两株四环素降解菌的分离鉴定及降解条件优化

Isolation and identification of two tetracycline degrading bacteria and optimization of degradation conditions

摘要

为发掘四环素高效降解菌株，本研究从以四环素为唯一生长碳源的养鸡场粪便堆肥样品中分离筛选到2株四环素降解菌TC⁃04和TC⁃09，并通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，对其进行鉴定。采用单因素试验分别探究不同碳源、氮源、微量元素这3个培养基成分和培养时间、接种量和装液量这3个培养条件对两株菌降解四环素的影响。基于单因素试验结果，通过响应面优化培养基成分，拟合得到二次多项回归模型，确定了降解四环素的最佳培养基成分。经鉴定，菌株TC⁃04为尼泊尔鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis nepalensis），TC⁃09为京畿大学鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium kyonggiense）；TC⁃04在无机盐培养基（MM）中添加1.5 g/L蔗糖、0.8 g/L蛋白胨和0.3 g/L MnSO₄时对四环素的降解率最高，TC⁃09在MM中添加1.3 g/L葡萄糖、1.2 g/L牛肉膏、0.2 g/L FeSO₄时对四环素的降解率最高，预测TC⁃04和TC⁃09对四环素的降解率分别为74.29%和86.65%，实际值为74.86%和85.72%；单因素试验结果表明，菌株TC⁃04和TC⁃09分别在接种量为2%和1%、装液量为20~60 mL/250 mL、培养6 d时，四环素的降解率最高。本研究获得的2株四环素降解菌，可为环境中残留的四环素降解提供优质微生物种质资源和理论依据。

Abstract

Tetracycline is a broad⁃spectrum antibiotic produced by actinomycetes. Its chemical structure is relatively stable and easy to accumulate in the environment and affect the ecological environment. In order to explore tetracycline degrading strains， tetracycline was used as the sole carbon source and two strains with the highest tetracycline⁃degrading ability were identified based on morphological， physiological， biochemical characterization and 16S rRNA gene sequencing. The effects of different carbon sources， nitrogen sources and trace elements on the degradation rate of the strains were tested. Based on the single factor test， the method of response surface analysis was adopted to optimize the medium composition. Furthermore， the culture time， inoculation quantity， and liquid filling quantity of the medium were analyzed to investigate the tetracycline degradation performance of the isolated strains. The isolated strains TC⁃04 and TC⁃09 were identified as Sphingopyxis nepalensis and Sphingobacterium kyonggiense， respectively. The highest tetracycline⁃degrading efficacy of TC⁃04 was achieved when it was incubated in the minimal medium （MM） added 1.5 g/L sucrose， 0.8 g/L peptone and 0.3 g/L MnSO₄， whereas the highest tetracycline⁃degrading efficacy of TC⁃09 was obtained in the MM added 1.3 g/L glucose， 1.2 g/L beef extract and 0.2 g/L FeSO₄. Under the above optimum conditions， the predicted tetracycline degradation rate of TC⁃04 and TC⁃09 was 74.29% and 86.65%， whereas the observed value was 74.86% and 85.72%， respectively. In addition， TC⁃04 and TC⁃09 had the best growth and the highest degradation rate when the inoculation ratio was 2% and 1%， respectively， the liquid volume was 20 to 60 mL and cultured for six days. The two tetracycline degradation strains TC⁃04 and TC⁃09 obtained in this study provided microbial resources and references for the degradation of tetracycline residues in environment.

Graphical abstract

关键词

四环素降解菌 / 尼泊尔鞘氨醇盒菌TC⁃04 / 京畿大学鞘氨醇杆菌TC⁃09 / 响应面法

Key words

tetracycline degrading bacterium / Sphingopyxisnepalensis TC⁃04 / Sphingobacteriumkyonggiense TC⁃09 / response surface methodology

0 引 言

四环素是放线菌产生的一种广谱抗生素，既可以用来进行动物疾病的治疗，还可以作为饲料的添加剂促进动物生长^{［1， 2］}。四环素具有价格低廉、使用方便等优点，截至2013年底全世界每年的需求量已达4 000吨，我国更是生产和使用大国^［3，4］。然而，研究表明四环素的化学结构稳定，经动物使用后并不能被完全吸收转化，大部分以原药形式排出体外^［5］，易在环境中积累。例如四环素会改变土壤中微生物的群落结构和活性，造成微生物多样性的下降，最终使土壤的肥力与质量受影响^［6，7］；此外四环素能够通过降低植物叶绿体合成酶的活性，削弱光合作用来影响植物的生长^［8］；四环素还会抑制水生动物体内多种酶的活性，损害鱼类DNA^［9］。因此，如何环保高效地降解环境中残留的四环素已经成为国际上关于土壤、水体修复的研究热点问题。

近年来利用微生物降解环境中残留的四环素成为研究热点，而获得高效的降解菌株则是研究的关键。从四环素生产厂长期堆放药渣的泥土中筛选得到两株四环素降解菌缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）TD2和人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropic）TD3，这两株菌120 h对100 mg/L的四环素降解率分别是58.7%和67.4%^［10］；一株四环素高效降解菌无丙二酸柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）72 h对药渣中四环素降解率达86.1%^［11］；从长期受四环素污染的土壤中分离到一株木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）TJ⁃2，该菌能以四环素为唯一碳源生长，其5 d对50 mg/L的四环素降解率为63.9%^［12］；从鸡粪中分离到的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）TC⁃1，7 d对50 mg/L四环素的降解率达到56.2%^［13］；从养殖场新鲜粪便中分离筛选到一株淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）N2⁃13，其对四环素的降解率达73.88%^［14］；嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）DT1，虽然不能以四环素作为唯一碳源生长，但可以在外源营养存在的条件下降解四环素，降解率高达95%^［15］。虽然报道的四环素降解菌较多，但总体而言，筛选到的四环素降解菌仍较缺乏，且在实际土壤废水的四环素残留的处理过程中，菌株的降解能力受环境因子影响较大，因此有必要对菌株的降解条件进行优化。

本研究从长期以四环素为饲料添加剂的养鸡场粪便堆肥中筛选获得两株对四环素具有一定降解能力的菌株，对其进行分类鉴定，研究影响该菌株降解四环素的理化因素，探究其对四环素降解的最佳条件，为修复及治理四环素污染的环境提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

本实验样品取自盐城市某养鸡厂（长期使用四环素类抗生素作为饲料添加剂）粪便堆肥。

1.1.2 培养基

无机盐培养基（MM）：0.5 g KH₂PO₄、1.5 g K₂HPO₄、1.0 g NaCl、0.5 g MgCl₂、1.0 g NH₄NO₃、0.5 g （NH₄）₂SO₄、1 000 mL ddH₂O，固体培养基另加20 g/L的琼脂粉。LB培养基：10 g蛋白胨、5.0 g酵母提取物、10 g NaCl、1 000 mL H₂O。

1.1.3 主要试剂

四环素标准品购自上海生物工程公司；细菌基因组DNA小量制备试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA marker均购自天根生化科技（北京）有限公司

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离、纯化与筛选

称取5 g堆肥样品，加到含20 mg/L四环素的MM液体培养基中，置于30 ℃，160 r/min恒温震荡，黑暗培养7 d，吸取此培养液10 mL转接至四环素浓度为30 mg/L的MM液体培养基中，于相同条件下培养7 d，然后继续转接传代，每次转接四环素浓度提高10 mg/L，共转接5次，直至四环素浓度为80 mg/L，用此方法对菌株进行驯化。结束后取9 mL富集培养物于90 mL的无菌水中混匀稀释，形成10^-1的稀释液，如此重复直至稀释至10^-7为止。采用梯度平板划线法进行筛选，从10^-3~10^-7这5个稀释倍数的富集液液中各吸取100 μL菌液，涂布于含有四环素（80 mg/L）的选择培养基和对照平板（MM固体培养基），每个稀释度3个重复，30 ℃培养。待长出单菌落，挑选菌落形态外观不同的单菌落划线进一步分离纯化后，挑取单菌落接种至斜面，编号保存，以备后续试验。

1.2.2 四环素降解效率的测定

将上述获得的各菌株分别接种到100 mL的LB液体培养基中培养48 h，将培养液于无菌离心管中4 000 r/min离心5 min，使用适量灭菌的MM液体培养基洗涤、离心2次，最后用无菌的MM液体培养基稀释，并同时测量菌体在可见分光光度计600 nm处的吸光度，以1.0为接种标准浓度，即为种子液。随后取1 mL种子液接种至四环素（浓度为80 mg/L）为唯一碳源的MM液体培养基中，30 ℃，160 r/min黑暗培养7 d。用乙腈（色谱纯）萃取培养液（V∶V=1∶1）中的四环素，然后进行全波长紫外扫描，确定菌株是否具有四环素降解的能力；通过高效液相色谱仪（HPLC）检测残留的四环素量，确定其降解效率。HPLC的测定条件为：岛津LC⁃20A色谱仪；C18，5 μm，4.6 mm × 150 mm色谱柱；流动相为草酸（0.01 mol/L）∶乙腈∶甲醇=68∶24∶8（V∶V∶V）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；波长360 nm。定量方法为外标法，菌液浓度采用比浊法在600 nm下测定吸光值，记为OD_600nm^{［4， 12］}。

1.2.3 菌株的形态特征、生理生化实验和鉴定

对筛选到的降解菌株进行菌落观察、革兰氏染色，用普通光学显微镜和扫描电镜观察菌体形态；根据《一般细菌常用鉴定方法》和《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化实验^{［16，17］}；采用高盐法提取细菌基因组DNA，以其为模板，以16S rRNA基因通用引物27F/1492R为扩增引物进行目的片段扩增，获得的PCR产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送至上海生工生物公司测序。将测序所得的16S rRNA基因序列提交至NCBI GenBank数据库，获取登录号；在原核生物鉴定库（http：//www.ezbiocloud.net/）中对所得的16S rRNA基因序列进行在线比对分析，下载同源性较高的序列，利用MEGA 7.0软件，用Clustal W进行基因序列比对，采用邻接法构建菌株的系统发育进化树^{［18，19］}。

1.2.4 生长曲线

用浊度法测定菌株的生长曲线，将菌株接种于液体LB培养基中，于30 ℃，160 r/min摇床中培养，定时取样，测定其OD_{600 nm}值，绘制生长曲线。

1.2.5 菌株培养基成分优化及其对降解率的影响

针对3个对四环素降解率有影响的培养基成分因素进行单因素试验，将降解菌接种至LB培养基中，根据绘制的菌株生长曲线培养至对数期制成种子液，接种量为1%。所用装置为250 mL三角瓶，装液量为100 mL。

① 碳源及浓度。以单因素作变量，在四环素浓度为80 mg/L的MM培养基中分别加入1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖和麦芽糖作为实验组，不加碳源作为对照组，不加碳源也不加菌作为空白对照组，每组3个重复，探讨不同的碳源对两菌株生长和降解四环素效果的影响。确定最佳碳源后，分别向MM培养基中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的碳源，于30 ℃、160 r/min、pH 7.0，黑暗条件下培养。

② 氮源及浓度。以单因素作变量，在四环素浓度为80 mg/L的MM培养基中分别加入1%的蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素和NH₄Cl作为实验组，不加氮源作为对照组，不加氮源也不加菌作为空白对照组，每组3个重复，探讨不同的氮源对两菌株生长和降解四环素效果的影响。确定最佳氮源后，分别向MM培养基中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的氮源，于30 ℃、160 r/min、pH 7.0，黑暗条件下培养。

③ 微量元素及浓度。以单因素作变量，在四环素起始浓度为80 mg/L的MM培养基中分别加入0.01 g/L MgSO₄·7H₂O、0.01 g/L FeSO₄、0.01 g/L MnSO₄·H₂O、0.1 g/L CaSO₄和0.01 g/L CuSO₄作为实验组，不加额外微量元素作为对照组，不加额外微量元素也不加菌作为空白对照组，每组3个重复，探讨不同的微量元素对两菌株生长和降解四环素效果的影响。确定最佳微量元素后，分别向MM培养基中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的微量元素，于30 ℃、160 r/min、pH 7.0，黑暗条件下培养。

④ 响应面优化及验证试验。以单因素的试验结果为基础，进行响应面优化试验。菌株TC⁃04选取蔗糖、蛋白胨和MnSO₄三个因素，TC⁃09选取葡萄糖、牛肉膏和FeSO₄三个因素。每个因素三个水平，因素和水平如表1和表2所示。为验证模型的准确性和有效性，按照优化后的四环素降解条件进行3组平行试验，对应的响应值取3次试验结果的平均值。

1.2.6 菌株培养条件优化及其对降解率的影响

针对3个对四环素降解率有影响的培养条件因素进行单因素试验，将降解菌接种至LB培养基中，培养到对数期制成种子液，再按需加入，所用培养容器为250 mL三角瓶，四环素浓度为80 mg/L。

① 培养时间。将菌株TC⁃04和TC⁃09的种子液分别以1%的接种量接入优化好的100 mL液体发酵培养基中，3个重复，30 ℃、160 r/min，黑暗中振荡培养，每24 h测OD_600nm及四环素的残留量，探究不同时间对四环素残留量的影响。

② 接菌量。将菌株TC⁃04和TC⁃09的种子液分别以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的接菌量接入优化好的100 mL液体发酵培养基中，3个重复，30 ℃、160 r/min，黑暗中振荡培养6 d，测OD_600nm及四环素的残留量，探究不同接菌量对菌株降解四环素的影响。

③ 装液量。在250 mL的三角瓶中分别装入20、40、60、80、100和120 mL发酵培养基，TC⁃04和TC⁃09的接菌量分别为2%和1%，3个重复，30 ℃、160 r/min，黑暗中振荡培养6 d，测OD_600nm及四环素的残留量，探究不同装液量对菌株降解四环素的影响。

2 结果与分析

2.1 降解菌筛选与降解效果评价

富集结束后，对第七代富集液进行紫外全波段扫描，结果如图1a所示，培养7 d后富集液处理组（T）中四环素的特征峰明显低于空白对照（CK），将第7代富集液进行稀释、涂布、筛选及分离纯化，获得10株有效降解四环素的菌株，其中两株菌的降解效果明显高于其他菌株，分别命名为TC⁃04和TC⁃09。利用紫外扫描仪定时检测菌株TC⁃04（图1b）和TC⁃09（图1c）的降解能力，结果表明这两株菌在培养至第5 d时降解能力并不明显，第8 d时四环素出现降解，第11 d检测时，TC⁃09的四环素特征峰明显低于TC⁃04，说明其降解能力略高于菌株TC⁃04。

2.2 TC⁃04和TC⁃09的形态观察、鉴定及其生长曲线

2.2.1 形态特征和生理生化特征鉴定

菌株TC⁃04和TC⁃09在LB平板上培养2 d后，菌落形态和菌体形态如图2所示：菌株TC⁃04的菌落呈浅黄色、圆形、边缘光滑、表面凸起、质地干燥、不透明（图2A），电镜下菌体呈短杆状，大小为2.78 μm ×1.12 μm（图2C）；菌株TC⁃09的菌落大小直径为2~3 mm、呈奶黄色或黄白色、表面扁平、质地湿润、有光泽、半透明（图2B），电镜下菌体呈长杆状，大小为2.92 μm×0.39 μm（图2D）。

两株菌的生理生化特征结果见表3，革兰氏染色显示这两株菌都是革兰氏阴性菌，菌株TC⁃04和TC⁃09的生长pH范围分别是4.5~10.0（最适6.0~8.0）和6.0~10.0（最适7.0~8.0）。生长温度范围分别是15~37 ℃（最适25~32 ℃）和15~42 ℃（最适30 ℃），这两株菌的生长温度范围较广，其中菌株TC⁃09生长的最高温度达42 ℃，推测与TC⁃09分离自粪便堆肥样品，而堆肥内部温度一般较高有关。菌株TC⁃04的氧化酶试验、V⁃P试验和明胶液化试验均为阳性，其余试验为阴性；而TC⁃09的接触酶试验、氧化酶试验、葡萄糖发酵、V⁃P试验和明胶液化试验为阳性，其余试验均为阴性。

2.2.2 16S rRNA鉴定、菌株遗传学分析

经16S rRNA基因测序，获得菌株TC⁃04和TC⁃09的16S rRNA基因序列，在NCBI GenBank登录号分别是OK413208和OK413209，大小分别为1 457 bp和1 433 bp。将上述2个片段使用Ezbiocloud在线工具进行相似性比对，构建系统发育树如图3所示，菌株TC⁃04与Sphingopyxis nepalensis Ktm⁃14^T的同源性最高，达99.78%，菌株TC⁃09与Sphingobacterium kyonggiense KEMC⁃2241⁃005^T的同源性最高，达99.96%，并且它们在系统发育树上亲缘关系也是最近的。因此，根据菌株形态、生理生化特性和16S rRNA鉴定结果，将菌株TC⁃04和TC⁃09分别鉴定为尼泊尔鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis nepalensis）和京畿大学鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium kyonggiense）。

2.2.3 生长曲线

菌株TC⁃04和TC⁃09的生长曲线如图4所示，TC⁃04和TC⁃09的适应期分别为0~30 h和0~24 h，这一时期菌液较澄清；之后进入对数期，TC⁃04和TC⁃09的对数期分别为30~66 h和24~60 h，在此阶段菌液开始浑浊，生长速度较快，菌体数呈指数增长；此后两株菌分别进入稳定期。由图可知这两株菌的生长速率较慢，其中TC⁃09的生长速率略快于TC⁃04。

2.3 降解菌培养基成分优化

2.3.1 碳源及浓度

由图5a可知，TC⁃04和TC⁃09分别在蔗糖组和葡萄糖组中生长最好，四环素的残留最少，降解率分别是72.5%和82.5%，说明外加蔗糖和葡萄糖分别利于TC⁃04和TC⁃09对四环素的降解。图5b结果表明，TC⁃04在添加0.5、1.0和1.5 g/L蔗糖时四环素的残留差不多，降解率分别是70%、72.5%和70.83%，蔗糖浓度继续上升时，四环素残留量开始增大；TC⁃09在添加葡萄糖浓度为1.0和1.5 g/L时，四环素的残留明显低于其他几组，降解率分别为82.5%和86.25%。

2.3.2 氮源及浓度

由图6a可知，蛋白胨和牛肉膏均有利于菌株TC⁃04和TC⁃09的生长，但蛋白胨对TC⁃04的效果比牛肉膏好，而在TC⁃09中正好相反。由图6b分析可知，TC⁃04在蛋白胨的浓度为1.5 g/L时，四环素的残留量最少，降解率是74.13%；TC⁃04在牛肉膏的浓度为1.0 g/L时，四环素的残留量最少，降解率是80.38%。

2.3.3 微量元素及浓度

由图7a可知，在培养基中分别加入0.01%的MgSO₄·7H₂O、FeSO₄和MnSO₄·H₂O三种不同的微量元素，均能促进菌株TC⁃04和TC⁃09对四环素的降解，但是MnSO₄·H₂O对TC⁃04的促进作用最明显，该组四环素的残留量最小，降解率达72.5%，而FeSO₄对TC⁃09的促进作用最明显，四环素的残留量最小，降解率达80.5%，这与此前文献报道中的结果相似^{［3， 4， 20］}。另外，图7a结果显示，培养基中加入0.1%的CaSO₄和0.01%的CuSO₄时，TC⁃04和TC⁃09的四环素残留量均高于对照组，说明这两种微量元素不同程度地抑制了这两株菌对四环素的降解。图7b结果显示，当MnSO₄的浓度为0.4 g/L时，TC⁃04四环素的残留量最少，降解率是75%，当MnSO₄浓度升高至0.5 g/L时，四环素的残留量变大。另外，当FeSO₄的浓度为0.3 g/L时，TC⁃09四环素的残留量最少，降解率是81.25%，当FeSO₄浓度继续升高时，四环素降解率开始逐渐递减。

2.3.4 响应面分析及验证结果

使用Design⁃Expert对数据结果进行方差分析和多元回归拟合，以碳源浓度、氮源浓度和微量元素浓度为自变量，降解率为响应值（表4），得出二次多项回归模型为：菌株TC⁃04降解率（Y）=71.61+3.91A+3.14B+4.08C-3.25AB-2.69AC-1.45BC-1.39A²-2.07B²-1.55C²，式中，A代表蔗糖，B代表蛋白胨，C代表MnSO₄；TC⁃09的降解率（Y）=82.07+8.89A+4.71B+4.06C-3.93AB-0.53AC-2.33BC-3.41A²-5.07B²-6.11C²，式中，A代表葡萄糖，B代表牛肉膏，C代表FeSO₄。TC⁃04和TC⁃09的回归分析的结果如表5所示：拟合的相关系数分别是R²_{（TC⁃04）}=0.0.997 7，adj R²_{（TC⁃04）}=0.994 7和R²_{（TC⁃09）}=0.982 6，adj R²_{（TC⁃09）}=0.960 3，表明这两个模型实验数据和预测数据之间有很好的拟合程度及较小的试验误差。F_{（TC⁃04）}和F_{（TC⁃09）}值分别为337.25和44.04，P都小于0.000 1，说明该模型高度显著。TC⁃04和TC⁃09的失拟项数值分别为0.109 0和0.110 4，均大于0.05，说明不显著，表明数据中没有异常点，回归方程拟合度高。同时菌株TC⁃04和TC⁃09均具有较高的信噪比值，分别是54.328和20.243，说明该模型可以用于响应值的预测。

两株菌的回归模型的检验结果都表明，回归方程的一次项和二次项均极显著，再结合响应面分析的三维图形（图8）可直观看出各因素的交互作用，三维曲线越陡峭，表明因素对四环素降解率的影响越大。图8A可知蔗糖浓度和MnSO₄浓度的交互作用显著，对TC⁃04降解四环素的影响最大；图8B可知葡萄糖浓度和FeSO₄浓度的交互作用显著，对TC⁃09降解四环素的影响最大。Design⁃Expert软件分析结果预测，当蔗糖浓度为1.5 g/L，蛋白胨浓度为0.8 g/L和MnSO₄浓度为0.3 g/L时，TC⁃04对四环素的降解效果最好；当葡萄糖浓度为1.3 g/L，牛肉膏浓度为1.2 g/L和FeSO₄浓度为0.2 g/L时，TC⁃09对四环素的降解效果最好。根据筛选试验中确定的参数条件以及拟合优化得到关键参数的最佳试验条件，确定了两株菌最终较优的培养基成分，即TC⁃04在MM培养基中添加1.5 g/L蔗糖，0.8 g/L 蛋白胨和0.3 g/L MnSO₄时，实际降解率最高（74.86%），接近理论预测值74.29%；TC⁃09在MM培养基中添加1.3 g/L葡萄糖，1.2 g/L牛肉膏和0.2 g/L FeSO₄时，实际降解率最高（85.72%），略低于理论预测值（86.64%）。上述结果表明该模型较好地预测了实际的降解试验结果。

2.4 降解菌培养条件优化

2.4.1 培养时间

图9结果表明菌株TC⁃04和TC⁃09的表现一致，即随着时间的延长，两株菌的生长量逐渐增加，而四环素的残留则在不断减少，前5 d四环素的残留较多，在第6 d时出现大幅度减少，6 d以后菌株的生长量开始逐渐递减，四环素的残留量变化较少，出现小幅度的减少，根据李伟明等^［21］的研究推测四环素减少可能是由于随着培养时间的延长，培养液中的理化环境包括pH、离子强度和温度等条件发生了变化，从而引起少量四环素的自然水解。之后的实验采用TC⁃04和TC⁃09的培养时间采用6 d。

2.4.2 接种量

由图10可知，对于菌株TC⁃04，接种量为2%时四环素的残留量小于其他接种量时的残留量，降解率达75.88%；对于菌株TC⁃09，接种量为1%时四环素的残留量最小，降解率达82.09%。因此，在之后的实验中分别采用2%和1%为菌株TC⁃04和TC⁃09的接种量。

2.4.3 装液量

由图11结果显示可知，装液量对菌株TC⁃04和TC⁃09的生长和四环素的降解影响较一致。装液量为20、40、60 mL时，这两株菌中四环素的残留量差不多，但是随着装液量的增多，四环素的残留也在增加，且随着培养基装液量的增加，两株菌的生长量都在不断地减少。因此，菌株TC⁃04和TC⁃09是好氧菌，较小的装液量有利于它们对四环素的降解。

3 结论与讨论

本文从长期使用四环素类抗生素作为饲料添加剂的养鸡场粪便堆肥中筛选到两株四环素降解菌TC⁃04和TC⁃09，经鉴定为鞘氨醇盒菌和鞘氨醇杆菌。菌株TC⁃04在MM培养基中添加1.5 g/L蔗糖、0.8 g/L蛋白胨和0.3 g/L MnSO₄时对四环素的降解率最高，TC⁃09在MM培养基中添加1.3 g/L葡萄糖、1.2 g/L牛肉膏和0.2 g/L FeSO₄时对四环素的降解率最高，分别为74.86%和85.72%。另外，在装液量为20~60 mL/250mL、TC⁃04接种量为2%、TC⁃09接种量为1%时，培养6 d以后这两株菌的四环素降解率最高。

不同的微生物具有不同的代谢类型，合适的培养基成分及培养条件能够提高菌株的降解能力。本文在探究了3个培养基成分对菌株生长和降解率的影响之外，还通过响应面法优化了培养基成分，相较于单因素试验，响应面法可充分考虑各试验因素及其交互作用对响应变量的影响，能更准确地配制培养基成分，使菌株达到更好的降解效果。如在探讨不同的微量元素对四环素降解率影响时，本研究发现MnSO₄和FeSO₄均对TC⁃04和TC⁃09的四环素降解率有不同程度的促进作用，这与陶美^［4］、王辉^［20］等的研究结果一致，FeSO₄和MnSO₄能够对四环素的降解有不同程度的促进作用，随着MnSO₄浓度的增加，四环素的降解率开始下降，则认为是MnSO₄达到一定浓度后，锰离子开始出现沉淀，影响了实验效果^［4］；王辉的研究认为Fe²⁺在氧化过程中产生的OH促进了四环素的降解^［20］。而添加CaSO₄和CuSO₄均抑制了TC⁃04和TC⁃09对四环素的降解，这不同于许晓玲报道的CuSO₄促进菌株对四环素的降解^［10］。添加MgSO₄能够小幅度促进菌株TC⁃04的降解，却抑制菌株TC⁃09的降解，这可能与不同菌株的生长对微量元素的要求不同有关。

另外，培养条件对菌株TC⁃04和TC⁃09的生长和四环素降解率也都有明显的影响。在本研究中发现当装液量在20~60 mL时，对两株菌的生长及降解影响均不大，但是随着装液量的增加，菌体的OD_600nm值开始下降，四环素的残留量开始上升。三角瓶中的装液量与溶氧量呈负相关，可以说明微生物在好氧条件下更容易发挥对四环素的降解作用，也间接说明本研究中的两株菌为好氧菌。

本文中TC⁃04为鞘氨醇盒菌，TC⁃09为鞘氨醇杆菌，这两株菌在分类上比较接近，都属于鞘脂类。据报道该类微生物大部分对芳香化合物具有极为广泛的代谢能力，能够降解、转化环境中复杂的大分子，并且某些菌种能够合成有价值的胞外生物高聚物，在环境保护及工业生产方面具有巨大的应用潜力，近年来成为被关注和研究的热点^［22］。目前已有不少能降解四环素类抗生素的微生物被报道，但是关于鞘脂类微生物降解四环素的研究比较少，仅见徐伊婷等报道的一株从养殖场排污口土壤样品中筛选得到的鞘氨醇杆菌Z⁃8，该菌在以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源，30 ℃，初始pH 7.5，装液量为60 mL/250 mL时对四环素的降解率达到最大，7 d对30 mg/L的四环素降解率达58.2%^［23］。本研究筛选到的菌株TC⁃04和TC⁃09在培养条件优化后6 d对80 mg/L四环素的降解率分别是74.86%和85.72%，均高于菌株Sphingobacterium sp Z⁃8。本文筛选到的两株菌可以丰富目前四环素降解微生物菌种资源；同时，本文研究的培养基成分和培养条件优化等结果可以为今后利用这两株菌处理环境中残留的四环素提供初步理论参考。

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基金资助

国家自然科学基金(31700096)