向日葵花盘水提物对硫色镰刀菌及其细胞壁降解酶活性抑制特性

Inhibitory characteristics of water extract of sunflower disc on Fusarium sulphureum and its cell wall degrading enzyme activity

摘要

通过抑菌及细胞壁降解酶活性试验，研究向日葵花盘（sunflower disc，SFD）水提物对引起马铃薯干腐病主要病原菌——硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）生长及其侵染不同马铃薯品种时分泌的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（polymethyl⁃galacturonase，PMG）、纤维素酶（carboxymethyl cellulose，Cx）、β⁃葡萄糖苷酶活性变化。结果表明，向日葵花盘水提物对硫色镰刀菌生长及侵染陇薯7号、陇薯10号、新大坪3个马铃薯品种分泌的4种细胞壁降解酶活性均具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL，在0~640 mg/mL浓度内，随浓度增大，对硫色镰刀菌生长的抑制作用增强；经最佳抑制浓度处理能使陇薯7号的PG和β⁃葡萄糖苷酶活性降低到未侵染水平，但β⁃葡萄糖苷酶活性的降低未达到极显著效果，该处理不能使陇薯7号的PMG和Cx及陇薯10号、新大坪的4种细胞壁降解酶活性降低到未侵染水平。

Abstract

By methods of bacteriostatic test and cell⁃wall degrading enzyme activity test， this study investigated the biological control effect of water extract from sunflower disc on Fusarium sulphureum and the activities of 4 cell⁃wall degrading enzymes. Polygalacturonase（PG）， polymethyl⁃galacturonase（PMG）， carboxymethyl cellulose（Cx） and β⁃glucosidase were 4 cell⁃wall degrading enzymes secreted by Fusarium sulphureum invading the different potato varieties. Results show that the extract is of inhibition effects on Fusarium sulphureum and activities of 4 cell⁃wall degrading enzymes secreted by Fusarium sulphureum invading potato tubers from 3 potato varieties of Longshu No. 7， Longshu No. 10 and Xindaping， and the best inhibition occurrs at the concentration of 320 mg/mL. With the increasing of concentration in the range of 0 to 640 mg/mL， the inhibition effect on Fusarium sulphureum increased. Treated by the extract of the best concentration， the activities of polygalacturonase（PG） and β⁃glucosidase of Longshu No. 7 can be reduced to the uninfected level， but the reduction of β⁃glucosidase activity did not achieve a very significant effect. The activities of polymethyl⁃galacturonase（PMG） and carboxymethyl cellulose（Cx） of Longshu No. 7 and the activities of 4 cellwall degrading enzymes of Longshu No. 10 and Xindaping could not be reduced to uninfected levels.

关键词

向日葵花盘 / 硫色镰刀菌 / 马铃薯干腐病 / 细胞壁降解酶

Key words

sunflower disc / Fusarium sulphureum / potato dry rot / cell wall degrading enzyme

0 引 言

干腐病是常见的马铃薯块茎采后病害，由其引起的块茎腐烂约占病薯的88.5%，对全球马铃薯产量构成严重影响^［1~3］。干腐病的主要病原微生物为硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum），它可以经马铃薯皮孔、芽眼、创口等部位侵入块茎组织，通过分泌多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase， PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（polymethyl⁃galacturonase， PMG）、纤维素酶（carboxymethyl cellulose， Cx）、β⁃葡萄糖苷酶等细胞壁降解酶破坏寄主细胞细胞壁和胞间层^［4~7］，并产生以单端孢霉烯毒素为主，具有抑制细胞有氧呼吸反应、破坏细胞膜等作用的多种真菌毒素进一步破坏寄主细胞，并摄取营养物质，导致马铃薯块茎腐败、干枯^［8，9］。单端孢霉烯毒素污染范围广、污染率高，且具有致癌、致畸、致突变作用，对人畜健康构成严重威胁^{［10，11］}。

目前，在农业领域针对马铃薯干腐病的防治以采用广谱抑菌剂噻苯咪唑为主^［12］，然而噻苯咪唑的过量使用对人体具有致癌、致畸及肝肾损伤等健康隐患，国家对食用农产品中噻苯咪唑的残留量有严格的限定标准。为探索新的马铃薯干腐病防治方法，国内外针对抑制其病原微生物硫色镰刀菌的物质开展了大量研究。有学者从洋葱皮中提取到对硫色镰刀菌具有抑制作用的物质^［13］；有研究证实壳聚糖对硫色镰刀菌及尖孢镰刀霉（Fusarium oxysporum）具有生长抑制作用^{［14，15］}；还有学者发现二氧化氯可抑制硫色镰刀菌侵染马铃薯块茎组织后的孢子萌发和菌丝生长^［16］；通过硫色镰刀菌侵染经茶多酚处理陇薯3号马铃薯块茎切片试验，证明茶多酚对硫色镰刀菌菌落扩展及产毒能力具有抑制作用^［17］。尽管马铃薯干腐病防治的研究取得一定进展，但仍无针对该病的特效药剂^［18］。

向日葵（Helianthus annuus L.）属菊科（Asteraceae）向日葵属（Helianthus）一年生植物，是生产葵花籽油的原料，向日葵花盘提取后的重要副产物，目前主要用于动物饲料。研究表明，向日葵花盘水提物成分多为活性多糖、果胶等，向日葵花盘中提取的水溶性粗多糖具有抗氧化活性，向日葵花盘还可以作为天然的低脂果胶原料。国内外已有大量关于向日葵花盘中具有抑菌作用的高级物质研究成果：如向日葵花盘中具有抑菌作用的绿原酸含量为0.227%^［19］；有研究证实向日葵花盘中的萜类物质对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有抑制作用^［20］；且向日葵萜类提取物可抑制白菜黑斑病菌（Helternaria brassicae）、苹果干腐病菌（Botyosphaeria ribis）等多种植物病原菌^［21］。本研究从硫色镰刀菌生长与该菌分泌细胞壁降解酶活性两方面进行评价，对向日葵花盘水提物防治马铃薯干腐病的特性进行研究，以期为马铃薯干腐病防治及提高向日葵作物利用率等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

干制向日葵花盘（sunflower disc， SFD），由甘肃省兰州新区敬业向日葵产业园有限责任公司提供；马铃薯品种陇薯7号、陇薯10号、新大坪，由甘肃省农业科学院马铃薯研究中心提供；硫色镰刀菌菌种由甘肃农业大学提供。

1.2 试验方法

1.2.1 硫色镰刀菌培养皿抑菌试验

将SFD粉碎，过65目筛。料液比1∶10（m_sfd∶m_水），浸提3~5 d，3 000 r/min离心15 min，上清液旋蒸浓缩、冷冻干燥得冻干粉，于冰箱中4 ℃保藏备用。

将冻干粉配制成0、10、20、40、80、160、320、640 mg/mL 8个浓度的水溶液并灭菌。向9个灭菌培养皿中各加入20 mL马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA），待培养基凝固后，分别取各溶液1 mL加入到8个培养皿中并涂布均匀，不做处理的培养皿作为空白对照（CK）。每个培养皿内等距离倒置接入3个直径6 mm的硫色镰刀菌菌饼，培养7 d，所有培养皿于培养箱中28 ℃恒温培养24 h，用游标卡尺以十字交叉法分别测量3个硫色镰刀菌菌饼产生的菌落直径，计算平均值。

1.2.2 细胞壁降解酶活性试验

①PG与PMG活性测定。将同一品种外观无损伤的马铃薯块茎清洗后用0.1%次氯酸钠溶液浸泡20 min，无菌水冲洗，无菌条件下制成15个厚10 mm直径50 mm圆形切片，用无菌水清洗切片后，置于无菌湿滤纸上，黑暗恒温恒湿静置1 h。配制抑菌试验中最佳抑菌浓度及两个相近浓度SFD水提物溶液，将3个不同浓度SFD水提物溶液分别滴加0.1 mL于静置1 h后的马铃薯切片上，涂布均匀，作为试验组，每个试验组做3个平行。将12个直径6 mm的硫色镰刀菌菌饼倒置接种于试验组切片和3个未处理切片中心，培养7 d，未处理切片作为侵染对照组（CT），另3个未处理切片接入与菌饼同样大小的PDA无菌培养基作为空白组（CK）。所有切片28 ℃恒温培养2 d后，取3 g切片组织，分别与6 mL 95%乙醇混合，冰浴研磨匀浆，低温静置10 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，倾去上清液，向沉淀物中加入3 mL预冷80%乙醇，振荡，低温放置10 min，同条件下离心。倾去上清液，向沉淀中加入5 mL缓冲提取液（50 mmol/L，pH 5.5，含1.8 mol/L NaCl的乙酸⁃乙酸钠缓冲液），4 ℃静置20 min，离心收集细胞壁降解酶提取液，4 ℃保存备用。

将加有1.0 mL乙酸⁃乙酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.5）、0.5 mL 10 g/L底物（PG为多聚半乳糖醛酸，PMG为果胶），0.5 mL酶提取液的试管，混匀，37 ℃恒温水浴1 h后，再加入1.5 mL 3，5⁃二硝基水杨酸（DNS），沸水浴煮沸5 min，迅速冷却至室温，540 nm波长下测定吸光值。

采用3，5⁃二硝基水杨酸法制作葡萄糖毫克数与吸光值之间的标准曲线，根据酶解反应释放的还原糖量计算PG、PMG活性。酶活性单位以每小时每克马铃薯组织（鲜重）在37 ℃催化底物水解生成还原糖的质量表示（mg/h·g）。

酶活性（PG与PMG）=\frac{\mathrm{1.08}{m}^{\mathrm{\text{'}}}V}{V_{S}tm}

式中：m'，从标准曲线上查得的葡萄糖质量（mg）；V，样品提取液总体积（mL）；V_S，测定时所取样品提取液体积（mL）；t，酶促反应时间（h）；m，样品质量（g）；1.08，葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数（194/180）。

②Cx与β⁃葡萄糖苷酶活性的测定。除底物不同外（C_X底物为1.5 mL 10 g/L羧甲基纤维素钠CMC，β⁃葡萄糖苷酶底物为1.5 mL 10 g/L水杨苷），其测定方法与PG与PMG活性测定相同。C_X和β⁃葡萄糖苷酶活性单位以每小时每克马铃薯组织（鲜重）在37 ℃催化底物水解形成还原糖的质量表示，即（mg/h·g）。

酶活性（Cx与β⁃葡萄糖苷酶）=\frac{m^{\mathrm{\text{'}}}V}{V_{S}tm}

式中，m'，从标准曲线上查得的葡萄糖质量（mg）；V，样品提取液总体积（mL）；V_S，测定时所取样品提取液体积（mL）；t，酶促反应时间（h）；m，样品质量（g）。

1.2.3 数据处理与分析

①抑菌试验计算经各浓度水提物处理的培养皿中3个菌落直径平均值，分析菌落直径平均值随水提物浓度增加的变化趋势。根据菌落直径平均值大小在P<0.05水平上的显著性分析，确定SFD水提物最佳抑菌浓度。选取该浓度及与其相近的两个浓度值，作为细胞壁降解酶活性试验中SFD水提物浓度。

②细胞壁降解酶活性试验。同品种马铃薯细胞壁降解酶活性试验中，分别计算同种细胞壁降解酶活性CT、CK及各浓度试验组3个平行试验的平均值，并分别在P<0.05和P<0.01水平上对各组细胞壁降解酶活性平均值大小进行显著性分析，判断3个浓度是否在该马铃薯品种上对该细胞壁降解酶活性具有抑制作用。

2 试验结果

2.1 硫色镰刀菌抑菌试验

菌落直径与抑菌液浓度关系如表1所示。在0~640 mg/mL浓度范围中，所有试验组的菌落直径均小于空白对照组，说明SFD水提物在其溶解度范围内对硫色镰刀菌具有一定的抑制作用。随着浓度增大，硫色镰刀菌的菌落直径逐渐减小。在0至320 mg/mL范围内，菌落直径和溶液浓度符合线性关系，关系式为y=-0.008 3 x+11.449，相关系数R² =0.990 3。当浓度高于320 mg/mL时，随着浓度的增加，菌落直径不再显著减小，说明当浓度大于320 mg/L时，SFD水提物溶液对硫色镰刀菌的抑制作用趋于稳定。综上分析，SFD水提物对硫色镰刀菌的最佳抑菌浓度为320 mg/mL。设置 300、320、340 mg/mL 3个浓度作为细胞壁降解酶活性试验中的SFD水溶液浓度梯度。

2.2 SFD水提物抑制硫色镰刀菌分泌细胞壁降解酶活性试验

2.2.1 硫色镰刀菌侵染陇薯7号马铃薯分泌细胞壁降解酶活性试验

细胞壁降解酶活性如表2所示。PG活性抑制试验中，在P<0.05和P<0.01水平时，320 mg/mL与340 mg/mL处理的活性低于CT并与CK处于同一水平，300 mg/mL处理的活性与CT处于同一水平。

PMG与Cx活性抑制试验中，3个试验组活性在P<0.05和P<0.01时均低于CT，高于CK。PMG的3个试验组活性在P<0.05和P<0.01时处于同一水平。Cx的3个试验组活性在P<0.01时处于同一水平，在P<0.05时，320 mg/mL处理的活性低于300 mg/mL与340 mg/mL。

β⁃葡萄糖苷酶活性的抑制试验中，CT的活性在P<0.05和P<0.01时均高于3个试验组。320 mg/mL和340 mg/mL处理的活性在P<0.05和P<0.01时处于同一水平且均低于300 mg/mL。在P<0.05时，CK的活性与320 mg/mL和340 mg/mL处于同一水平且低于300 mg/mL，在P<0.01时，3个试验组的活性均高于CK。

以上结果表明：SFD水提物对硫色镰刀菌侵染陇薯7号马铃薯分泌的4种细胞壁降解酶（PG、PMG、Cx、β⁃葡萄糖苷酶）活性具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL。经最佳浓度处理可使PG和β⁃葡萄糖苷酶活性降低到未侵染的正常水平，但对β⁃葡萄糖苷酶活性的降低未达到极显著效果，最佳浓度不能使PMG和Cx活性降低到未经硫色镰刀菌侵染的正常水平。

2.2.2 硫色镰刀菌侵染陇薯10号马铃薯分泌细胞壁降解酶活性试验

细胞壁降解酶活性如表3所示。4种细胞壁降解酶活性抑制试验在P<0.05和P<0.01时，3个浓度的试验组活性均低于CT，高于CK。320 mg/mL处理的PG活性低于另外两个浓度，PMG、Cx、β⁃葡萄糖苷酶活性低于300 mg/mL且与340 mg/mL处于同一水平。说明SFD水提物对硫色镰刀菌侵染陇薯10号马铃薯上分泌的4种细胞壁降解酶活性均具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL，但不能使4种细胞壁降解酶活性降低到未侵染的正常水平。

2.2.3 硫色镰刀菌侵染新大坪马铃薯分泌细胞壁降解酶活性试验

细胞壁降解酶活性如表4所示。4种细胞壁降解酶活性在P<0.05和P<0.01时，试验组活性均低于CT，高于CK。320 mg/mL处理的PG与β⁃葡萄糖苷酶活性低于300 mg/mL且与340 mg/mL处于同一水平，PMG与Cx活性低于另外两个浓度，说明SFD水提物对硫色镰刀菌在新大坪马铃薯上分泌的4种细胞壁降解酶活性具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL，但不能使4种细胞壁降解酶活性降低到未经侵染的正常水平。

3 讨 论

SFD水提物对硫色镰刀菌的生长具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL。对硫色镰刀菌侵染陇薯7号、陇薯10号、新大坪3个马铃薯品种块茎时分泌的4种细胞壁降解酶（PG、PMG、Cx、β⁃葡萄糖苷酶）活性具有抑制作用，最佳抑制浓度为320 mg/mL。经最佳抑制浓度的SFD水提物处理，被硫色镰刀菌侵染的陇薯7号品种的PG和β⁃葡萄糖苷酶活性能降低到未侵染水平，但对β⁃葡萄糖苷酶活性的降低未达到极显著效果。SFD水提物不能使被硫色镰刀菌侵染的陇薯7号品种的PMG和Cx及陇薯10号、新大坪品种的4种细胞壁降解酶（PG、PMG、Cx、β⁃葡萄糖苷酶）活性降低到未侵染水平。

本试验利用向日葵花盘水提物，在实验室条件下对马铃薯干腐病防治作用进行初步探索，其结果在马铃薯干腐病防治和向日葵花盘副产物综合利用等方面具有重要意义。但由于向日葵花盘水提物成分复杂，以及实验室的条件局限性，该试验仅为向日葵花盘在马铃薯干腐病防治领域的初步研究。

向日葵花盘对马铃薯干腐病防治作用的研究机理，需在向日葵花盘水提物进一步提取、分离的基础上，分别研究其不同成分对马铃薯干腐病的防治作用，对有效成分进行筛选。确定向日葵花盘水提物中对马铃薯干腐病防治起有效作用的具体物质后，利用确定的有效成分在实际环境中对马铃薯干腐病进行防治研究，进一步评价向日葵花盘在马铃薯干腐病防治领域的应用价值。通过设计合理的生产提取工艺，将向日葵花盘转化成防治马铃薯干腐病的新型产品，使去籽后的向日葵花盘得到重新利用，也为马铃薯干腐病防治开辟一条经济环保的新途径。

参考文献

[1] Li X D, Xue H L. Antifungal activity of the essential oil of Zanthoxylum bungeanum and its major constituent on Fusarium sulphureum and dry rot of potato tubers [J]. Phytoparasitica, 2014, 42(4): 509⁃517.

[2] 何苏琴,金秀琳,魏周全,等.甘肃省定西地区马铃薯块茎干腐病病原真菌的分离鉴定[J].云南农业大学学报,2004, 19(5): 550⁃552.

[3] He S Q, Jin X L, Wei Z Q, et al. Isolation and identification of pathogens causing dry rot of potato tuber in Dingxi Prefecture of Gansu Province [J]. Journal of Yunnan Agricultural University, 2004, 19(5): 550⁃552.

[4] Tiwari R K, Kumar R, Sharma S, et al. Potato dry rot disease: current status, pathogenomics and management [J].3 Biotech, 2020, 10(11): 1⁃18.

[5] 张紊玮,王艳玲,毕阳,等.一株马铃薯干腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其生物防效[J].微生物学通报,2018, 45(8): 1726⁃1736.

[6] Zhang W W, Wang Y L, Bi Y, et al. Screening and identification of an antagonistic strain against potato dry rot [J]. Microbiology China, 2018, 45(8): 1726⁃1736.

[7] 裴慧兰, 王爱军.马铃薯干腐病发生规律及防治措施[J].现代农业技,2017(7): 123,127.

[8] Pei H L, Wang A J. Occurrence regularity and control measures of potato dry rot [J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2017(7): 123, 127.

[9] Yang Z M, Bi Y, Kou Z H, et al. Changes of cell wall degrading enzymes in potato tuber tissue slices infected by Fusarium sulphureum [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012,45(1): 127⁃134.

[10] 柴莹, 徐永清, 付瑶, 等.马铃薯干腐病病原镰孢菌体内产细胞壁降解酶特性研究[J].作物杂志,2018(4): 154⁃160.

[11] Chai Y, Xu Y Q, Fu Y, et al. Characteristics of cell wall degradation enzyme produced by main pathogenic Fusarium spp. in potato dry rot [J]. Crops, 2018(4): 154⁃160.

[12] 王文重,闵凡祥,杨帅,等.我国马铃薯干腐病及其防治研究进展[J]. 中国蔬菜,2020(4): 22⁃29.

[13] Wang W C, Min F X, Yang S, et al. Research progress on potato dry rot disease in China and its control measures[J]. China Vegetables, 2020(4): 22⁃29.

[14] Xue H L, Bi Y, Tang Y M, et al. Effect of cultivars, fusarium strains and storage temperature on trichothecenes production in Inoculated potato tubers [J]. Food Chemistry, 2014, 151(15): 236⁃242..

[15] 税丕容.食品中真菌毒素的污染与检测研究进展[J]. 现代食品,2018,46 (13):130⁃131, 136.

[16] Shui P R. Research progress on contamination and detection of mycotoxins in foods [J]. Modern Food, 2018, 46 (13): 130⁃131, 136.

[17] 刘英,尹京晨,计惠芬,等.基于范数指数构效关系预测单端孢霉烯真菌毒素毒性[J]. 天津科技大学学报,2018,33(2):32⁃37.

[18] Liu Y, Yin J C, Ji H F, et al. Structure⁃activity relationship for predicting the toxicity of trichothecene mycotoxins based on norm indexes [J]. Journal of Tianjing University of Science and Technology, 2018, 33(2): 32⁃37.

[19] Li Y C, Yang Z M, Bi Y, et al. Antifungal effect of borates against Fusarium sulphureumin on potato tubers and its possible mechanisms of action [J]. Postharvest Biology and Technology, 2012, 74: 55⁃61.

[20] Qiu Y, Zhao P, Rui W J, et al. Ultrastructural aspects of Fusarium sulphureum and Alternaria alternate affected by extracts of onion peel [J]. Journal of Biobased Materials and Bioenergy, 2017, 11(3): 193⁃199.

[21] Li Y C, Sun X J, Bi Y. Antifungal activity of chitosan on Fusarium sulphureumin relation to dry rot of potato tuber [J]. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(5): 597⁃604..

[22] Ren J, Tong J, Li P H, et al. Chitosan is an effective inhibitor against potato dry rot caused by Fusarium oxysporum [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2021, 113: 1⁃9.

[23] Li M, Tian S L, Shen J, et al. Effects of chlorine dioxide on morphology and ultrastructure of Fusarium sulphureum and its virulence to potato tubers [J]. International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 2017, 10(5): 242⁃250..

[24] 付国瑞,张艳芳.茶多酚对硫色镰刀菌生长及产毒能力的影响[J].植物保护学现代农业科技, 2018(12): 108⁃110.

[25] Fu G R, Zhang Y F. Effect of tea⁃polyphenols on growth and toxin production by F.sulphureum [J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2018(12): 108⁃110.

[26] 赵冬梅,魏巍,张岱,等.马铃薯干腐病室内药剂筛选及防病研究[J].湖北农业科学, 2017, 56(17): 3268⁃3271, 3279.

[27] Zhao D M, Wei W, Zhang D, et al. Studies on screening for fungicides and disease prevention of potato dry rot in laboratory [J]. Hubei Agricultural Sciences, 2017, 56(17): 3268⁃3271, 3279..

[28] 索金玲,阿依丁,张金龙,等.高效液相色谱法测定向日葵花盘中绿原酸含量[J].广州化工, 2013, 41(14): 138⁃139, 154.

[29] Suo J L, A Y D, Zhang J L, et al. Determination of the contents of chlorogenic acid sunflower disc by HPLC[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2013,41(14): 138⁃139, 154.

[30] Picman. A. K, Schneider E. F, Gershenzon. J. Antifungal activities of sunflower terpenoids [J]. Biochemical Systematics and Ecology, 1990, 18(5): 325⁃328.

[31] 宋晚平,张鞍灵,高锦名,等.化感植物向日葵根提取液的抑菌活性研究[J].西北植物学报[J].2004, 24(10): 1949⁃1952.

[32] Song W P, Zang A L, Gao J M, et al. Study on antimicrobial assay of root extract of allelopathic Helianthus annuus [J]. Acta Botanica Boreali⁃Occidentalia Sinica, 2004, 24(10): 1949⁃1952.