甘肃雪灵芝资源调查及其黄酮类化合物含量差异

Resource investigation of Arenaria kansuensis Maxim. and the differences of its flavonoid contents

摘要

调查青海省甘肃雪灵芝药材资源的分布、生境和利用现状，建立高效液相色谱法对不同产区药材中异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B等黄酮类化合物进行同时定量分析，比较不同产区上述成分的含量差异。结果发现甘肃雪灵芝在青海省主要分布于大坂山、巴颜喀拉山、乱石头山、苦海滩、昆仑山、昌麻河流域等4 000~5 000 m的高山流石坡和高寒草甸，植物群落的科、属组成分散，构成相对简单，以草本层为主；药材的表型性状（株高、冠径、叶形指数）和上述黄酮类化合物含量在不同产区均存在一定差异。大坂山产的甘肃雪灵芝株高和冠径均最大，黄酮类化合物含量也最高，其中苜蓿素平均含量高达0.322 mg/g；而苦海滩产的甘肃雪灵芝植株矮小、叶形指数和冠径较小、主根较短，且所含的上述黄酮类成分较少，尤其苜蓿素（0.039 mg/g）和Salcolin B（0.012 mg/g）含量显著低于其他产区。此外，本研究建立的高效液相色谱法用于测定上述黄酮化合物，简便高效，重现性和分离度均较好。该结果可为甘肃雪灵芝药材的质量控制与评价及资源可持续利用提供科学依据。

Abstract

The distribution， habitat and utilization of A. kansuensis （AK） resources in Qinghai Province were investigated comprehensively， and the preferable high performance liquid chromatography （HPLC） method was used for determination and analysis of flavonoids （isovitexin， isoscoparin， tricin and salcolin B） in AK herbs. The results demonstrated that AK resources were mainly distributed in alpine meadow and rock⁃flowing hillside regions with an altitude of 4 000 ~ 5 000 m， including Daban Mountain， Bayan Har Mountain， Luanshitou Mountain， Kuhai Beach， Kunlun Mountain and Changmahe River Basin. The family and genus compositions of plant community were relatively simple， mainly herbaceous layer. Some significant differences were detected in phenotypic traits and the contents of these flavonoids in AK collected from different regions. The maximum plant height and crown diameter of AK were found in Daban Mountain， and their flavonoid contents were also the highest， especially the tricin average content reached up to 0.322 mg/g. However， the AK herbs in Kuhai Beach had minimum plant height， crown diameter and leaf shape index， and their taproots were shorter. Additionally， they also had low flavonoid content， especially tricin and salcolin B contents were significantly lower （0.039 and 0.012 mg/g） than other production regions. Furthermore， it is indicated that the HPLC method is simple， accurate， efficient， and suitable for determination and analysis of these flavonoids in AK， with good reproducibility and separation of chromatographic peaks. In summary， this research could be helpful for the quality control and evaluation of AK resources， and contribute to the sustainable utilization of these Tibetan herbs.

Graphical abstract

关键词

甘肃雪灵芝 / 资源调查 / 黄酮类化合物 / 含量测定

Key words

Arenaria kansuensis Maxim. / resource investigation / flavonoid compound / content determination

0 引 言

甘肃雪灵芝（Arenaria kansuensis Maxim.）又名甘肃蚤缀，为石竹科（Caryophyllaceae）无心菜属（Arenaria L.）雪灵芝亚属（subgen. Eremogoneastrum Williams）多年生垫状草本植物，主要生于海拔4 000~5 000 m的砾石流带和高山草甸^［1，2］。藏药名为阿仲嘎保，以全草入药，其性味苦、寒，具有清肺热、止咳、降血压、滋补等功效，常用于肺炎、淋病、淋巴结核、子宫病等疾病的治疗^［3~5］。现代植物化学和药理学研究表明，甘肃雪灵芝富含黄酮、生物碱、萜类、甾醇和多糖类化合物，具有消炎、抗氧化、抗缺氧、免疫调节、抑菌、抗病毒等生物活性^［6~16］。近些年来，许多药企以甘肃雪灵芝为主要原料，研发出系列医药产品，资源需求量巨大^{［12，17］}。然而，有关甘肃雪灵芝资源状况的调查较为缺乏，不同产区甘肃雪灵芝主要化学成分存在较大差异^［18］。因此，根据前期工作基础对甘肃雪灵芝主要产区进行实地调查和走访调研，分析不同产区药材资源的表型性状和黄酮类化合物含量，为甘肃雪灵芝这一传统藏药的质量控制和可持续利用奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

① N⁃1210B旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、UPT⁃11⁃100L超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）、LC⁃16高效液相色谱仪及LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）、JP⁃060超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）、5430R低温高速离心机（德国艾本德公司）、AG204电子分析天平（梅特勒托利多公司）。异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B对照品均为自制（质量分数均>98%），为甘肃雪灵芝主要黄酮类成分。乙腈和甲醇为色谱纯（云南新蓝景公司），其他试剂均为分析纯（天津百世公司）。

② 药材样品于2020年9月采自青海省不同产区，经中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟研究员鉴定为甘肃雪灵芝。样品经拣选、清洗、除杂后阴干，粉碎过40目筛，备用。

1.2 方法

1.2.1 资源调查

根据文献调查和走访调查以及前期的研究基础^{［17，18］}，确定调查区域主要为青海大坂山、巴颜喀拉山、乱石头山、苦海滩、昆仑山、昌麻河流域等地，这些产区的甘肃雪灵芝资源丰富、储量高，呈片状分布且群落特征较为单一，很具有代表性（图1）。通过随机抽取的方法确定样方，每个样方大小设置为2 m×2 m，在每个样方内统计分析甘肃雪灵芝株数、叶形指数、株高、冠径、根长以及伴生植物、植被密度和盖度、分布状况等信息，同时收集每个样方内甘肃雪灵芝全草约3 kg（鲜重），用于黄酮类化合物含量测定。结合实际走访的各个药材分布区，根据植株的生境、分布面积和特征等因素，确定设置样地18个，每个样地设置样方3个，还要求每个样方内至少有7株甘肃雪灵芝。具体调查地点和生态地理环境信息如表1所示。

1.2.2 对照品溶液制备

精密称取异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B对照品适量，用80%色谱甲醇充分溶解并分别稀释成225.0、237.0、318.0、216.0 μg/mL（质量浓度）对照品溶液，低温保存、备用。

1.2.3 供试品溶液制备

准确称取甘肃雪灵芝干样粉末（过40目筛）1.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 80%色谱甲醇浸泡过夜，然后超声提取30 min（功率300 W、温度50 ℃），摇匀、离心（4 500×g，15 min）后，取上清液，经减压浓缩一定程度后再将提取液定容至25 mL容量瓶中，即得供试品溶液。

1.2.4 色谱条件

德国VDSpher C₁₈⁃AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以0.2%甲酸水（A）和乙腈（B）为流动相进行等度⁃梯度混合洗脱：0~30 min，14%B；30~50 min，14%~19%B；50~80 min，19%B；80~100 min，19%~27%B；100~165 min，27%B。进样量20 μL，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长360 nm。

1.2.5 线性关系考察

精密吸取不同体积的对照品溶液，测定各成分的峰面积，以各成分的进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线并进行线性回归分析，得各成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围。

1.2.6 精密度、稳定性、重复性、回收率试验

① 精密度试验：精密吸取同一供试品（大坂山）溶液20 μL，连续进样7次，记录各成分的峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。② 稳定性试验：吸取同一供试品（大坂山）溶液20 μL，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h 测定，记录各成分的峰面积并计算RSD。③ 重复性试验：称取大坂山样品7份，按照1.2.3的方法制备供试品溶液，进样，记录各成分的峰面积并计算各成分含量RSD。④ 回收率试验：称取已知含量的同一供试品（大坂山）7份，每份约1.0 g，按照各成分等比例地精密加入对照品溶液制备供试品溶液，按前述色谱条件进样测定，分别计算各成分的加样回收率及RSD值。

1.2.7 样品含量测定

称取不同产区的甘肃雪灵芝干燥药材粉末（地上部分，已过40目筛）按1.2.3方法制备供试品溶液，根据前述的色谱条件进行测定，采用外标法计算各药材中四种黄酮类成分的含量（质量分数）。

2 结果与分析

2.1 资源分布及生态地理环境

通过实地调研发现，青海省的甘肃雪灵芝资源主要分布于玉树、称多、囊谦、玛多、班玛、久治、达日、甘德、玛沁、格尔木、大通、湟中、互助、祁连、门源、同仁、河南、同德、贵德等县（或县级市），生于海拔均高于4 000 m的砾石流带、高山草甸、山顶流石坡、山坡草地、高山宽谷中，属于高山流石滩稀疏植被生态系统和高寒草甸生态系统^［19］。其中，大通县大坂山、久治县乱石头山、玛多县苦海滩、玛沁县昌麻河、称多县巴颜喀拉山以及格尔木市昆仑山口等地资源分布面积广、储量大。调查表明，甘肃雪灵芝属于喜光、喜湿、耐寒、耐贫瘠植物，生长地区年均降水和年均湿度相对较高、年均气温较低，年均日照时数均超过2 300 h，紫外辐射强烈，生长土壤较为贫瘠，土层薄、有机质含量低。调查过程中还发现甘肃雪灵芝除对海拔高度、经纬度和气候环境较敏感外，山体走向也会影响其生长，同样是高海拔砾石流带，甘肃雪灵芝喜向阳坡或山顶，而阴坡生长较少。

2.2 生物学特征

多年生垫状草本，株高4~20 cm。主根粗壮，木质化，茎下部密集枯叶。叶线状披针形，长0.7~2.0 cm，宽0.5~1.2 mm，基部稍宽，抱茎，边缘窄膜质，下部具细齿，稍内卷，顶端锐尖，呈芒状，表面微凹入，背面凸出，质稍硬，紧密排列于茎上。花单生于枝端；苞片披针形，长3.0~6.0 mm，宽1.0~2.0 mm，基部连合呈短鞘，边缘宽膜质，顶端锐尖，具1脉；花梗长1.0~1.9 cm，被柔毛；萼片5，披针形，长5~8 mm，基部较宽，边缘宽膜质，具1脉；花瓣5，白色，倒卵形，长4~8 mm；花盘具5个腺体，杯状；雄蕊10，长约5.0 mm，花药带褐色；子房球形，花柱3，线形，长约4.0 mm。花期7-8月。

基于甘肃雪灵芝资源野外调查和相关样品采集，着重对大坂山、乱石头山、苦海滩、昌麻河、巴颜喀拉山以及昆仑山产区甘肃雪灵芝叶形指数、株高、冠径、主根长、根径（根部最粗处横切面直径）等形态学进行考察、测量、统计及差异性分析（表2）。研究结果发现，大坂山、乱石头山、昌麻河和巴颜喀拉山的甘肃雪灵芝植株平均株高均大于10 cm，显著高于苦海滩和昆仑山产区；而平均冠径则是昆仑山产区的甘肃雪灵芝植株最大（36.07±10.20） cm，且该产区的平均主根长最长（27.80±4.42） cm、根径最粗（1.40±0.59） cm，显著高于其他产区，苦海滩产区植株冠径最小（28.18±8.84） cm、主根长最短（26.27±4.05） cm。此外，甘肃雪灵芝叶形指数特征在不同产区群体间存在显著性差异，大坂山、乱石头山和巴颜喀拉山产的植株平均叶形指数较高，均超过20，而苦海滩产的最低（20.08±7.55）。

与此同时，通过上述表型性状与生态地理环境因子的Pearson相关性分析发现（表3），甘肃雪灵芝植株叶形指数、株高和冠径与年均降水、年均湿度呈正相关，与年均日照时数呈负相关；尤其叶形指数和株高与年均降水的正相关性达到显著水平（P<0.05），而株高与年均日照时数的负相关性也达到显著水平（P<0.05），这与甘肃雪灵芝植株形态学特征以及喜高寒高海拔湿润的气候环境相适应。此外，甘肃雪灵芝主根长和根径与这些生态地理环境因子均无显著相关性。

2.3 种群和群落特征

由于甘肃雪灵芝的生长环境较为严格，生态地理因子对其分布制约明显。该植株主要生长于高山流石坡和高寒草甸，呈片状或点状分布，种群分布较散，且各个种群间缺少交流环节（有关甘肃雪灵芝种群遗传多样性和遗传结构不在此分析）。此外，因缺乏灌、乔层的荫蔽作用使该植物常年直接暴露于强光下，强紫外线促进植物体大量合成黄酮和生物碱类物质，进而阻碍生长素的形成和活性，抑制茎的延伸，使该植株地上部分矮小呈垫状和簇状分布^{［17，20］}。其“垫状”习性的形成是高山极端环境条件下（高海拔、高寒、强紫外、强风）长期作用的结果。

甘肃雪灵芝独特的生长环境，导致其群落覆盖度较为单一，风毛菊属（Saussurea）、无心菜属（Arenaria）、龙胆属（Gentiana）、绿绒蒿属（Meconopsis）、红景天属（Rhodiola）、嵩草属（Kobresia）等植物为主要建群种。这些建群种能很好地反映甘肃雪灵芝生长群落的类型及其特征，伴生物种主要有水母雪莲（S. medusa）、唐古特雪莲（S. tangutica）、福禄草（A. przewalskii）、黑蕊无心菜（A. melanandra）、西南无心菜（A. forrestii）、线叶龙胆（G. farreri）、青藏龙胆（G. futtereri）、刺芒龙胆（G. aristata）、镰萼喉毛花（Comastoma falcatum）、总状绿绒蒿（M. racemosa）、全缘叶绿绒蒿（M. integrifolia）、唐古特红景天（R. algida）、狭叶红景天（R. kirilowii）、嵩草（K. myosuroides）、矮生嵩草（K. humilis）、喜马拉雅嵩草（K. royleana）、银露梅（Potentilla glabra）、金露梅（P. fruticosa）、短管兔耳草（Lagotis brevituba）。调查发现，甘肃雪灵芝生长的群落结构木本层构成较为单一，主要是金露梅和银露梅，草本层也较为简单，群落植物的科、属组成分散。群落的优势种群主要出现在草本层无心菜属、风毛菊属、龙胆属、嵩草属以及红景天属，其平均盖度相对较低（12.50±2.36）%，局部产区不到5.00%，群落植被覆盖率平均为（26.73±4.18）%。

2.4 含量测定方法学考察

2.4.1 线性关系考察

黄酮类化合物异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B的回归方程、线性范围和相关系数（r）分别如下：y=1.261×10⁴ x+15.337×10⁴ （4.22~98.36 μg/mL，r=0.9990），y=3.528×10⁴x+98.703×10⁴ （5.18~136.91 μg/mL， r=0.9982）， y=5.017×10⁴x-20.663×10⁴（6.34~162.75 μg/mL，r=0.9995），y=0.964×10⁴x+22.691×10⁴（4.10~81.54 μg/mL，r=0.9985）。

2.4.2 精密度、稳定性、重复性、回收率试验分析

① 精密度试验：异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B连续进样7次峰面积的平均RSD值分别为1.52%、1.39%、1.03%和1.15%，表明色谱仪器精密度良好。

② 稳定性试验：异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B在不同时间段内峰面积的平均RSD值分别为1.91%、1.83%、0.83%和1.56%，表明供试品溶液中上述化合物在24 h内稳定。

③ 重复性试验：异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B在同一产区药材中含量的平均RSD值分别为2.30%、2.18%、1.54%和1.73%，表明该方法重复性良好。

④ 回收率试验：异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B的平均加样回收率分别为97.66%、100.35%、99.13%和97.96%，RSD值分别为2.17%、2.60%、1.95%和2.45%，表明该方法准确度良好。

2.5 不同产区成分含量比较

对上述6个代表性产区的甘肃雪灵芝药材（地上部分）黄酮类化合物进行了含量测定（图2）。结果表明，苜蓿素在各个产区药材中的含量最高，异牡荆苷、异金雀花素和Salcolin B成分也在不同产区的药材中含量差异显著，尤以苜蓿素的含量差异最为明显，这与前人学者的研究结果一致^{［10，18］}，推测其原因可能与药材采集时间和采集产区有关，不同产区药材最宜采收时间应该是不一样的，后续将进一步探究相关原因。

在6个产区中，异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B成分在大坂山产的甘肃雪灵芝药材（地上部分）中含量均最高（图3），其值分别为0.037±0.006、0.090±0.010、0.322±0.044和0.069±0.010 mg/g，均显著高于其他产区（P<0.01）；苜蓿素除外，它在大坂山和乱石头山（0.318±0.042 mg/g）中含量相近。而异牡荆苷在各个产区中普遍较低，其范围为0.003±0.001（巴颜喀拉山）~0.037±0.006 mg/g（大坂山）；昆仑山产区中异金雀花素含量最低（0.008±0.001） mg/g，显著低于其他产区（P<0.01）；苦海滩产区所含上述黄酮类化合物均较低，尤以苜蓿素（0.039±0.008） mg/g和Salcolin（0.012±0.003） mg/g含量最低，且均显著低于其他4个产区（P<0.01）。此外，甘肃雪灵芝根部与地上部分中的化学成分差异明显（图2），且上述4个黄酮类化合物含量也较低，后续将进一步讨论该药材根部的化学成分及其含量。

3 讨 论

甘肃雪灵芝对生境要求严格，主要分布在我国青藏高原及其毗邻地区的流石坡和高山草甸，平均海拔4 000 m以上。作为多年生草本植物，甘肃雪灵芝密集的分枝和茎节间缩短被宿存的枯叶紧密包围而形成半圆形的“垫状”形态结构，这是与高山高寒、强风、巨大温差、强紫外线和强烈蒸发等严酷自然条件相适应的，从其分布的海拔高度和流石坡环境可以证明这是一典型高山植物类群^［21］。调查过程中还发现无心菜属中不同雪灵芝物种的生境、生物学特性和形态特征极为相似，生长在同一区域的不同物种有时难以辨认，如甘肃雪灵芝与青藏雪灵芝（A. roborowskii）、短瓣雪灵芝（A. brevipetala）、青海雪灵芝（A. qinghaiensis）花梗都被柔毛，叶、花瓣和萼片的形状、大小也较为相似；有的由于生态地理环境的差异，导致同一物种在不同地域的表型性状和繁殖生长期不一样，从而增加了各种雪灵芝物种的辨别难度。

独特的生态地理环境造就了丰富的雪灵芝资源，也使该药材资源富含黄酮、生物碱、多糖类等次级代谢产物，矿质元素、氨基酸等营养成分含量也较高。近些年来，随着甘肃雪灵芝在藏区的药食价值和生态价值的进一步发掘，迅速促使其成为藏药资源研究中的热点之一^{［11，12，16~18］}，资源的需求量也逐年增加。然而，过度的采挖和破坏导致甘肃雪灵芝野生资源急剧减少，部分产区甚至濒临枯竭，市场上资源品质参差不齐、产地来源混乱、成分地理变异明显，假冒伪劣品也较多，药材质量难以保障^{［17，18］}。因此，急需加强已有的甘肃雪灵芝野生资源的管护力度，大力发展野生抚育和人工栽植技术，建立良种选育、种苗繁育、种群繁殖、药材采收等为一体的野生抚育基地以及原料药生产基地；同时，应尽早开展和完善甘肃雪灵芝资源的综合评价和质量标准制定，保障药材资源稳定供给和药材产品的质量可控，实现甘肃雪灵芝藏药资源的可持续利用。

基于我们前期的研究报道^{［15，18］}，甘肃雪灵芝黄酮类成分在50 ℃下超声提取的效果较好，黄酮提取率和得率较高，优于常见的回流提取和微波提取，且上述3种提取方法得到的液相色谱峰差异不显著，因此本研究采用了效率高、能耗低、耗时短、操作简便的超声提取法进行实验。同时以异牡荆苷、异金雀花素、苜蓿素和Salcolin B为检测指标，考察了不同体积分数含水的乙醇和甲醇溶剂对上述黄酮类成分的提取效果，结果显示80%色谱甲醇的提取效率最高、且液相色谱峰形较好。在确定提取溶剂后，还考察了料液比、提取时间和超声功率的影响，研究发现在料液比1∶50（g/mL）、功率为300 W、超声提取30 min时，黄酮类化合物提取较为完全、浸膏得率达到18.0%，故本研究确定的最优提取条件是在料液比1∶50（g/mL）、温度50 ℃、功率300 W情况下采用80%色谱甲醇超声提取30 min。此外，色谱分析时，采用流动相A为水时容易造成洗脱后色谱峰较为集中，而更换成0.2%甲酸水时即可得到较为均匀的色谱峰、且峰形也得到了极大改善。

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基金资助

青海省应用基础研究项目(2019-ZJ-7082)

中国科学院“西部之光”青年学者A类项目(2019)