优基金(2019SSPY159)