北柴胡种子内生菌群落结构与多样性

Community structure and diversity of endophytes of Bupleurum chinense DC. seeds

摘要

为研究北柴胡种子内生菌的群落结构与多样性。采用Illumina Miseq高通量测序技术，分别对山西（BC_1）、黑龙江（BC_2）、河北（BC_3）和内蒙古（BC_4）的四个产地（4份）北柴胡种子的16S RNA V3⁃V4区和ITS1区扩增片段进行测序，并对内生细菌和内生真菌群落结构和多样性进行分析。结果表明，BC_3内生细菌与内生真菌丰富度与多样性最高，BC_4内生菌丰富度最低。4种不同产地北柴胡种子共有的内生细菌优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），占77.77%；内生真菌优势菌门为担子菌门（Basidiomycota），占67.82%。共有的内生细菌优势菌属为鞘脂单胞菌（Sphingomonas），占18.30%，内生真菌优势菌属为Papiliotrema（41.35%）。种水平内生真菌丰度水平较高的为金黄蝶形担孢酵母（Papiliotrema aurea），占38.67%；内生细菌丰度水平较高的为根球假单胞菌（Pseudomonas rhizosphaerae），占15.56%。在属水平上，4种不同产地北柴胡种子中内生细菌与内生真菌群落结构均有差异。北柴胡种子内生菌资源丰富，功能多样，对北柴胡种子萌发和生长发育具有重要影响。

Abstract

In order to analyze the species abundance and diversity of endophytes in Bupleurum chinense DC. seeds， the amplified fragments of 16S RNA V3⁃V4 region and ITS1 region of representative Bupleurum chinense DC. seeds from Shanxi （BC_1）， Heilongjiang （BC_2）， Hebei （BC_3） and Inner Mongolia （BC_4） were sequenced by Illumina Miseq high⁃throughput sequencing technique， and the community structure and diversity of endophytic bacteria and fungi were analyzed. The results showed that the richness and diversity of endophytic bacteria and fungi in BC_3 was the highest， while the richness of endophytes in BC_4 was the lowest. The dominant phylum of endophytic bacteria in Bupleurum chinense DC. seeds from four different habitats were Proteobacteria （77.77%）， and the dominant phylum of endophytic fungi were Basidiomycota （67.82%）. The dominant genus of endophytic bacteria was Sphingomonas （18.30%）， and the dominant genus of endophytic fungi was Papiliotrema （41.35%）. The high abundance of endophytic fungi was Papiliotrema aurea （38.67%） and the high abundance of endophytic bacteria was Pseudomonas rhizosphaerae （15.56%）. There were differences in the community structure of endophytic bacteria and fungi in the B. chinense DC. seeds from four different habitats at the genus level. The endophytes in the B. bupleurum DC. seeds are rich in resources and diverse in functions， which have an important impact on seed germination， growth and development.

Graphical abstract

关键词

北柴胡种子 / 内生菌多样性 / 高通量测序

Key words

Bupleurum chinense DC. seed / endophyte diversity / high⁃throughput sequencing

0 引 言

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）为《中国药典》规定的药材柴胡的基源植物之一。近年来，北柴胡野生资源量迅速减少，而栽培品生长年限较长，利用生物技术手段开发内生菌资源是解决供需矛盾的有效途径之一^［1］。北柴胡主要含有皂苷、多糖、黄酮等多种化学成分，具有抗癌、抗抑郁、抗炎、保护心脏、肝脏、肾脏等药理作用，在保护和提高人民健康方面发挥突出作用^［2~4］。北柴胡分布范围横跨亚热带、温带、寒温带，在中国主要分布在内蒙古、山东、甘肃和黑龙江等地区^［5，6］。由于地理生态因子复杂，不同地区柴胡种子具有不同的形态、生理性状和体内生态结构。

植物内生菌是指在植物萌发、生长、代谢、应对胁迫、成熟与凋亡过程中，能够与植物共同生存或者某一段时间定殖于植物中并且不会引起明显病害的微生物^［7］。内生菌在种子植物的生活史中扮演着重要的角色，探索种子和内生菌之间的有益相互作用是实施农业可持续发展、提高作物生产力的一种有效策略^［8，9］。近年来，微生物与植物生长和健康的关系越来越受到重视，但对种子相关微生物特别是药用植物种子内生菌的研究仍然有限。种子内生菌存在于植物早期的生长阶段，可产生各种植物激素、酶、抗微生物化合物和次生代谢物，有利于种子萌发和幼苗的建立^{［10，11］}。此外，具有有益特性的内生菌可以被植物选择，并且可以通过种子垂直传播到下一代，帮助下一代应对环境压力^{［12，13］}。

目前，Illumina Miseq高通量测序技术^［14］被广泛用于研究土壤^［15］、空气^［16］、水^［17］、肠道^［18］、种子^［19］内微生物群落的组成与多样性。本研究通过采用Illumina Miseq高通量测序和生物信息学分析技术，探索北柴胡种子内生菌的多样性。该研究为北柴胡种子提供内生菌数据支持，有利于研究人员开发有益的北柴胡种子内生菌资源，并控制潜在的有害内生菌，促进北柴胡种植业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 北柴胡种子采集

北柴胡种子样品的详细信息及编号如表1所示。实验所用的北柴胡种子均为栽培品，分别于2020年10月上旬采用五点取样法收集完成，并经山东省农业科学院生物技术中心通过分子鉴定为北柴胡种子。凭证标本存放于山东中医药大学标本室（SDCM）。

分别取四种北柴胡种子用水冲洗后再经过75%的酒精消毒30 s，2%次氯酸钠溶液消毒2 min，最后用无菌水漂洗3次，用最后一次的洗涤液涂布NA琼脂培养基，检测是否消毒完全，消毒完全的种子作为下一步实验样品。

1.2 DNA提取、PCR扩增

分别称取处理后的北柴胡种子样品5 g，采用Soil DNA试剂盒（Mo Bio Laboratories， Carlsbad， CA， USA）提取北柴胡种子基因组后，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。以上述DNA为模板，分别对各样品基因组16S rDNA V4-V5区和ITS1区进行PCR扩增。每个25 μL的体系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl₂、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 UKOD⁃Plus⁃Neo酶（TOYOBO）和10 ng模板。其中，引物分别为515F（5'⁃GTGCCAGCMGCCGCGGTAA⁃3'）、926R（5'⁃CCGTCAATTCMTTTGAGTTT⁃3'）和ITS1F（5'⁃CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA⁃3'），和ITS1R（5'⁃GCTGCGTTCTTCATCGATGC⁃3'）。第一轮PCR程序包括起始94 ℃ 2 min，然后30个循环（变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 45 s）最后72 ℃ 10 min。目的条带使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用QIAquick Gel Extraction Kit （QIA GEN）回收目的条带并进行定量检测，进一步使用磁珠纯化。纯化后的产物作为第二轮PCR模板进行扩增，扩增体系和程序同第一轮。检测合格的PCR产物使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。每一个样品二轮PCR扩增分别做三次重复，三次PCR扩增产物浓度调整为相同水平，等量混样送微基生物科技（上海）有限公司进行测序。

1.3 建库和测序

使用TruSeq DNA PCR⁃Free Sample Prep Kit建库，构建好的文库经过定量和文库检测合格后，在Illumina MiSeq平台（TinyGene biotechnology Co.， Ltd， China）上进行模式测序。

1.4 数据分析

基于条形码对原始fastq文件进行了多路分离。所有样品的配对端读取都通过Trimmomatic（版本0.35）来去除低质量的碱基对。使用Flash（Version 1.2.11）软件将配对的reads拼接成序列。采用Mothur（Version 1.33.3）对序列质量进行控制，得到最优序列。然后，采用UPARSE软件（usearch Version V8.1.1756，http：//drive5.com/uparse/）对OTU（操作分类单元）进行聚类。在聚类分析基础上，在门和属水平上对群落结构进行统计分析。

使用Mothur soft（Version 1.3.3）进行多样性分析。在上述分析的基础上，用R语言工具（Version 3.6.0）统计并绘制稀疏曲线、维恩图、群落结构直方图、相对丰度热图，并进行可视化处理。

2 结果与分析

2.1 Illumina

Miseq测序数据分析

经过高通量测序得到基于OTU的4个北柴胡内生菌的稀释曲线（图1）。结果显示，随着测序数量的增加，稀释曲线斜率逐渐降低，趋于平坦，且所有样品均已进入平台期，说明测序数量已经足够大，可以基本反映样品中绝大多数微生物信息。序列信息统计结果显示（表2），本次测序共得到四种不同产地柴胡种子内生细菌135 503个有效序列，118 188个优化序列，48 941 379个优化序列碱基和内生真菌共153 595个有效序列，150 221个优化序列，37 397 023个优化序列碱基。内生细菌优化序列长度范围为218~466 bp，内生真菌优化序列长度范围为200~356 bp，所有样本的有效序列数和优化序列数较相似。

2.2 内生菌OTU聚类分析

在97%的相似性水平下，4种不同来源的北柴胡种子内生细菌的OTUs数目在173~208之间（图2a）。其中，4种样品共有114个OTUs，BC_1、BC_2、BC_3和BC_4的特有OTUs所占比例分别为13.59%、19.12%、16.35%和9.25%。4种北柴胡种子内生真菌的OTUs数目在70~84（图2b）。其中，4种样品共有51个OTUs，BC_1、BC_2、BC_3和BC_4的特有OTUs所占比例分别为4.76%、2.85%、6.02%、9.75%。结果表明产地差异在一定程度上影响了种子内生菌的组成，并且北柴胡种子内生细菌的多样性较内生真菌丰富。

2.3 PCoA分析

通过Bray⁃Curtis法计算样本间的差异性，对4种不同产地的北柴胡种子内生菌群落组成进行基于OTU水平的PCoA分析。对内生细菌群落组成进行分析（图3a），第1主成分PC1和第2主成分PC2对样品的贡献率分别为61.22%、32.60%。在PC1的作用下，BC_3与BC_4的距离被拉开，表明BC_3（河北）与BC_4（内蒙古）北柴胡种子内生细菌差异性最大；对内生真菌群落进行分析（图3b），PC1和PC2对样品的贡献率分别为86.18%与13.61%，在PC1作用下BC_2与BC_3距离最大，表明BC_2（黑龙江）与BC_3（河北）内生真菌差异性最大。

2.4 Alpha多样性分析

Alpha多样性是对个体样本内生菌群落丰富度与多样性的分析，其中Chao和Ace指数反应群落丰富度，Shannon和Simpson指数反映群落多样性（表3）。4种北柴胡种子的覆盖度指数（Coverage index）均在0.99之上，表明测序数据足够反映内生菌群落多样性。对Chao和Ace指数比较分析，4种北柴胡种子样品内生细菌与内生真菌丰富度具有相同的趋势，即BC_3内生细菌与内生真菌丰富度最高，BC_4最低。对Shannon和Simpson指数比较分析，BC_3内生细菌与内生真菌多样性最高，BC_4内生细菌多样性最低，BC_2内生真菌多样性最低。综上，BC_3内生菌资源最为丰富多样。

2.5 内生菌群落结构组成分析

为了明确不同来源北柴胡种子内生细菌的群落结构，对门、属、种水平进行分析。从不同来源的种子中检测到内生细菌的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），占71.75%；放线菌门（Actinobacteria），占24.78%；内生真菌的优势菌门依次为担子菌门（Basidiomycota），占67.82%；子囊菌门（Ascomycota），占32.14%。在属水平上（图4），4种不同产地北柴胡种子检测到丰度在0.5%以上共23个细菌属和12个真菌属。热图可以通过颜色变化更好地反映内生菌群落的相对丰度层次。对4种北柴胡种子内生菌丰度水平整体进行分析，细菌优势属依次为鞘脂单胞菌（Sphingomonas），占18.30%；假单胞菌（Pseudomonas），占15.45%；短小杆菌（Curtobacterium），占14.98%；根瘤菌（Rhizobium），占10.96%；真菌优势属依次为蝶形担孢酵母属（Papiliotrema），占41.35%；线黑粉酵母属（Filobasidium），占19.31%；曲霉属（Aspergillus），占17.33%等。对4种不同产地来源北柴胡种子同种优势细菌属进行比较，BC_1的鞘脂单胞菌属丰度（20.95%）、BC_4短小杆菌属丰度（30.44%）、BC_3根瘤菌丰度（15.79%）分别在4种种子中处于最高。

对北柴胡种子优势真菌属进行比较，BC_2（54.10%）与BC_4（48.61%）蝶形担孢酵母属内生真菌丰度显著高于BC_1（33.16%）与BC_3（29.54%），而BC_1（22.35%）与BC_3（32.55%）线黑粉酵母属则显著高于BC_2（9.92%）与BC_4（12.43%）。综上所述，4种不同产地北柴胡种子内生菌优势菌种类相似，但丰度存在差异。

从可检测到的种水平内生菌分类来看（图5），内生真菌丰度水平较高的为金黄蝶形担孢酵母（Papiliotrema aurea），占38.67%；线黑粉酵母（Filobasidium magnum），占19.23%；多育曲霉（Aspergillus proliferans），占14.15%；4种北柴胡种子可检测到的内生细菌丰度水平较高的为根球假单胞菌（Pseudomonas rhizosphaerae），占15.56%。BC_2与BC_4的金黄蝶形担孢酵母水平较高，BC_1与BC_3的线黑粉酵母（Filobasidium magnum）水平较高，4种产地北柴胡种子内生菌种类组成具有较高相似性。

3 讨 论

3.1 高通量测序研究北柴胡种子内生菌的可行性

内生菌是植物内部环境的主力军，研究药用植物微生物的群落结构组成及其多样性，对揭示道地药材形成机制具有重要意义^［20］。本研究利用Illumina Miseq高通量测序技术对4种不同产地北柴胡种子的内生菌群落在门和属水平上的相对丰度与绝对定量相结合分析，得到内生细菌16S rDNA V4-V5区135 503个有效序列，共791个OTUs，内生真菌ITS1区153 595个有效序列，共320个OTUs，客观、真实、全面地反映了北柴胡种子内生菌菌群结构及其多样性。基于各产地OTU数量及其相对丰度，说明北柴胡种子内生菌不仅数量众多，而且种类也很丰富。

3.2 北柴胡种子内生菌群落特异性

北柴胡种子内生细菌的优势菌门为变形菌门（71.75%）和放线菌门（24.78%），而内生真菌的优势菌门依次为担子菌门（67.82%）和子囊菌门（32.14%），这与其他植物种子内生菌的优势菌门相似性与差异性并存，月季种子^［21］内生细菌的优势菌门依次为厚壁菌门（Firmiccus）和变形菌门；葫芦科植物种子^［22］的优势菌门为变形菌门和厚壁菌门；金钗石斛种子^［23］内生细菌的优势菌门为变形菌门和蓝细菌门（Cyanobacteria），内生真菌的优势菌门为子囊菌门。本研究进一步分析了4种不同产地北柴胡种子内生菌细菌优势属有鞘脂单胞菌（18.30%），真菌优势属有蝶形担孢酵母菌（41.35%）。内生菌群落与柴胡植株本身基因型、生长部位和生境息息相关^{［24， 25］}，但一定地理范围内不同生境北柴胡种子优势菌差异较小，这与中国沙棘种子和牡丹种子群落结构随生境变化而变化明显不同^{［26，27］}。种子内生菌群落分布的多样性和相似性是由种子自身基因型与生长环境共同决定的^［28］。北柴胡种子与内生菌在长期协同进化过程中形成了稳定的互惠互利关系和特有的遗传组合方式。

3.3 北柴胡种子潜在有益内生菌及功能预测

作为北柴胡种子内生细菌的优势菌门，变形菌门细菌在植物微生物群落组成中有重要地位，具有促进植物产生结瘤器官的作用^［29］。放线菌门扮演着包括物质的循环利用、复杂聚合物的降解和生物活性分子产生的角色，被广泛用于净化污染^［30］。拟杆菌门成员在植物体内具有病原体抑制作用，而且对植物根际土壤中磷元素的吸收利用也有重要贡献^［31］。担子菌门成员在生物修复方面表现出巨大的潜力^［32］。子囊菌门真菌在土壤中植物残体的分解和有机质的降解过程中发挥着重要的作用^［33］。可以推测，内生细菌与内生真菌在改善根部生理、促进营养吸收、抵抗不良环境等方面有利于北柴胡种子萌发与生长。

鞘脂单胞菌具有合成植物生长激素如赤霉素和吲哚乙酸的潜力，能促进植物生长，在植物抗非生物胁迫、生物修复和生物防治等方面发挥着重要作用^［34］。作为北柴胡种子优势内生菌属，丰富的鞘脂单胞菌为北柴胡种子适应干旱环境提供了微生物保障。假单胞菌属北柴胡种子中细菌中占有15.45%，是土壤植物病原体的有效生防菌，在北柴胡种子萌发过程中能有效抵御病原菌侵染、抑制病原菌生长^［35］。短小杆菌也是北柴胡种子细菌中重要的组成部分，该属在碳水化合物降解方面具有高度基因多样性潜力^［36］。也有研究表明，短小杆菌属分泌的植物激素不仅缓解盐胁迫对水稻生长的不利影响，还能促进水稻的生长^［37］。根瘤菌是一类革兰氏阴性细菌，在多种植物根际土壤中被发现^［38~40］，在北柴胡种子中含量较高，在豆科植物生长过程中具有显著的固氮作用，在农业领域中被广泛研究与应用^［41~43］。在内生真菌方面，蝶形担孢酵母属真菌是北柴胡种子内生优势属菌（41.35%），在抗植物病原菌以及在工业上用于合成胞外多糖、脂肪酸等化合物方面表现出巨大潜力^［44~46］。曲霉属由超过340种菌种组成，在自然界分布广泛，在北柴胡种子内生真菌中占有17.33%，是引起多种物质霉腐的主要微生物之一，同时少数曲霉属真菌主要用于食品发酵、酶、有机酸和生物活性化合物的大规模生产^［47］。这些种子内生菌与北柴胡在长期共同适应环境中形成组合，为北柴胡种子的贮藏、萌发提供了相对稳定的外部环境，也为植株生长发挥了重要作用。通过高通量测序全面、多层次的检测出北柴胡种子内生菌属水平资源分布，北柴胡种子内生菌具有丰富多样的潜在功能，值得进一步进行植物体外分离培养，并进行筛选开发定植回植物进行功能验证。

在北柴胡种子可检测到的内生优势菌中（种水平），金黄蝶形担孢酵母能较好地利用葡萄糖、蔗糖及糖蜜等碳源高效合成胞外多糖，具有较高的工业生产潜力^［48］，可以推测其具有促进北柴胡中多糖类成分的积累，值得进一步实验探究。李治滢等^［49］从云南异龙湖分离到北柴胡种子优势酵母菌种线黑粉酵母，并检测发现该菌种在体外具有脂肪酶、果胶酶、淀粉酶等胞外酶活性和产油脂能力。多育曲霉在北柴胡种子可检测到种水平真菌中占有19.23%，是北方储藏稻谷优势菌种，可作为北方粮堆异常早期监测预警的主要指示菌群^［50］，也有研究证明该菌种对合成染料和工业废水具有高效的脱色活性，并且可用于生物修复工业废水^［51］，可以推测该菌种具有一定的生物净化作用，为北柴胡种子保证更安全的环境。根球假单胞菌是北柴胡种子可检测内生细菌（种水平）第一优势菌，可作为生物肥料中磷增溶剂成分，具有不溶性磷溶解活性，推测该菌种具有促进北柴胡种子从土壤中吸收营养成分及植物体内有效磷元素的转化作用^［52］。通过高通量测序技术，检测到北柴胡种子具有丰富的内生菌资源。随着种子萌发、植物生长，内生菌存在环境变化，群落结构也在不断变化，值得进一步研究北柴胡不同生长阶段内生菌结构及变化原因。

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基金资助

科技部重点专项：大宗疫情药材柴胡野生抚育关键技术集成与产业化推广应用(SQ2020YFF0426286)