三种乌贼内骨骼生化成分研究

Biochemical components of the cuttlebone of three species of cuttlefish

摘要

曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）和金乌贼（Sepia esculenta）的内骨骼称为海螵蛸，可用于制酸、止血等。通过对曼氏无针乌贼、金乌贼和虎斑乌贼（Sepia pharaonis）内骨骼生化成分的比较，有望实现传统中药海螵蛸原料质量的提升和替代。分别使用烘干干燥法、高温灼烧法、凯氏定氮法、索氏提取法、酸碱浸泡法、茚三酮柱后衍生离子交换色谱法、离子发光色谱法检测水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、粗甲壳素、氨基酸及矿物质。结果显示：三种内骨骼营养成分中，虎斑乌贼水分和粗蛋白含量最高，分别为（2.52±0.16）%和（3.43±0.10）%；金乌贼灰分和粗脂肪含量最高，分别为（94.7±0.26）%和（0.24±0.04）%；甲壳素含量最高的为曼氏无针乌贼内骨骼，为（9.48±0.36）%，约为其他两种的1.50倍。三种乌贼内骨骼共检出15种氨基酸，其中必需氨基酸（EAA）7种，半必需氨基酸（HEAA）1种，非必需氨基酸（NEAA）7种，三种乌贼骨的EAA/TAA为44.64%~47.09%，符合FAO/WHO中对于蛋白质EAA/TAA的理想评定标准。金乌贼内骨骼的钙含量最高（3.93×10⁵ mg/kg）、曼氏无针乌贼的钠含量最高（1.02×10⁴ mg/kg）、虎斑乌贼的钾含量最高（589.5 mg/kg）。可见三种乌贼内骨骼均是低脂肪、高甲壳素、高矿物质的中药。虎斑乌贼内骨骼蛋白和灰分营养成分含量较为丰富，是否可以作为传统海螵蛸的替代品，值得进一步探讨。

Abstract

The cuttlebone of Sepiella maindroni and Sepia esculenta is called cuttlebone， which can be used for acid suppression and hemostasis. By comparing the biochemical components of the cuttlebone of S. maindroni， S. esculenta and S. pharaonis， it is expected to improve and replace the quality of cuttlebone raw materials of traditional Chinese medicine. Moisture， ash， crude protein， crude fat， crude chitin， amino acids and minerals were detected by drying method， high temperature ignition method， Kjeldahl method， Soxhlet extraction method， acid⁃base soaking method， ninhydrin post⁃column derivatization ion exchange chromatography， and ion luminescence chromatography， respectively. S. pharaonis had the highest moisture and crude protein contents， which were （2.52±0.16）% and （3.43±0.10）%， respectively. The highest ash （94.70±0.26）% and crude fat contents （0.24±0.04）% were found in S. esculenta. The highest chitin content was found in the cuttlebone of S. maindroni （9.48±0.36）%， which was about 1.50 times higher than the other two species. A total of 15 kinds of amino acids were detected in the three cuttlebones， including 7 kinds of essential amino acids （EAA）， 1 kind of semi⁃essential amino acids （HEAA） and 7 kinds of non⁃essential amino acids （NEAA）. The EAA/TAA of the three cuttlebones ranged from 44.64% to 47.09%， which met the ideal evaluation criteria for protein EAA/TAA in FAO/WHO. The Ca²⁺ content of S. esculenta was higher （3.93×10⁵ mg/kg）， the Na⁺ content of S. maindroni was the highest （1.02×10⁴ mg/kg）， and the K⁺ content of S. pharaonis was the highest （589.50 mg/kg）. All three cuttlebones are potential traditional Chinese medicines with low fat， high chitin， and high minerals. The cuttlebone of S. pharaonis is rich in ash and crude protein， and whether it can be used as an alternative to traditional cuttlebone needs further exploration.

Graphical abstract

关键词

曼氏无针乌贼 / 金乌贼 / 虎斑乌贼 / 内骨骼

Key words

Sepiella maindroni / Sepia esculenta / Sepia pharaonis / cuttlebone

0 引 言

《中国药典》将曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）和金乌贼（Sepia esculenta）内骨骼称为海螵蛸，气微腥，味微咸，新鲜时为白色，存放易变为微黄色，具有收敛止血、涩精止带、制酸止痛、收湿敛疮等医学作用^［1］。一定剂量的海螵蛸具有凝血活性，且能缩短凝血时间^［2］，治疗月经过多、崩漏有很好的效果^［3］，能有效地减轻胃黏膜损伤和促进溃疡愈合^［4，5］。海螵蛸还可以治疗多种原因引起的皮肤溃烂，改善创面微循环，明显缩短治疗周期^［6］。海螵蛸作为一味传统中药，疗效稳定，价格低廉易取得，一直被民众所认可。目前对海螵蛸的研究多数集中在其临床应用^［4~6］、药理与毒理实验研究^［7~9］、作为组织工程支架材料等医学研究^［10］，在化学成分（碳酸钙^［11］、微量元素^［2］、氨基酸^［11］、多糖^［12］）也有部分研究。对于以上研究，海螵蛸来源仅是曼氏无针乌贼与金乌贼的内骨骼，对虎斑乌贼（Sepia pharaonis）内骨骼的报道较少。但近年来虎斑乌贼已形成规模化苗种繁育与养殖，产量逐年升高，研究发现虎斑乌贼内脏多糖具有天然抗氧化活性和吸湿保湿性能，在功能性食品、药品和化妆品领域具有一定的应用潜力^［13］。因此，应进一步对虎斑乌贼其他部位，如其内骨骼的应用方面进行研究，尝试其内骨骼能否作为中药源。本文分别分析乌贼目（Sepioidea）乌贼科（Sepiidae）乌贼属（Sepia）的金乌贼与虎斑乌贼以及同科无针乌贼属（Sepiella）的曼氏无针乌贼内骨骼，旨在清晰了解各个种类内骨骼的生化成分，比较其在水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、粗甲壳素、氨基酸、矿物质方面的差异，不同成分表现的生物学意义，精确利用其功能及疗效，实现传统中药海螵蛸原料质量的提升和替代，为其他药物开发及医学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

曼氏无针乌贼、金乌贼、虎斑乌贼分别采自表1所示地点，均为新鲜成体乌贼，取下内壳后用蒸馏水洗净，自然风干（如图1A~1C），放入干燥器中干燥备用；乙酸镁；硫酸；石油醚；过甲酸；溴化氢；氢氧化钠；盐酸（实验室常用试剂均为分析纯）。

1.2 主要仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司 DHG⁃9246A）、微波马弗炉（上海屹尧仪器科技发展有限公司 WN⁃2）、凯氏定氮仪（Foss kjeitec 8400）、索氏提取仪（Foss soxtec 8000+）、全自动氨基酸分析仪（Hitachi L 8900）、电感耦合等离子体发射光谱（美国安捷伦公司 7900）、分析研磨机（IKA A11⁃2900025）、真空玻璃干燥器（B⁃004806）等。

1.3 实验方法

备用的乌贼样品通过实验专用粉碎机磨碎，过200目筛，分别采用105 ℃烘箱干燥法（GB T 5009.3⁃2016）^［14］、（550±25） ℃高温灼烧法（GB T 5009.4⁃2016）^［15］、凯氏定氮法（GB T 5009.5⁃2016）^［16］、索氏提取法（GB T 5009.6⁃2016）^［17］、茚三酮柱后衍生离子交换色谱法（GB T 5009.124⁃2016）^［18］、离子发光色谱法（GB T 5009.268⁃2016）^［19］检测水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和矿物质的含量。

粗甲壳素含量的测定^［20］用蒸馏水清洗三种内骨骼表面的粘液，在40 ℃温度下烘干2 h称重记为M₁，放入平整的塑料容器，先加入2~3 mol/L氢氧化钠溶液浸没内骨骼，后逐次升高盐酸浓度（3~4 mol/L），反复浸泡3~5次，将酸液倒掉，用蒸馏水冲洗干净，40 ℃温度烘干，记为M₂，粗甲壳素含量（%）=M₂/M₁×100%。

1.4 数据处理

所有试验数据均以平均值±标准差（mean± SD）表示，采用Excel 2019进行统计与整理；用SPSS22.0软件进行统计分析，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示无显著差异。

2 结果与分析

2.1 三种乌贼内骨骼基本成分

三种乌贼内骨骼与其他鱼骨的水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白基本成分如表2所示。乌贼骨水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量最高的依次为：虎斑乌贼、金乌贼、虎斑乌贼、金乌贼。粗甲壳素含量分别为：曼氏无针乌贼内骨骼（9.48±0.36）%、金乌贼内骨骼（6.25±0.21）%、虎斑乌贼内骨骼（6.36±0.27）%，在相同处理条件下，曼氏无针乌贼的内骨骼甲壳素显著高于另两种内骨骼，约为另两种乌贼的1.50倍。

2.2 三种乌贼内骨骼氨基酸种类及含量

表3为三种乌贼内骨骼氨基酸测定结果，曼氏无针乌贼、金乌贼、虎斑乌贼内骨骼总氨基酸分别为2.11%、1.89%、2.24%，占其总蛋白含量的70.10%、56.59%、65.31%。三种内骨骼中含量前五种氨基酸均一致，缬氨酸（Val）含量丰富，分别占总氨基酸含量的26.07%、25.93%、25.00%，其次为半胱氨酸（Cys）（13.74%、13.28%、14.29%），天冬氨酸（Asp）（9.48%、9.00%、9.82%），谷氨酸（Glu）（8.53%、7.41%、8.93%），丝氨酸（Ser）（7.11%、6.35%、6.70%），含量最少的为蛋氨酸（Met）（1.90%、2.17%、1.79%）。虎斑乌贼中缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量最高，曼氏无针乌贼与虎斑乌贼丝氨酸（Ser）含量高于金乌贼。

曼氏无针乌贼、金乌贼和虎斑乌贼三种内骨骼中呈味氨基酸占有一定比例，其中鲜味氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，二者总和分别占总氨基酸含量的18.00%、16.40%、18.75%；甜味氨基酸包括甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala），二者总和分别占总氨基酸含量的6.17%、9.52%、7.59%。

2.3 三种乌贼内骨骼矿物质

实验采用电感耦合等离子体发射光谱，对三种内骨骼的8种矿物质元素（Ca、Na、Sr、Fe、P、K、Mg、Zn）进行测定，其中常量元素5种，微量元素3种。结果表明（表4），曼氏无针乌贼、金乌贼、虎斑乌贼三种物种内骨骼矿物质元素虽然前三位排序顺序相同但含量差异显著，依次是Ca（3.43×10⁵±100 mg/kg、3.93×10⁵±1 000 mg/kg、3.44×10⁵±500 mg/kg）、Na（1.02×10⁴±50.0 mg/kg、7.59×10³±20 mg/kg、7.82×10³ mg/kg）、Sr（2.88×10³±90 mg/kg、2.38×10³±25 mg/kg、2.58×10³±30 mg/kg），而后5种元素含量高低的排列顺序略有差异，从整体看与前人的研究结果大致相同^［21］。此外，实验中共检测了内骨骼的三种微量元素，含量从高到低依次是Sr（2.88×10³±90 mg/kg、2.385×10³±25 mg/kg、2.58×10³±30 mg/kg）、Fe（97.90±0.50 mg/kg、786±16 mg/kg、246.50±0.50 mg/kg）、Zn（91.90±0.60 mg/kg、59.60±0.20 mg/kg、144±0.20 mg/kg）。

3 讨 论

3.1 三种乌贼内骨骼基本成分分析

分析结果显示，三种乌贼骨基本成分中灰分含量多达93%以上，最明显的特征是骨灰分含量远高于海水鲈鱼（68.16%）^［22］和金枪鱼（57.20%）^［23］，是淡水虹鳟（21.32%）^［24］的4倍以上，灰分中含有丰富的有益矿物质，Fe、P、K、Mg、Zn等含量丰富，特别是曼氏无针乌贼骨骼中Sr的含量高达2.88×10³ mg/kg，这可能是乌贼骨具有特殊的药用成分，并作为传统中药材的重要原因，三种乌贼骨甲壳素含量虽然低于小龙虾壳^［20］、蟹壳^［25］、南极磷虾^［26］中甲壳素含量，但是含量均高于6%，是第二大含量成分，具有调控营养物质代谢、促进生长、提高免疫能力等重要的作用^［27］。从虾、蟹壳中制备的甲壳素和壳聚糖，分子链之间以反平行式排列，具有较强的分子氢键，是α⁃结构；而乌贼骨和鱿鱼中，分子链之间以平行式排列，分子间作用力较弱，是β⁃结构^［28］。β⁃甲壳素对血小板有黏附作用、有优异的透光性与力学性能，因此将其应用在止血药材、材料等方面，具有相当大的潜力^{［29，30］}。甲壳素具有无毒、无抗原性和生物兼容性。甲壳素具有止血功能，利用此功能可以制备出创伤治疗中的止血材料^［31］，传统中医海螵蛸单味药及其复方制剂在临床大多用于产后血崩、便血、经期延长和崩漏等出血病症，并且取得良好的效果，如海螵蛸与蒲黄等联用则主要用于各种出血病症，有研究认为治疗出血症、带下病和崩漏等置信度均在80%以上，且治疗崩漏的效果最显著，支持度占8.46%^［32］，说明乌贼骨是一种富含矿物元素和甲壳素的传统中药材。

3.2 三种乌贼内骨骼氨基酸组成分析

三种内骨骼中均含有丰富的氨基酸，共检出15种氨基酸，其中金乌贼内骨骼总氨基酸含量与传统海螵蛸——金乌贼内骨骼^［11］研究结果相一致；虎斑乌贼内骨骼总氨基酸含量与成体虎斑内壳的氨基酸含量一致^［33］，但由于样品采样地点、生长季节、沉积能量和检测技术等的差异导致氨基酸种类略有差别；曼氏无针乌贼内骨骼总氨基酸含量未见报道，三种内骨骼计算的含量均占蛋白质含量的56%以上。根据FAO/WHO建议的理想模式，质量较好的蛋白质其氨基酸组成为EAA/TAA为40%左右，EAA/NEAA为60%以上^［34］。三种乌贼骨的EAA/TAA分别为46.45%、47.09%、44.64%，EAA/NEAA分别93.33%、96.74%、86.96%，接近或好于理想模式，即氨基酸组成及比例平衡效果非常好，必需氨基酸缬氨酸的含量最高，它可以为肌肉提供额外的能量产生葡萄糖，以防止肌肉衰弱，促进肝脏毒素的排出^［35］，因此乌贼内骨骼蛋白是优质的蛋白质。三种乌贼内骨骼氨基酸含量中，虎斑乌贼内骨骼的总氨基酸、必需氨基酸、呈味氨基酸含量均最多，作为与金乌贼同属的虎斑乌贼，对于其内骨骼的研究较少，之前曼氏无针乌贼与金乌贼的产量较高，而近年来虎斑乌贼在世界上首次实现该物种的规模化苗种繁育与养殖，产量逐年升高^［36］，虎斑乌贼具有个体大、生长快的特点，其内壳较大，根据本试验研究得到其内壳具有丰富的营养物质，因此虎斑乌贼内骨骼功能及药用价值有待进一步研究。

3.3 三种乌贼内骨骼8种矿物质元素含量分析

检测的三种乌贼内骨骼的8种矿物质元素中，Ca含量最高，海螵蛸为中医制酸良药，CaCO₃是中和胃酸的直接因素，与Ca含量同样密不可分^［4］，有研究发现1 g海螵蛸粉末约中和0.10 mol/L盐酸140 mL^［37］，有研究认为海螵蛸的凝血作用很可能与Ca含量有关^［38］。元素中Na含量高的原因可能是乌贼骨的内部分为若干规整的小气室，乌贼活体状态下，气室内包含气体和液体，乌贼通过改变它们的容量比来改变自身在水中的浮力^［39］，很可能由于小气室中的液体或有海水存留，从而导致Na的含量偏高。Na能促进人体的新陈代谢，作为电解物具有保持细胞内部水分的稳定与平衡功能。Sr有促进骨基质蛋白的合成和沉淀，促进成骨细胞分化和骨的生成，研究认为Sr在头足类耳石生物矿化过程中扮演重要角色^［40］，乌贼内骨骼的矿化过程很可能与耳石的矿化过程相近，Sr的含量高也是一个重要原因；Mg能调节体内多种酶，对骨生长与骨代谢有重要作用^［41］，这些元素的功能都有助于内骨骼发挥药效。虎斑乌贼同曼氏无针乌贼、金乌贼物质元素含量有差异但差别不大，8种元素含量基本处于其他二者的中间水平，甚至微量元素Fe、Zn高于其他二者，因此虎斑乌贼内骨骼也能起到传统海螵蛸的功效，成为海螵蛸的新药源。

《中国药典》把金乌贼和曼氏无针乌贼的内骨骼作为海螵蛸^［1］，没有提到虎斑乌贼内骨骼，目前常用的海螵蛸只是曼氏无针乌贼、金乌贼的干燥内壳。通过测定三种乌贼内骨骼的基本成分、粗甲壳素、氨基酸、矿物质的含量，表明生化组成存在一定的差异，本实验分析虎斑乌贼内骨骼具有与金乌贼和曼氏无针乌贼相同的成分，只是氨基酸总量、粗蛋白含量略高，粗脂肪、钙含量次之，矿物质中K、Zn含量略高，其余元素居中；有研究显示，虎斑乌贼内骨骼也有抗菌作用，只是与金乌贼和曼氏无针乌贼的内骨骼抑菌效果有差异^［42］。因此本研究推测成分不同有可能是造成抑菌效果差异的一个原因。由此可见，虎斑乌贼内骨骼具有金乌贼和曼氏无针乌贼同样的成分，具有抗菌效果，很可能会具有海螵蛸的功效，是潜在的海螵蛸药材来源，虎斑乌贼内骨骼的药理作用需要进一步研究，以便充分开发利用海洋生物资源。

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基金资助

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助

中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2020GH02)