红景天苷人工合成途径的研究进展

Research progress on artificial synthetic pathway of salidroside

摘要

红景天苷是红景天属（Rhodiola L.）植物的主要代谢物质，具有非常重要的药用价值。为保护野生植物资源，同时满足巨大的市场需求，探讨红景天苷的人工合成途径尤为重要。本文主要从红景天苷化学合成现状、红景天苷生物合成途径、代谢工程改造菌株合成红景天苷三方面对红景天苷的人工合成途径进行综述，以期为后续红景天苷合成相关研究提供理论参考。

Abstract

Salidroside is the main metabolite of Tibetan medicine plant Rhodiola， which has great medicinal value. In order to protect the wild plant resources and fulfill the great market demands， it is especially important to explore the synthetic pathway of salidroside. In this paper， the artificial synthetic pathways of salidroside are reviewed to provide theoretical reference for the follow⁃up studies on salidroside synthesis from the perspectives of the present situation of chemical synthesis， biosynthetic pathways of salidroside and synthesis of salidroside by metabolic engineering strains.

Graphical abstract

关键词

红景天苷 / 化学合成 / 代谢途径 / 生物合成

Key words

salidroside / chemical synthesis / metabolic pathway / biosynthesis

0 引 言

红景天苷（Salidroside）是红景天属（Rhodiola L.）植物的重要活性物质，广泛应用于食品医药领域。红景天苷主要来源于红景天属植物的根茎和块茎^［1］，随着红景天苷的植物提取技术^［2，3］和合成手段日臻成熟，研究者对红景天苷的药理作用进行了多项研究。药理研究表明，红景天苷具有抗缺氧^［4］、保护神经系统^［5］、消炎^［6］、抗肿瘤^［7，8］、血糖调节^［9］、改善心血管系统^［10］、提高免疫力^［11］的作用，在预防和治疗脑缺血损伤^［12］、脑卒中^［13］、阿尔兹海默症^［5］、糖尿病及其并发症^［14］、脂肪型肝炎^{［15，16］}、动静脉血栓^［17］、癌症^［18］等多项疾病中有巨大的潜力，临床应用前景广阔。

随着红景天苷药理作用的不断发现，其市场需求量与日俱增。红景天苷最先源于从红景天属植物中提取，人为过度采集、生境的破坏致使红景天野生植物资源日渐枯竭。2021年国务院发布的《国家重点保护野生植物名录》将十一种红景天属植物列为国家二级保护植物，大花红景天〔Rhodiola crenulata （Hook. f. et Thoms.） H. Ohba〕、蔷薇红景天（Rhodiola rosea L.）及其他多种常用藏药红景天均收录在内。一方面，红景天属野生植物资源濒危，且普遍存在红景天苷含量低、提取率低的问题。另一方面，红景天属植物生存环境非常特殊，如高海拔、高辐射、干旱、缺氧等，人工种植红景天成本高且难以达到标准^［19］。为了保护红景天属野生植物资源并且满足市场对红景天苷的巨大需求，科研工作者开始尝试人工合成红景天苷。人工合成红景天苷可通过化学合成和生物合成两种方式实现。化学合成红景天苷多需要严苛的反应条件和昂贵的催化剂，且易生成难以除去的副产物。随着红景天苷生物合成通路逐渐明晰，通过基因工程技术构造工程菌株合成红景天苷具有广阔的应用前景。

1 红景天苷的化学合成现状

1969年，苏联学者Troshchenko^［20］就报道了红景天苷的合成方法，溴代四乙酰基吡喃葡萄糖与酪醇在碱性条件下进行糖苷化反应生成中间产物四乙酰基红景天苷，四乙酰基红景天苷脱乙酰基得到红景天苷。以对羟苯乙醇作为原料，在无水氯化锡催化下进行糖苷化反应，再经脱保护机制得红景天苷^［21］。成本较低且反应路线较短，大大提高了红景天苷的产率。以上方法属于酪醇的直接糖苷化，酪醇中同时存在酚羟基和醇羟基，酚羟基也会随醇羟基一同发生糖苷化，生成的副产物难以除去。保护酚羟基使之不被糖苷化，可提高红景天苷的纯度。分别使用苄基、烯丙基保护酪醇的酚羟基，再与溴代四乙酰基吡喃葡萄糖缩合生成四乙酰基红景天苷，四乙酰基红景天苷脱乙酰基得到酚羟基保护的红景天苷，最后再脱去保护基团生成红景天苷^{［22，23］}。除苄基、烯丙基以外，酚羟基还可用乙酰基进行保护。以对羟苯乙酸为原料，经乙酰化保护、还原、苷化醇解三步反应合成红景天苷，减少了反应步骤，提高收率^［24］。

即使是使用酚羟基保护的酪醇与1⁃溴⁃四乙酰基吡喃葡萄糖反应合成红景天苷，合成过程也非常困难：使用碳酸银作催化剂时，需要过量才能达到较好的催化效果，成本高且不稳定；为避免银杂质残留，还需要进行柱层析除杂纯化产品；溴代四乙酰基吡喃葡萄糖制备过程复杂且费用高昂，储存时也需要低温干燥存放。这些问题使得整个合成过程受到限制，较难实现工业化生产。2016年，有学者以全乙酰基葡萄糖与4⁃苄氧基苯乙醇作为原料，以路易斯酸和卤化镁作为催化剂，合成红景天苷，总收率达63%，在一定程度上解决了原料不稳定且合成过程成本高的问题^［25］。以价廉易得的β⁃D⁃五乙酰葡萄糖为糖苷化供体，以无水ZnCl₂催化苯甲酰基保护的酚羟基酪醇进行糖苷化反应，再经脱保护得到红景天苷^［26］。路线涉及的中间体均可通过重结晶代替柱层析进行纯化，显著降低了生产成本，具备可放大性。

目前合成红景天苷的化学合成方法反应条件比较严苛，红景天苷的生物安全性较难保证。相比之下，生物合成具有成本低、效率高、选择性强且污染少的优势。随着基因工程、代谢工程的发展，构建高效的微生物细胞工厂生产红景天苷成为了研究热点。

2 红景天苷的生物合成现状

2.1 红景天苷的生物合成途径

通过基因工程改造微生物合成红景天苷的方法难点在于理清红景天苷的天然合成通路，以此为参考在微生物体内实现红景天苷合成通路的重构。酪醇是红景天苷的苷元分子，在关键酶尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（uridine diphosphate glucosyltransferase， UGT）的催化作用下，尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose， UDPG）作为糖基化供体，酪醇发生糖苷化生成红景天苷^{［27，28］}。酪醇的代谢途径尚未明确，作为芳香类氨基酸衍生物，被认为与植物的莽草酸代谢途径相关^［29］。磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate， PEP）和赤藓糖⁃4⁃磷酸（erythrose 4⁃phosphate， E⁃4⁃P）经莽草酸代谢途径生成莽草酸，再经酶促反应生成阿罗酸，阿罗酸进而转化为酪氨酸、苯丙氨酸或其他芳香类物质。最初有研究者认为酪醇的前体是苯丙氨酸和酪氨酸^［30］，李伟等^［31］测定了狭叶红景天〔Rhodiola kirilowii （Regel） Maxim.〕愈伤组织中红景天苷的含量与苯丙氨酸解氨酶（L⁃phenylalanine ammonia⁃lyase， PAL）、肉桂酸⁃4⁃羟化酶（cinnamate 4⁃hydroxylase， C4H）、酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonialyase， TAL）的活性，发现红景天苷含量与三种代谢酶活力之间都有显著性差异，且这种显著性差异呈不规则变化。研究者推测，在不同温度培养条件下，红景天苷合成有时以酪氨酸代谢为主，有时以苯丙氨酸代谢为主。为了进一步探究红景天苷的来源，在高山红景天中分别过表达苯丙氨酸解氨酶^［32］和酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase， TyrDc）^［33］后测定红景天苷和酪醇的含量，发现二者的含量与TyrDc的表达量呈正相关关系，与PAL的表达量呈负相关关系。这一实验结果支持酪醇来自酪氨酸代谢途径这一推测，在蔷薇红景天中得到了同样的结论^［34］。目前，研究者多认为红景天苷和酪醇的前体物质为酪氨酸，并推测酪氨酸可经由三条途径生成酪醇，如图1所示。酪氨酸经由酪氨酸脱羧酶的催化生成酪胺，单氨氧化酶催化酪胺生成对羟苯乙醛（4⁃hydroxyphenylacetaldehyde，4⁃HPAA），后者又在醇脱氢酶的催化下还原生成酪醇；酪氨酸在酪氨酸转氨酶的催化下生成对羟苯丙酮酸（4⁃hydroxyphenylpyruvate， 4⁃HPP），对羟苯丙酮酸脱羧生成对羟苯乙醛，对羟苯乙醛还原生成酪醇^［35］；酪氨酸可直接经由对羟苯乙醛合酶（4⁃hydroxyphenylacetaldehyde synthase，4HPAAS）的催化生成对羟苯乙醛，继而经过还原反应生成酪醇^［36］。

尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶作为整个过程的限速酶，一直备受科研工作者关注。2007年，首次从高山红景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor.）中克隆并鉴定得到参与红景天苷生物合成的UGT，将其命名为UGT73B6^［37］。这使微生物合成红景天苷成为可能。运用体外酶活实验和红景天转基因毛状根系统两种方式证明来自高山红景天的UGT74R1和UGT72B14也具有将酪醇转化为红景天苷的能力^［38］。筛选12个来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的UGT，异源表达到高产酪醇的大肠杆菌（Escherichia coli）中，分别表达AtUGT73C5，AtUGT73C6和AtUGT85A1的大肠杆菌生成了红景天苷，其中表达AtUGT85A1的大肠杆菌发酵液中红景天苷含量最高^［39］。2018年，在烟草（Nicotiana tabacum L.）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）两种表达系统里异源表达来自蔷薇红景天的UGT和4HPAAS重新构建了红景天苷的代谢途径，研究结果发现异源表达了RrUGT29，RrUGT32和RrUGT33的酿酒酵母和烟草成功合成了红景天苷^［36］。目前微生物生产红景天苷中使用的UGT主要包括以上三个物种来源。

除了尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶外，工程菌改造的过程中应用非常广泛的一个酶是芳香乙醛合酶（aromatic aldehyde synthase，AAS）。在2002年，研究者为促进马铃薯中酪胺的积累转入了来自欧芹〔Petroselinum crispum （Mill.） Hill〕的PcTyrDc⁃2，结果并没有提高酪胺的含量，反而生成了新的代谢物质——红景天苷。研究者猜测马铃薯中红景天苷的合成途径应从酪胺起始，经催化生成对羟苯乙醛，再经还原和糖苷化生成红景天苷，但对此并未给出证据^［40］。后来有研究发现PcTyrDC⁃2表现出芳香乙醛合酶的催化特性，可将酪氨酸直接催化生成对羟苯乙醛，并将其正式归于芳香乙醛合酶^［41］。因其直接以酪氨酸为底物合成对羟苯乙醛，反应简单、高效，来自欧芹的芳香乙醛合酶被广泛应用于高产红景天苷工程菌株的改造。

2.2 大肠杆菌作为底盘生物合成红景天苷

大肠杆菌繁殖周期短、操作简单，且遗传背景清晰，因此近些年有较多研究者选择大肠杆菌作为底盘生物进行适当改造用以生产红景天苷。

目前在大肠杆菌中可以通过引入来自酿酒酵母的Aro10p，来催化对羟苯丙酮酸生成对羟苯乙醛，对羟苯乙醛进而在大肠杆菌内源还原酶的作用下生成酪醇，酪醇经糖苷化生成红景天苷。为了提高红景天苷的产量，首先要构建高产酪醇的工程菌，工程菌的改造主要围绕减弱酪氨酸的负反馈抑制、改变代谢通路流量和增加通路蛋白表达量三方面展开。引入酪氨酸反馈抑制不敏感突变体基因aroG^D146N 和tyrA^M53I/A354V 可减弱酪氨酸的反馈抑制^［42］；敲除酪氨酸代谢途径中的tyrB、tyrE^［43］、苯丙氨酸代谢途径中的peaB、pheA、pabB可减弱竞争代谢途径以增加酪醇的代谢通量^{［44，45］}；TyrR是芳香族氨基酸合成过程中的转录抑制因子，敲除tyrR可有效增加通路蛋白的表达量，也可通过过表达莽草酸代谢途径中的基因提高蛋白的表达量^［46］。在完成酪醇高产突变株的构建后，再引入外源UGT即可实现大肠杆菌内红景天苷合成途径的重构。本文在现有研究的基础上对大肠杆菌中红景天苷的合成途径进行了重新梳理，如图2所示。

在使用大肠杆菌表达UGT蛋白时，进行密码子优化是非常重要的。在高产酪醇的大肠杆菌中异源表达了经过密码子优化的UGT72B14，经过优化后的酶活性不受影响，且表达量更高，纯度更好，红景天苷的产量可达6.7 mg/L^［47］。研究者在大肠杆菌中敲除了pheA、feaB、tyrR等基因，异源表达来自酿酒酵母的Aro10p，以提高酪醇的产量^［42］。在此基础上引入来自高山红景天的糖基转移酶UGT73B6，红景天苷产量高达56.9 mg/L。这是首次在大肠杆菌中实现红景天苷的从头合成。但是UGT73B6的立体选择性较差，在合成红景天苷的同时，也会生成淫羊藿次苷D2（Icariside D2），酪醇转化效率低。为了进一步提高UGT的选择性与催化效率，对来自拟南芥的12个UGT进行筛选，将12个UGT分别转入大肠杆菌中，并且在培养基中加入酪醇，以大肠杆菌中红景天苷的含量表征UGT的催化效率，其中AtUGT85A1的催化效率最高^［39］。作者将来自欧芹的PcAAS和来自拟南芥的AtUGT85A1转入大肠杆菌中，将红景天苷的产量提高至288 mg/L。AtUGT85A1催化效率高且具有立体选择性，不会发生酚羟基糖苷化生成淫羊藿次苷D2，成为后续生物合成红景天苷的常用UGT。通过改造内源蛋白、表达来自酿酒酵母的ARO10p和来自拟南芥的AtUGT85A1，获得了一株红景天苷的高产菌株，红景天苷产量达9.3 g/L^［43］。以上均为使用单一工程菌株生产红景天苷。随着微生物共培养技术的发展，研究者开始尝试使用微生物共培养技术生产红景天苷。将红景天苷的生物合成途径分配在两个菌株中，苯丙氨酸缺乏的苷元菌株以木糖为碳源合成酪醇，酪氨酸缺乏的糖基化菌株以葡萄糖为碳源以酪醇为底物生成红景天苷^［48］。二者互利共生，在以葡萄糖和木糖为碳源时红景天苷产量达6.03 g/L。为了实现对微生物共培养期培养环境的监测与调控，研究者引入了群体感应技术，利用数学建模的方法分析了多个群体感应系统，不断优化微生物共培养和代谢调控方案，在工业上具有较大的应用前景^［49］。

2.3 酿酒酵母作为底盘生物合成红景天苷

酿酒酵母也是一种常用的工程菌，因其无内毒素，在食品和医药领域有着悠久的应用历史，被FDA认定为安全菌株。不同于大肠杆菌，酿酒酵母体内本身就存在可将酪氨酸转化为酪醇的Ehrlich途径。虽然酿酒酵母本身可以生产酪醇，但是产量很低，在改造酿酒酵母高效合成红景天苷之前，首先要提高酪醇的产量。PEP和E⁃4⁃P是酪醇合成的底物，野生酿酒酵母中生成的PEP主要流向丙酮酸代谢途径，仅有少部分流向莽草酸代谢途径，将丙酮酸代谢途径中的pdc1敲除，有利于提高酪醇的产量。另一方面，分支酸是芳香酸和酚类化合物生物合成途径中的主要分支点中间代谢物，被分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶连续转化为对羟苯乙醛^［50］。其中，Aro3p、Aro4p、Aro7p的活性受酪氨酸的反馈抑制，这是酿酒酵母作为底盘生物合成芳香类物质的瓶颈^［51］。引入内源的酪氨酸反馈抑制不敏感突变体^［52］Aro3p^K222L、Aro4p^K229L、Aro7p^G141S或来自大肠杆菌的酪氨酸反馈抑制突变体^［53］EcTyrA^M53I/A354V可以减弱酪氨酸对整个代谢过程的抑制作用。另外，还可以通过异源表达来自欧芹的PcAAS催化酪氨酸直接生成对羟苯乙醛来增加酪醇的代谢通量。在酪醇高产突变株中引入UGT即可实现酿酒酵母内红景天苷合成通路的重构。本文在现有研究的基础上对酿酒酵母中红景天苷的合成途径进行了重新梳理，如图3所示。

利用野生型酿酒酵母将aro4^K229L、aro7^G141S、aroL、Pcaas、Atugt85a1分两步整合到酵母染色体上，建立一个可稳定遗传的菌株。这是首次构建的无质粒红景天苷合成菌株，采用补料分批发酵的方式，酪醇和红景天苷的产量分别达到1 394.6 mg/L和732.5 mg/L^［54］。研究者在实验室现有工程菌株的基础上，分别在三个不同位点异源表达了来自青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）的密码子优化的Baxfpk以增强赤藓糖4⁃磷酸的产量，敲除pdc1以阻断竞争途径，引入aro4^K229L、aro7^G141S 消除酪氨酸的负反馈抑制，异源表达来自大肠杆菌的EctyrA^M53I/A354V 、来自欧芹的Pcaas以提高酪醇的产量，获得酪醇高产菌株^［55］。在此基础上表达Atugt85a1后，通过葡萄糖补料分批发酵的方式红景天苷产量达1.82 g/L。国内研究者对酿酒酵母进行了全面的改造，改造后的菌株分别获得9.90 g/L的酪醇和26.55 g/L的红景天苷，是二者迄今为止报道的最高产量^［56］。整体的改造主要通过三部分进行，首先将aro3^K222L 和aro7^G141S 整合到基因组上，使酪醇的产生从反馈抑制中解除出来；随后，过表达rki1和tkl1，以调节前体物质E⁃4⁃P、PEP的通量，并通过敲除pha2和pdc1来阻断竞争途径；最后引入密码子优化后的蔷薇红景天糖基转移酶RrUGT33，完成酪醇的糖苷化过程。相较其他的改造方法，他们对代谢途径的改造更加全面，且采用了新的UGT。随着代谢途径的改造日趋完善，寻找新的可高效催化酪醇转化为红景天苷的酶或将是提高红景天苷产量的突破口。

2.4 红景天属植物内生菌合成红景天苷

目前主要以大肠杆菌和酿酒酵母作为生产红景天苷的工程菌株，除此之外，有研究学者发现红景天属植物的一些内生菌也具有合成酪醇和红景天苷的能力。在高山红景天的根部筛选得到一株可以代谢生成红景天苷的内生真菌，经鉴定属于曲霉（Aspergillus）^［57］；在大花红景天根部筛选得到一株可以生产酪醇的水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis），在最佳发酵条件下，产量达15.68 mg/L^［58］；在高山红景天的内生菌中分离得到一株内生菌福廷瓶头霉菌（Phialocephala fortinii），经过发酵条件优化，红景天苷和酪醇的产量分别为2.339 mg/mL和2.002 mg/mL^［59］。目前利用红景天属植物内生菌生产红景天苷的研究较少，且研究者大多把目光聚焦在可天然合成酪醇和红景天苷的菌株筛选这一方面，缺少对其合成机制的解析，探索这些植物内生菌中天然的红景天苷合成途径有助于发现新的代谢通路或者催化效果更好的酶，进而用于红景天苷工程菌的改造。

3 展 望

人工合成红景天苷主要通过化学合成和生物合成两种途径。化学合成法过程复杂、产率低且安全性得不到保障。因此，生物合成法生产红景天苷是未来发展的趋势，在工业化生产中有着广阔的应用前景。为提高生物合成红景天苷的产量，仍需解决以下问题。

红景天苷的天然合成途径需要更深入地挖掘。红景天属植物作为红景天苷最主要的天然来源，基因组学、转录组学和代谢组学资源均非常匮乏，有关红景天苷生物合成的通路及其关键基因的研究，依然缺乏清晰的遗传背景，植物体内真实的红景天苷天然代谢途径和调控机制依然悬而未决，这极大地限制了红景天苷的可持续利用。

酪醇的转化效率较低是红景天苷产量的一大限制因素。目前鉴定得到的可以高效催化酪醇转化为红景天苷的UGT寥寥，发现更多催化效率高、立体选择性好的UGT可从生物信息学的角度入手，通过整合现有的序列和结构资源，分析序列特征、底物结合位点和催化活性结构域，在所有生物的基因数据库中高效率地实现酶的鉴定、筛选及改造。

当下虽然已经实现了利用大肠杆菌和酿酒酵母为底盘生物合成红景天苷，但是生产工艺还停留在实验室水平，提高苷元分子酪醇的代谢通量是提高红景天苷产量行之有效的手段。提高工程菌株中苷元分子酪醇的代谢通量，可通过解除反馈抑制、过表达关键酶、抑制竞争途径等方法对底盘生物进行更加完善的改造实现。酿酒酵母存在酪醇的天然合成途径，相比大肠杆菌，使用酿酒酵母作为底盘生物构造酪醇高产突变株具有更大的潜力。相信随着红景天苷天然合成通路不断被解析，对于底盘生物的改造也会更有选择性，更为高效。

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基金资助

中央引导地方重点项目(XZ202001YD0028C)