青藏高原横断山区饲用黄芪根瘤菌的抗逆性及系统发育分析

Stress resistance and phylogenetic analysis of rhizobia from fodder plant Astragalus in Hengduan Mountain area of Qinghai Tibet Plateau

摘要

分离纯化青藏高原横断山区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）原生野生饲用黄芪根瘤菌，为优良菌株的筛选提供种质资源。采用纯培养法从该地区部分饲用黄芪植物根瘤中分离纯化根瘤菌；通过16S rDNA序列同源性分析确定菌株的系统发育地位；通过测定菌株的耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围来分析饲用黄芪根瘤菌的抗逆性。从青藏高原横断山区7个县15个采样点获得10种饲用黄芪植物的根瘤，共分离纯化出36个根瘤菌菌株。16S rDNA序列同源性系统发育分析表明，36个菌株分别为根瘤菌属⁃土壤杆菌属（Rhizobium⁃Agrobacterium）30株、苍白杆菌属（Ochrobactrum）5株、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）1株，共3个群。生理性状测定试验表明，36个根瘤菌菌株中20株能在4~45 ℃的恒温条件下生长，15株能在4~50 ℃的恒温条件下生长，仅供试菌株SCAU509的最高耐受温度不能超过37 ℃，所有菌株能在经过60 ℃处理10 min后置28 ℃恒温条件下生长；除SCAU495只能在pH 6~8的培养基上生长，SCAU509只能在pH 5~8的范围内正常生长外，其余34株均能在pH 4~10的培养基上生长；SCAU509只能在1%NaCl以下的YMA培养基上生长外，其余供试菌株中最高能耐受1%、2%、3%、4%、5%、6%NaCl的数量分别为2、7、6、10、8和2株。本研究表明，青藏高原横断山区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）饲用黄芪根瘤菌中多数菌株对高盐、高温、低温及过酸过碱环境均具有较强的耐受能力。

Abstract

Stress resistance and phylogeny of the rhizobia from fodder plant Astragalus in high elevation area of western Sichuan were studied. Pure culture method was used for isolating the rhizobial strains from Astragalus nodules，16S rDNA sequencing was used for determining the phylogenetic status of the strain. The growth performance in different salt content， pH and temperature was tested. 36 strains were isolated from fodder plant Astragalus from 15 sampling site in 7 counties in the western Sichuan. Phylegenetic tree analysis showed that 30 strains were closely related to Rhizobium⁃Agrobacterium， 5 strains were Ochrobactrum， and 1 strain was Mesorhizobium. 20 strains isolates perfomed good growth in the temperature range of 4 °C to 45 °C， 15 strains in 4 °C to 50 ℃， and only SCAU509 in 4 °C to 37 ℃. All of 36 strains could grow at 28 °C after the treatment of 60 °C for 10 minutes. 34 strains strains could grow in the pH range of 4.0 to 10， while SCAU509 could only grow in pH 5 to 8， and SCAU495 could only grow in pH 6 to pH 8. SCAU509 could only grow below 1% NaCl concentraion， and other strains could grow in the range of 1% to 6% NaCl concentration. This study reveals that the most of these strains of rhizobia from fodder plant Astragalus have strong tolerance to high salt， high and low temperatures， over acid and over alkali environments.

Graphical abstract

关键词

饲用黄芪 / 根瘤菌 / 抗逆性 / 系统发育 / 青藏高原横断山区

Key words

fodder plant Astragalus / rhizobium / stress resistance / phylogeny / Hengduan Mountain area of Qinghai⁃Tibet Plateau

0 引 言

根瘤菌（Rhizobium）是一类能与豆科植物形成根瘤或茎瘤并进行高效固氮的土壤微生物，能在低氧分压的共生状态下固定空气中的游离态氮气，为植物提供氮素营养^［1］。豆科植物与根瘤菌共生体系不仅固氮能力强、固氮量大，而且抗逆性强，一方面能直接提高土壤肥力，另一方面通过植物的新陈代谢为人畜提供高蛋白质营养^［2］。黄芪（Astragalus）是广泛分布于我国南北各省区的豆科植物（Leguminosae），全世界约有2 000余种，分布于欧洲、亚洲、南美洲及非洲。我国278种2亚种35变种2变型，本属植物主要用于牲畜饲料、药用和绿肥^［3］。四川约有67种12变种1变型，其中甘孜州有47种9变种^［4］。黄芪的生长有利于草原，特别是高原草原的防风固沙、保持水土、绿化环境，并为牲畜提供饲用牧草。研究根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，能实现农业的可持续发展，有利于节约资源和保护环境。

四川阿坝州、甘孜州等区域内海拔1 500 m以上的横断山区为川西高海拔地区，位于青藏高原东部。其中，甘孜州属青藏高原气候，年均气温在5~10 ℃之间，年降水量在400~1 000 mm之间；阿坝州山原地带为温凉半湿润气候，夏秋温凉，冬春寒冷，干湿季明显；高山潮湿寒冷，河谷干燥温凉，年平均气温5.6~8.9 ℃。

为进一步明确四川黄芪根瘤菌物种资源现状，并为选育具有较强抗性基因的菌种提供资源，本研究从采集自四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州的10种饲用黄芪植物根瘤中分离纯化出根瘤菌，通过测定分离株的耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围等生理指标研究其抗逆能力，以分析高寒山区根瘤菌的适应能力；采用16S rDNA序列分析方法，研究该区域饲用黄芪根瘤菌的分类学地位。这10种黄芪分别为线苞黄芪（A.peterae）、多枝黄芪（A.Polycladus）、四川黄芪（A.sutchuenensis）、紫萼黄芪（A.porphyrocalyx）、丛生黄芪（A.confertus）、广布黄芪（A.frigidus）、黄花黄芪（A.luteolus）、小苞黄芪（A.prattii）、宽爪黄芪（A.latiunguiculatus）和牧场黄芪（A.pastorius）。其中，四川黄芪、宽爪黄芪和牧场黄芪是中国的特有植物^［3］。

1 材料和方法

1.1 饲用黄芪植物根瘤的采集及其根瘤菌的分离和纯化

饲用黄芪植物根瘤及土壤样品采集自四川甘孜州康定、道孚、理塘、炉霍、甘孜、稻城、雅江等7个县14个采样点及四川阿坝州黄龙寺，并记录了根瘤的形状及结瘤部位（表1）。

饲用黄芪植物根瘤菌的分离和纯化参照Vincent^［5］的方法。用无菌水浸泡清洗根瘤，再用75%酒精和0.1% HgCl₂分别对根瘤表面消毒5 min和3 min，在无菌培养皿中磨碎根瘤，取根瘤悬液在酵母菌甘露醇琼脂培养基（yeast mannitol agar， YMA）平板上划线，置28 ℃恒温箱中培养3~5 d，挑取表面湿润、光滑、突起、有多糖产生的单菌落，采用划线法纯化、革兰氏染色镜检，纯菌株接种于YMA斜面，28 ℃培养3 d，4 ℃短期保藏，30%甘油管中-‍80 ℃长期保藏。分离的供试菌株见表1。

1.2 菌株生理特性分析

对36株根瘤菌分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围的测定。

耐盐性测定：在YMA培养基中加入NaCl，使其终浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%。每个菌株在同一浓度的测定均设9个重复实验。以不含NaCl的YMA平板为阳性对照。接种、培养、观察和记录结果。

初始pH生长范围测定：在倒平板前，用灭菌的HCl和NaOH将YMA培养基的pH调至4.0、5.0、9.0、10.0、11.0。每个菌株在同一pH的测定均设9个重复实验。以pH 7.0的YMA平板为阳性对照。接种、培养、观察和记录结果。

生长温度范围测定：将供试菌株接种到YMA平板上，以28 ℃生长的平板为阳性对照，分别在4 ℃、10 ℃、37 ℃、45 ℃条件下培养，60 ℃处理10 min后于28 ℃培养。每个菌株在同一温度条件的测定均设9个重复实验。接种、培养、观察和记录结果。

1.3 饲用黄芪根瘤菌16S rDNA系统发育分析

以总DNA为模板，选用来源于大肠杆菌16S rDNA基因序列保守区域的两段引物P1和P6来扩增16S rDNA。正向引物P1：5'⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT⁃3'。其序列对应于E.coli第8~37碱基位置；反向引物P6：5'⁃TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC⁃3'。其序列对应于E. coli第1 479~1 506碱基位置。反应体系（30 µL）：2×PCR Mix 15 µL；引物1（10 µmol/L）0.5 µL；引物6（10 µmol/L） 0.5 µL；模板DNA（50 ng/µL） 0.5 µL；双蒸水13.5 µL。PCR反应程序：92 ℃变性3 min；94 ℃变性l min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次；72 ℃最终延伸10 min。4 ℃保存。16S rDNA扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳（150 V，30 min）检测，UV凝胶成像系统成像，JPG形式保存。扩增片段长度为1.5 kb左右，将扩增产物保存于-20 ℃备用。

16S rDNA片段选用了4种限制性内切酶，分别为HaeIII、MspI、HinfI和TaqI。酶切反应体系（10 µL）：5 µL PCR扩增产物，5 U内切酶，10×酶切缓冲液1 µL，双蒸水补足至10 µL。37 ℃水浴保温6~10 h （Taq I为65 ℃恒温12~14 h），2%琼脂糖凝胶（含EB）电泳（80 V）2~3 h（酶切产物上样量8 µL），UV凝胶成像系统成像，JPG形式保存。

扩增产物（1 500 bp）经检测后送北京华大基因有限公司测定序列。

1.4 数据分析和处理

材料间遗传相似系数（GS）的计算采用Nei^［6］ 的方法。在GenBank 数据库中获取饲用黄芪根瘤菌的序列号（表1）。

2 结果与分析

2.1 饲用黄芪根瘤菌的分离纯化和抗逆性分析

本研究从10种饲用黄芪植物（线苞黄芪，多枝黄芪，四川黄芪，紫萼黄芪，丛生黄芪，广布黄芪，黄花黄芪，小苞黄芪，宽爪黄芪，牧场黄芪）根瘤中分离纯化出36个根瘤菌菌株并全部作为供试菌株。

生理性状测定试验表明，20株菌株能在4~45 ℃的恒温条件下生长，15株能在4~50 ℃的恒温条件下生长，仅SCAU509的最高耐受温度不能超过37 ℃，所有菌株能在经过60 ℃处理10 min后置28 ℃恒温条件下生长，表明供试根瘤菌对温度的适应范围较宽，对温度的耐受性表现出较大的多样性；初始pH生长范围测定结果显示，除SCAU495只能在pH 6~8的培养基上生长，SCAU509只能在pH 5~8的范围内生长外，其余34株菌株均能在pH 4~10的培养基上生长；耐盐性实验结果表明，除SCAU509只能在1%NaCl以下的YMA培养基上生长外，其余供试菌株最高能耐受1%、2%、3%、4%、5%、6%NaCl的数量分别为2、7、6、10、8和2株（表2）。

2.2 饲用黄芪根瘤菌16S rDNA序列测定和系统发育分析

采用Blast search 在线分析及DNAMAN 6.0软件进行序列比对，找出各序列在NCBI数据库中最近缘种的模式菌株序列，再用MEGA 5.0中的Clustal X程序进行多序列比对，然后用Neighbor⁃Joining方法选择Bootstrap为1 000个重复构建系统发育学进化树。

对36个饲用黄芪供试菌株进行BOXAIR、16S rDNA⁃RFLP及PCA的综合分析后，选择其中26个代表菌株的16S rDNA扩增产物送北京华大基因科技股份有限公司进行测序，构建出以16S rDNA序列为基础的系统发育树状图（图1）。

26个代表菌株在系统发育树状图中聚成三个遗传群：供试菌株SCAU509与中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）聚群，与百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobium loti） NZP2213的相似度为99%；供试菌株SCAU527和SCAU553与苍白杆菌属（Ochrobactrum）聚群，其中，供试菌株SCAU527和苍白杆菌属QW34的相似度为100%，供试菌株SCAU553与苍白杆菌属SZ036的相似度为99%。其余23个代表菌株均聚在根瘤菌⁃土壤杆菌（Rhizobium⁃Agrobacterium）遗传群，但多数供试菌株的16S rDNA序列与快生根瘤菌属的参比菌株相似度最高。其中，供试菌株SCAU501、SCAU528、SCAU555、SCAU560、SCAU577聚成一个亚群，比对结果显示，供试菌株SCAU501与根瘤菌A1Bc7，供试菌株SCAU555与根瘤菌KB10的相似度均为99%；在由17个代表菌株聚成另一个亚群中，供试菌株SCAU465与根瘤菌CCNWSX0504、供试菌株SCAU500与根瘤菌MN7、供试菌株SCAU502与根瘤菌3041、供试菌株SCAU526与根瘤菌XjGEB⁃70、供试菌株SCAU559与根瘤菌SEMIA439、供试菌株SCAU564与根瘤菌JCM28659、供试菌株SCAU586与根瘤菌XjGEN⁃53、供试菌株SCAU602与根瘤菌3089的相似度均为99%。

3 讨 论

目前，人们对中国黄芪根瘤菌资源已进行了多项研究调查。通过对分离自甘肃、宁夏、内蒙古自治区、山西、吉林等地区的36株黄芪根瘤菌的多样性研究，测定了黄芪根瘤菌新表观群的中心菌株CA8561和JL84与近缘已知根瘤菌属种模式菌株或参比菌株的DNA同源性。结果表明，分离自中国北方地区的部分黄芪根瘤菌菌株形成了独立的新的DNA同源群，结合其他分类技术的研究结果可以认为这些菌株构成了一个新种^［7］；进一步对CA8561和JL84这两个中心菌株进行16S rDNA全序列系统发育分析，结果表明CA8561位于根瘤菌属分支，JL84则位于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）分支^［8］。对来自陕甘宁地区5种黄芪植物扁茎黄芪（Astragalus complanulus）、直立黄芪（Astragalus adsurgens）、糙叶黄芪（Astragalus scubuerrumus）、金翼黄芪（Astragalus chrysupterus）和内蒙黄芪（Astragalus mongulicus）根瘤的20株黄芪根瘤菌进行了C、N源利用、抗生素抗性、耐逆性和酶活性研究。结果表明，不同地区，甚至同一地区或同种寄主来源的菌株存在着多样性。在75%的相似性水平上，以UPGMA聚类，分成5个表观群，其与已知根瘤菌M.huakuii明显不同^［9］。

16S rDNA序列分析是能较精确地揭示根瘤菌的系统进化关系的一个重要手段^［10］。本研究中，16S rDNA序列比对结果表明，36个饲用黄芪根瘤菌菌株中根瘤菌属⁃土壤杆菌属30株、苍白杆菌属5株、中慢生根瘤菌属1株。在系统发育树状图中，30个供试菌株SCAU542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568聚在根瘤菌属⁃土壤杆菌属：表明根瘤菌属与土壤杆菌属在种的系统发育上互有交叉，这与国外学者对慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），中慢生根瘤菌属，根瘤菌属和中华根瘤菌属的16S rDNA序列分析研究结果相一致^［11］。

一般认为，根瘤菌的最适生长温度为25~30 ℃，只有少数苜蓿根瘤菌菌株在42.5 ℃下生长，极少数根瘤菌在4 ℃条件下生长^［12］。对饲用黄芪根瘤菌供试菌株生长温度测定结果显示，20株菌株能在4~45 ℃的恒温条件下生长，15株能在4~50 ℃的恒温条件下生长，仅SCAU509的最高耐受温度不能超过37 ℃，所有菌株能在经过60 ℃处理10 min后置28 ℃恒温条件下生长。表明供试根瘤菌对温度的适应范围较宽，对温度的耐受性表现出较大的多样性。

根瘤菌生长的最适pH为6~7。对36个饲用黄芪根瘤菌供试菌株初始pH生长范围测定结果显示，除SCAU495只能在pH 6~8的培养基上生长，SCAU509只能在pH 5~8的范围内正常生长外，其余34株菌株均能在pH 4~10的培养基上生长。这表明绝大多数饲用黄芪根瘤菌有较强的耐酸碱能力。

供试菌株SCAU495、SCAU496、SCAU497、SCAU498、SCAU499、SCAU500、SCAU501、SCAU502分离自同一个植株（多枝黄芪，海拔3 270 m）。其中，供试菌株SCAU495只能在pH 6~8的培养基上生长，其余菌株能耐受pH 4~10的酸碱环境；供试菌株SCAU512、SCAU509分离自同一个植株（多枝黄芪，海拔4 100 m），其中，SCAU512（根瘤菌属）能耐受pH 4~10的酸碱环境，而SCAU509（中慢生根瘤菌属）只能在pH 5~8的培养基上生长，表明同一宿主不同菌株的耐酸碱能力也有明显差异，这种差异性可能与根瘤菌产酸或产碱的生理特性所决定，分泌酸的根瘤菌对偏碱的条件耐受性较强^［13］。

在影响微生物生长的胁迫因素中，盐分被认为是最具危害性的非生物类胁迫因素之一^［14］。对18株分离自陕甘宁地区的扁茎黄芪、直立黄芪、糙叶黄芪、金翼黄芪和内蒙黄芪这5种黄芪植物根瘤菌的耐盐试验表明，全部供试菌株都能耐l%~2%的NaCI，45%的菌株耐3%的NaC1，少数菌株耐4%的NaC1；全部供试菌株在pH为4~5的酸性环境中不能生长，却在pH为11的碱性环境中能生长，与其他来源的根瘤菌相比，它们具有较强的耐碱能力^［9］。本研究中，除SCAU509只能在1%NaCl以下的YMA培养基上生长外，其余35株供试菌株中最高能耐受1%、2%、3%、4%、5%、6%NaCl的比例分别为2、7、6、10、8、2株。这表明川西高海拔地区饲用黄芪根瘤菌中多数菌株对高盐环境均具有较强的耐受能力。供试菌株SCAU512、SCAU509分离自同一个植株（多枝黄芪，海拔4 100 m），其中，SCAU512（根瘤菌属）能在8%NaCl的培养基上生长，而SCAU509（中慢生根瘤菌属）只能在低于1%NaCl的培养基上生长，表明与同一宿主共生的根瘤菌在不同环境中的耐盐能力具有菌株的差异性。从适应性方面分析，耐盐性强的根瘤菌在实际开发应用中意义更大。

生长在高寒地区的根瘤菌在长期的自然选择过程中，形成了与自然环境条件相适应的耐高盐、耐过酸过碱和耐高温低温的类型，因此，研究高寒地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和抗逆性，能为选育具有较强抗性基因的菌种提供资源。在后期的研究中，对供试菌株进一步进行遗传多样性分析，尤其对16SDNA序列与已知菌株差异性较大的供试菌株进行分子生物学研究，确定是否有新种存在；同时，选择抗逆性较强、固氮性能良好（专项研究）的菌株参与制成微生物菌肥，应用于现代农业生产。

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