基于高通量培养组学的人体皮肤细菌多样性研究

Bacterial diversity of human skin based on high⁃throughput culturomics

摘要

了解中国健康人皮肤可培养细菌多样性及建立中国健康人皮肤细菌菌株资源库，能够为皮肤细菌研究及研究皮肤细菌与皮肤疾病之间的潜在关系提供菌株资源。通过高通量培养组学技术，利用9种培养基对18名健康中国人，8个部位，144份皮肤样品进行高通量分离培养，并对筛选获得的细菌进行16S rRNA测序鉴定分析。研究表明，共分离获得3 580株细菌，隶属于4门33属108种；4个门包括厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其中优势门为厚壁菌门（占总菌株数的87.01%），其次为放线菌门（10.61%）；优势属为葡萄球菌属（Staphylococcus）（占总菌株数的82.07%）；优势种为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）（占总菌株数的35.81%），其次为人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种（Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus）（26.37%）及头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）（9.44%）；并获得39株26种潜在的新菌种，其与最接近的16S rRNA序列相似率分布为88.26%~98.61%，潜在新属新种占总菌株的1.09%，占所有菌种的24.07%。健康中国人群皮肤细菌资源丰富，且存在大量的潜在新属新种有待分离培养鉴定；我们初步建立了健康中国人皮肤细菌资源库，以丰富现有皮肤细菌资源，为利用皮肤细菌资源提供菌株保障。

Abstract

This study is to explore the diversity of culturable bacteria in the skin of Chinese healthy people and establish a resource bank of Chinese healthy human skin bacterial strains，so as to provide strain resources for the study of skin bacteria and the protential relationship between skin bacteria and skin diseases. We collected 144 skin samples from 8 different skin sites of 18 healthy Chinese， and performed high⁃throughput isolation and culturation of bacteria from these samples using 9 different culture media. The isolated bacteria were identified according to their 16S rRNA sequences. A total of 3580 bacterial strains were isolated in this study. These isolates are assigned to 108 species of 33 genera and 4 phyla. Among the four phyla （Firmicutes， Actinobacteria， Proteobacteria and Bacteroidetes）， Firmicutes （87.01%） is the dominant phylum， followed by Actinobacteria （10.61%）. The dominant genus is Staphylococcus （82.07%）. Staphylococcus epidermidis （35.81%） is the dominant species， followed by Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus （26.37%） and Staphylococcus capitis （9.44%）. Meanwhile， 26 potential novel species were identified for 39 bacterial strains， among which the similarities of 16S rRNA sequences to the most closest sequences deposited in the public database were 88.26%~98.61%. The potential novel genera and species accounted for 1.09% of all strains， and 24.07% of all species. Chinese healthy people are rich in skin bacterial resources， and there are a large number of potential new genera and species to be isolated and identified. We have initially established a healthy human skin bacterial resource bank to enrich the existing skin bacterial resources and provide strain guarantee for the use of skin bacterial resources.

Graphical abstract

关键词

培养组学 / 人体皮肤细菌 / 可培养细菌 / 16S rRNA鉴定

Key words

culturomics / human skin bacterium / culturable bacterium / 16S rRNA identification

0 引 言

皮肤位于人体的表面，是人体与外界环境直接接触部分与最大接触表面，也是人体面积最大的器官，约为1.5×2.0 ㎡^［1］，具有保护、感觉、体温调节、分泌、排泄、吸收、代谢和免疫等作用，能够防止体内水分逃逸、阻止人体被感染性或有毒物质入侵，与人体的健康状况有着密切关系，是身体和免疫防御的第一道防线^［2~6］。皮肤也是微生物的栖息之地，其中存在大量的微生物^［7，8］，一般分为两种，一种为定植于皮肤的人体共生微生物，长久与人体皮肤共存；一种为转瞬即逝的微生物，来源于环境，不会长久定植于人体皮肤，一般在皮肤上的停留时间为几小时到几天^［9］。人类在分娩及随后暴露在出生后的环境中，皮肤会随之定植大量好氧及厌氧微生物，包括细菌、真菌、古菌、病毒和螨虫等，其中有些是共生的有些是共栖的^{［8，10~12］}。这些微生物大部分有益于皮肤，可以抑制病原微生物的入侵，对皮肤蛋白、游离脂肪酸和皮脂进行进一步加工^{［2，3，13］}，并在调节人类健康和环境适应性方面具有关键的功能^［14~16］。研究表明，定植于皮肤的健康微生物菌群不仅保护宿主免受机会性和致病性微生物的定植和感染，而且还可调节各种皮肤疾病的发病机制^［17~19］，微生物组的变化也可使宿主易受感染并影响疾病状态^{［20，21］}。例如，皮肤上的丙酸杆菌属（Propionibacterium）微生物诱导人皮脂细胞中抗菌肽的表达，而抗菌肽具有抗病原体的杀菌活性^［22］，丙酸杆菌属也具有将皮脂中的甘油三酯代谢为短链脂肪酸的能力，短链脂肪酸表现出抗菌特性，并有助于维持酸性皮肤pH值，从而阻止包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在内的致病性皮肤微生物的定植，因此被认为在维持皮肤健康方面发挥着有益的作用^{［23，24］}；皮肤上的痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）会使皮肤抵抗金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）等病原菌^19，25］；有研究发现皮肤正常共生的表皮葡萄球菌具有激活TLR2信号并诱导抗菌肽表达的潜在作用，从而使皮肤对病原体的反应增强^［26］；金黄色葡萄球菌导致的皮肤发炎极为普遍，并与皮炎的临床严重程度直接相关^［27］，金黄色葡萄球菌也与儿童特应性湿疹有关^［28］；在系统性红斑狼疮患者皮肤中金黄色葡萄球菌感染通路明显富集，皮肤微生物群的组成和丰度的变化与系统性红斑狼疮患者的发病机制有关，葡萄球菌属可作为潜在的系统性红斑狼疮患者的生物标志物或治疗靶点^［29］；牛皮癣，即寻常型银屑病的发生可能与厚壁菌门（Firmicutes）与放线菌在皮肤中的比例增加有关^{［30，31］}；拟杆菌门（Bacteroidea）与厚壁菌门在皮肤中的比例降低可能导致肥胖^［32］；皮肤共生微生物也可通过TLR2激活中性粒细胞产生CXC趋化因子配体10，CXC趋化因子配体10可起到抗菌肽的作用以杀伤细菌，并能够引起浆细胞样树突细胞至损伤皮肤处，同时CXC趋化因子配体10与皮肤微生物DNA形成复合物，激活浆细胞样树突细胞以产生I型干扰素，I型干扰素可激活成纤维细胞及巨噬细胞以产生组织生长因子，从而促进对损伤皮肤的修复^［33］。近年来研究表明，皮肤微生物也可用来预测人的年龄，且其预测结果相比较口腔、肠道微生物更准确^［34］。

为进一步了解皮肤共生微生物及其在皮肤疾病发病机制中的作用，并最终促进及开发新的皮肤疾病治疗方法，人类必须全面系统地了解人体皮肤微生物。随着测序技术的发展，宏基因组测序分析技术已广泛应用在人体皮肤细菌多样性研究。2012年美国人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）通过宏基因组技术对242个健康人体的4种皮肤微生物的结构、功能和多样性进行分析，发现皮肤细菌菌种分布与肠道、口腔及生殖道细菌存在显著差异^［35］；已有研究学者通过宏基因组测序分析技术对22个参与者的肚脐皮肤细菌进行分析，分布于17个细菌门302个细菌属^［9］；中国香港城市大学的研究人员用宏基因组对中国香港40个人5个部位的200个样品进行皮肤多样性的分析，其测序数据聚类为62 606个OTU，通过数据库比对分布于52个门137个纲750个属^［36］；也有研究学者采用宏基因组测序技术分析了822个健康汉族人群面部皮肤菌群多样性，并结合之前已发表的538个北美人类皮肤宏基因组菌群数据，构建了人类皮肤微生物基因目录（Human Skin Microbial Gene Catalog， iHSMGC），包含10 930 638个基因，相较HMP新增4 879 024个基因，此研究还基于皮肤菌群鉴定出了2种广泛存在的皮肤亚型，分别以奥斯陆莫拉氏菌（Moraxella osloensis）和痤疮丙酸杆菌为指示菌^［37］。有研究学者通过传统培养方法对5名健康志愿者的前额皮肤细菌进行分离，获得了5种细菌种^［38］；也有研究学者通过培养方法对10名印度学生皮肤手掌区域的微生物进行分离培养获得27株细菌，隶属于7属10种^［39］。因此，通过宏基因组与传统的筛选培养技术分析可知，皮肤中存在大量尚未被培养获得的细菌菌种资源。随着培养组学在肠道微生物筛选分离中的应用表明，利用培养组学可以培养出之前尚未在实验室中培养获得的细菌菌种^［40］。但目前尚未有基于培养组学对中国人皮肤细菌多样性的研究，本研究旨在通过高通量培养组学技术，筛选分离中国健康人体皮肤共生细菌，了解中国健康人皮肤可培养细菌多样性，初步建立中国健康人皮肤共生的可培养细菌菌株资源库，丰富现有的可培养菌种，并为后续的皮肤细菌与人体相关疾病研究提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

自2017年9月至2018年8月，共招募18个志愿者，采集18人144份人体皮肤微生物样品，其样品来源男女比例为1∶1，年龄段为18~55岁，对样品捐赠者进行问卷调查及签订知情同意书。

1.1.2 样品采集

①样品采集人员穿戴一次性无菌手套及医用口罩；②无菌棉拭子浸泡于微生物样本保护液中，30 s后取出，挤出多余溶液；③采集部位：耳背/外耳道（SE）、脸颊（SD）、鼻周（SN）、手掌心（SH）、腋窝（SY）、手肘窝（SZ）、大腿（SL）和脚部（SF），按照每个皮肤部位，不重叠自内向外轻轻擦拭，擦拭范围为4 cm²；④立即将擦拭后棉拭子置于含1.0 mL微生物保护液的2.0 mL无菌采样管中，棉拭子头全部浸入微生物保护液中，以螺旋盖密封；⑤样品采集完后，立即送至微生物实验室进行样品处理，进行菌株筛选。

1.1.3 主要试剂

Takapa TapTM试剂盒及6X Loading Buffer购于TakaRa；引物合成于北京六合华大基因科技有限公司；刃天青购于SIGMA；琼脂糖购于LOWEST；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要设备

厌氧培养箱（美国Shellab）；恒温摇床（上海堪鑫）；恒温培养箱（BINDER）；超净工作台（苏净安泰）；PCR仪、凝胶成像系统（Bio⁃RAD）；离心机（湘仪）；电泳设备（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.5 培养基

采用9种培养基对皮肤细菌进行筛选分离培养，厌氧培养基均加入刃天青0.001 g/L，固体培养基加琼脂15.0 g/L，每种培养基均进行添加5.0%脱纤维羊血及不添加5.0%脱纤维羊血两种配方，脱纤维羊血需在培养基灭菌后温度降至65 ℃后添加。维生素溶液使用ATCC Vitamin Supplement MD⁃VS（https：//www.atcc.org/products/md-vs），微量元素溶液使用ATCC Trace Mineral Supplement MD⁃TMS（https：//www.atcc.org/products/md-tms）。

BHI培养基（g/L），简称B：胰蛋白质胨 10.0 g，氯化钠 5.0 g，磷酸氢二钠 2.5 g，葡萄糖 2.0 g，牛心浸出粉17.5 g，调节pH至7.4，蒸馏水定容至1000.0 mL，121 ℃，高压灭菌15 min。

哥伦比亚培养基（g/L），简称G：胰蛋白质胨 10.0 g，肉胃蛋白酶消化物5.0 g，心胰酶消化物3.0 g，酵母浸出粉5.0 g，玉米淀粉1.0 g，氯化钠5.0 g，调节pH至7.3，蒸馏水定容至1000.0 mL，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

AF培养基（g/L），简称H：胰蛋白胨5.0 g，蛋白胨3.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，多聚蛋白1.0 g，干酪素1.5 g，酵母粉5.0 g，牛肉浸膏2.5 g，纤维二糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，吐温80 0.5 mL，细菌学蛋白胨1.0 g，L⁃半胱氨酸盐酸盐一水物0.5 g，九水硫化钠0.25 g，氨基酸溶液5.0 mL，短链脂肪酸50.0 μL，糖溶液5.0 mL，钠盐溶液1.0 mL，2.0 mol/L HEPES 1.0 mL，盐溶液40.0 mL，微量元素10.0 mL，维生素10.0 mL，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

I培养基（g/L），简称I：胰蛋白胨5.0 g，蛋白胨3.0 g，大豆蛋白胨1.0 g，多聚蛋白1.0 g，干酪素1.0 g，酵母粉10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，吐温80 0.5 mL，麦芽糖0.5 g，纤维二糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，甘油0.5 mL，L⁃半胱氨酸盐酸盐一水物0.5 g，九水硫化钠0.25 g，盐溶液40.0 mL，微量元素10.0 mL，维生素10.0 mL，血红素溶液10.0 mL，维生素K1溶液0.2 mL，乙酸钠5.0 g，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，0.67×10⁵ Pa灭菌30 min。其中血红素溶液配制为将0.05 g血红素溶于1.0 mL 1.0 mol/L KOH中；用蒸馏水定容至100.0 mL；维生素K1溶液配制为将0.000 1 g维生素K1溶于20.0 mL 95%乙醇中，过滤除菌，储存于棕色的瓶中。

1/10AF培养基（g/L），简称J：各种试剂含量为AF培养基的1/10，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

MRS培养基（g/L），简称M：蛋白胨10.0 g，牛肉膏粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL， 磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，MnSO₄·4H₂O 0.05 g，调节pH至6.2，蒸馏水定容至1 000 mL，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

孢子培养基（g/L），简称P：酵母膏1.0 g，牛肉膏1.0 g，胰蛋白胨2.0 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖10.0 g，FeSO₄ 0.001 g，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，0.67×10⁵ Pa灭菌30 min。

SCA培养基（g/L），简称S：胰酪蛋白胨8.2 g，蛋白胨2.5 g，大豆蛋白胨1.0 g，葡萄糖5.8 g，酵母浸粉5.0 g，氯化钠1.7 g，磷酸氢二钠0.8 g，L⁃胱氨酸0.4 g，氯化血红素0.01 g，三羟甲基氨基甲烷15.0 g，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，0.67×10⁵ Pa灭菌30 min。

GMM培养基（g/L），简称U：胰蛋白胨2.0 g，酵母粉1.0 g，葡萄糖0.4 g，L⁃半胱氨酸0.5 g，纤维二糖1.0 g，麦芽糖1.0 g，果糖1.0 g，牛肉浸膏5.0 g，磷酸二氢钾1.36 g，MgSO₄·7H₂0 0.002 g，NaHCO₃ 0.4 g，NaCl 0.08 g，CaCl₂ 0.008 g，维生素K 0.001 g，FeSO₄ 0.004 g，血红素溶液1.0 mL，吐温80 2.0 mL，维生素溶液10.0 mL，微量元素10.0 mL，乙酸1.7 mL，异戊酸0.1 mL，丙酸2.0 mL，丁酸2.0 mL，刃天青0.001 g，调节pH至7.2，蒸馏水定容至1 000 mL，0.67×10⁵ Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

使用涡旋振荡器将皮肤样品振荡混匀，吸取100.0 μL皮肤微生物样品至2.0 mL无菌离心管中，加900.0 μL pH 7.2 的PBS溶液制成稀释10倍的样品稀释液，吹打混匀后进行梯度稀释10^-2~10^-5；各吸取100.0 μL 10^-2和10^-3稀释液在18种固体培养基上进行平板涂布，分别置于厌氧培养箱厌氧环境和恒温培养箱有氧环境中，37 ℃倒置培养48 h，进行菌株挑取，菌株纯化为单菌落后进行菌液扩培，37 ℃培养24 h后进行超低温甘油保藏。

1.2.2 细菌16S rDNA序列分析

采用95 ℃ 10 min对细菌菌体进行裂解，初步提取菌株DNA。使用细菌通用引物341F（5′⁃CCTACGGGAGGCAGCAG⁃3′）和926R（5′⁃CCGTCAATTCCTTTRAGTTT⁃3′）对皮肤细菌16S rRNA的V3⁃V5区序列进行扩增。PCR反应体系（25.0 μL）：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，341F 0.5 μL，926R 0.5 μL，模板1.0 μL，Taq酶0.3 μL，ddH₂O 18.2 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，10个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25个循环；72℃ 10 min。每个PCR产物取3.0 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测后若条带单一明亮，剩余PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

测序获得的16S rRNA 基因序列，使用SeqScanner软件，查看测序峰图质量，如波峰正常，则将序列在NCBI的16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）数据库进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2.1 皮肤可培养细菌多样性

18份健康中国人皮肤样品，共分离获得3 580株细菌，对所有细菌进行16S rRNA基因测序分析，其相似度分布在88.26%~100.00%。所有菌株隶属于4门33属108种。4个门为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门；其中优势门为厚壁菌门，占总菌株的87.01%，其次为放线菌门占总菌株的10.61%。33个属为食酸菌属（Acidovorax）、不动杆菌属（Acinetobacter）、厌氧球菌属（Anaerococcus）、蛛网菌属（Arachnia）、芽胞杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、丙酸杆菌属（Cutibacterium）、皮杆菌属（Dermabacter）、皮球菌属（Dermacoccus）、肠球菌属（Enterococcus）、另位球菌属（Eremococcus）、芬戈尔德菌属（Finegoldia）、孪生球菌属（Gemella）、颗粒链菌属（Granulicatella）、创伤球菌属（Helcococcus）、惰球菌属（Ignavigranum）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、克吕沃尔氏菌属（Kluyvera）、考克氏菌属（Kocuria）、乳球菌属（Lactococcus）、巨大球菌属（Macrococcus）、哺乳动物乳球菌属（Mammaliicoccus）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、莫拉菌属（Moraxella）、奈瑟菌属（Neisseria）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、罗斯氏菌属（Rothia）、葡萄球菌和链球菌属（Streptococcus）；优势属为葡萄球菌属（占总菌株数的82.07%）；共有5个属只有1株细菌：短杆菌属、创伤球菌属、克吕沃尔氏菌属、奈瑟菌属和嗜胨菌属，所占菌株比为0.14%，细菌属占比为15.15%（图1）。108个细菌种，其优势种为表皮葡萄球菌（占总菌株数的35.81%），其次为人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种（26.37%）及头状葡萄球菌（9.44%）；共有34个种只有1株细菌：桂林不动杆菌（Acinetobacter guillouiae）、洛菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、阿氏芽胞杆菌（Bacillus aryabhattai）、环状芽胞杆菌亚种（Bacillus circulans subsp. circulans）、地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides）、芽胞杆菌属细菌（Bacillus rubiinfantis）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）、黄腐短杆菌（Brevibacterium luteolum）、啤酒神金黄杆菌（Chryseobacterium gambrini）、乳酸金黄杆菌（Chryseobacterium lactis）、拥挤棒杆菌（Corynebacterium accolens）、奇异棒状杆菌（Corynebacterium singulare）、棒状杆菌属细菌（Corynebacterium timonense）、快速解脲棒杆菌（Corynebacterium ureicelerivorans）、晋州皮杆菌（Dermabacter jinjuensis）、酪黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus）、孔氏创伤球菌（Helcococcus kunzii）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、栖冷克吕沃尔菌（Kluyvera cryocrescens）、海考克氏菌（Kocuria marina）、乳酸乳球菌叶蝉亚种（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、北见微杆菌（Microbacterium kitamiense）、莱拉微球菌（Micrococcus lylae）、亚特兰大莫拉菌（Moraxella atlantae）、猴奈瑟菌（Neisseria macacae）、拉西多嗜胨菌（Peptoniphilus lacydonensis）、人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae），所占菌株比为0.95%，细菌属占比为31.48%。

2.2 皮肤不同部位可培养细菌多样性

对筛选鉴定的3 580株细菌的皮肤部位进行分析：每个皮肤部位筛选获得的细菌门、属、菌种及菌株数量见表1；门水平中，放线菌门和厚壁菌门均在皮肤的每个部位筛选获得菌株，拟杆菌门只在SE筛选获得，变形菌门在SL未获得。厚壁菌门在SE、SD、SN、SH、SY、SZ和SF中均为优势门，SL中放线菌门为优势门；属水平中（图2），微球菌属和葡萄球菌属均在皮肤的每个部位筛选获得菌株，金黄杆菌属、孪生球菌属和奈瑟菌属只在SE中筛选获得，克雷伯氏菌属和克吕沃尔氏菌属只在SN中筛选获得，厌氧球菌属、蛛网菌属、芬戈尔德菌属和嗜胨菌属只在SY中筛选获得，短杆菌属、另位球菌属、创伤球菌属、惰球菌属、巨大球菌属和哺乳动物乳球菌属只在SF中筛选获得，SD、SH、SZ和SL无特有属，SD、SN、SH、SY、SZ和SF的优势属均为葡萄球菌属，SE的优势属为链球菌属，SL的优势属为微杆菌属（Microbacterium）；种水平中，仅表皮葡萄球菌在所有的部位筛选获得，仅在SE筛选获得的种有抗辐射不动杆菌、枯草芽胞杆菌、啤酒神金黄杆菌（Chryseobacterium gambrini）、乳酸金黄杆菌（Chryseobacterium lacti）、猴奈瑟菌、台湾孪生球菌（Gemella taiwanensis）、龋罗斯氏菌（Rothia dentocariosa）、轻型链球菌（Streptococcus mitis）、血孪生球菌（Gemella sanguinis）和产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes），仅在SD筛选获得的种有桂林不动杆菌、摩加夫芽胞杆菌、拥挤棒杆菌、乳酸乳球菌叶蝉亚种和巴氏葡萄球菌，仅在SN筛选获得的种有环状芽胞杆菌番红亚种、肺炎克雷伯氏菌、栖冷克吕沃尔菌、莱拉微球菌和产气克雷伯氏菌，仅在SH筛选获得的种有蕈状芽胞杆菌、人葡萄球菌、抗药性棒杆菌（Corynebacterium resistens）和沼泽考克氏菌（Kocuria palustris），仅在SY筛选获得的种有蜡样芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、亚特兰大莫拉菌、拉西多嗜胨菌（Peptoniphilus lacydonensis）、无枝菌酸棒杆菌（Corynebacterium amycolatum）、丙酸假丙酸杆菌（Pseudopropionibacterium propionicum）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、颗粒丙酸杆菌（Cutibacterium granulosum）、福尔摩沙乳球菌（Lactococcus formosensis）、大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）、阴道皮杆菌（Dermabacter vaginalis）、厌氧球菌属细菌（Anaerococcus nagyae）、砷酸考克氏菌（Kocuria arsenati）、八叠厌氧球菌（Anaerococcus octavius）和贪婪丙酸杆菌（Cutibacterium avidum），仅在SZ筛选获得的种有洛菲不动杆菌、阿氏芽胞杆菌、芽胞杆菌属细菌（Bacillus rubiinfantis）、特基拉芽胞杆菌和海考克氏菌，仅在SL筛选获得的种只有北见微杆菌，仅在SF筛选获得的种有黄腐短杆菌、混杂棒状杆菌（Corynebacterium confusum）、奇异棒状杆菌、纹带棒杆菌（Corynebacterium striatum）、棒杆菌属细菌（Corynebacterium timonense）、快速解脲棒杆菌、晋州皮杆菌（Dermabacter jinjuensis）、酪黄肠球菌、阴道孤独球菌（Eremococcus coleocola）、孔氏创伤球菌、劳氏慢长粒球菌（Ignavigranum ruoffiae）、马赛考克氏菌（Kocuria massiliensis）、格茨巨大球菌（Macrococcus goetzii）、松鼠哺乳动物乳球菌（Mammaliicoccus sciuri）、金黄色葡萄球菌、彼特拉斯葡萄球菌亚种（Staphylococcus petrasii subsp. croceilyticus）和停乳链球菌。

2.3 皮肤可培养细菌需氧性

在进行菌株筛选分离时，采用严格厌氧及好氧条件。对筛选鉴定的3 580株皮肤细菌需氧性进行分析，其中好氧细菌1 079株，占总菌株数的30.14%。严格厌氧细菌54株，占总菌株数的1.51%（表2），兼性厌氧细菌2 447株，占总菌株数的68.35%。分析可知，皮肤可培养细菌中兼性厌氧细菌及好氧细菌为主要菌群。门水平中，放线菌门和厚壁菌门中均有兼性厌氧、厌氧和好氧细菌；拟杆菌门和变形菌门只有好氧细菌。属水平中，肠球菌属中有兼性厌氧、厌氧及好氧细菌，厌氧球菌属、芬戈尔德菌属和嗜胨菌属中仅有厌氧细菌，短杆菌属、棒杆菌属、皮球菌属、考克氏菌属、微杆菌属、微球菌属、罗斯氏菌属、金黄杆菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、创伤球菌属、惰球菌属、乳球菌属、巨大球菌属、哺乳动物乳球菌属、链球菌属、食酸菌属、不动杆菌属、克雷伯氏菌属、克吕沃尔氏菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属和玫瑰单胞菌属中仅有好氧细菌；厌氧细菌种有厌氧球菌属细菌（Anaerococcus nagyae）、八叠厌氧球菌、痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）、颗粒丙酸杆菌、鼠肠球菌（Enterococcus ratti）、大芬戈尔德菌和拉西多嗜胨菌（Peptoniphilus lacydonensis），兼性厌氧细菌有海内氏芽胞杆菌（Bacillus haynesii）、贪婪丙酸杆菌、阴道皮杆菌、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、丙酸假丙酸杆菌、山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae）、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种和彼特拉斯葡萄球菌（Staphylococcus petrasii），其余筛选获得细菌种均为好氧细菌；筛选获得的所有菌种在筛选时所处的需氧环境见图3及表2。此外，图3还展示了培养基中是否添加5.0%的脱纤维羊血分别筛选获得的细菌种数量。

2.4 可培养细菌筛选使用培养基

对筛选鉴定的3 580株皮肤细菌筛选使用的培养基进行分析，9种培养基均筛选出了放线菌门和厚壁菌门，B、G、M和U未筛选出拟杆菌门，M和U未筛选出变形菌门。9种培养基在棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属和葡萄球菌属中均筛选出细菌，短杆菌属仅使用G筛选出细菌，创伤球菌属仅使用H筛选出细菌，哺乳动物乳球菌属仅使用B筛选出细菌，嗜胨菌属仅使用M筛选出细菌，克吕沃尔氏菌属仅使用S筛选出细菌，奈瑟菌属仅使用J筛选出细菌。9种培养基均筛选出的细菌种有结核硬脂酸棒状杆菌（Corynebacteriumtuberculostearicum）、天牛微杆菌（Microbacterium saperdae）、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种、彼特拉斯葡萄球菌和沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），仅在B筛选出的细菌种有拥挤棒杆菌、亚特兰大莫拉菌、人葡萄球菌、停乳链球菌、松鼠哺乳动物乳球菌（Mammaliicoccus sciuri）和杰氏棒杆菌（Corynebacterium jeikeium），仅在G筛选出的细菌种有桂林不动杆菌、特基拉芽胞杆菌、黄腐短杆菌、快速解脲棒杆菌和晋州皮杆菌（Dermabacter jinjuensis），仅在H筛选出的细菌种有蜡样芽胞杆菌、啤酒神金黄杆菌（Chryseobacterium gambrini）、奇异棒状杆菌、孔氏创伤球菌、北见微杆菌、莱拉微球菌和血孪生球菌，仅在I筛选出的细菌种有乳酸金黄杆菌（Chryseobacterium lacti）、海考克氏菌和乳酸乳球菌叶蝉亚种，仅在J筛选出的细菌种有洛菲不动杆菌、抗辐射不动杆菌、地衣芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、芽胞杆菌属细菌（Bacillus rubiinfantis）、棒杆菌属细菌（Corynebacterium timonense）、肺炎克雷伯氏菌和猴奈瑟菌，仅在M筛选出的细菌种有枯草芽胞杆菌和拉西多嗜胨菌（Peptoniphilus lacydonensis），仅在P筛选出的细菌种有阿氏芽胞杆菌、环状芽胞杆菌番红亚种、摩加夫芽胞杆菌和龋罗斯氏菌，仅在S筛选出的细菌种有酪黄肠球菌、栖冷克吕沃尔菌和巴氏葡萄球菌，U培养基未筛出其特有细菌种；不同培养筛选结果见图4和表3。

9种培养基添加5.0%脱纤维羊血筛选结果可知，添加5.0%的脱纤维羊血及不添加脱纤维羊血共同筛选出了42个种3 349株占所菌株种的38.89%、株数的93.55%。仅在添加5.0%的脱纤维羊血的培养基中筛选8种14株占所菌株种的7.41%、株数的0.39%。仅在未添加脱纤维羊血的培养基中筛选58种217株占所菌株种的53.70%、株数的6.06%。

2.5 潜在的细菌新种或新属

根据16S rRNA序列与NCBI的16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）数据库比对，序列相似度≤98.65%即为潜在新种，共获得39株26个潜在的新属或新种，占获得细菌总数的1.09%、细菌种的24.07%（表4）。从筛选所得潜在的新属或新种比较分析，可知每种培养基均筛选获得潜在的疑似新属或新种。其中B培养基筛选出的CNGBBF3SF07001菌株与NCBI的16S ribosomal RNA sequences数据库比对后，与其最接近的停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae） CCUG 27301相似度为88.26%，CNGBBF3SC02012与其最接近的口腔链球菌（Streptococcus oralis） ATCC 35037相似度为94.05%；G培养基筛选出的CNGBGF3SA02001菌株与其最接近的奥斯陆莫拉氏菌（Moraxella osloensis） DSM 6998相似度为94.62%；J培养基筛选出的CNGBJF3SF17006菌株与其最接近的Corynebacterium timonense 5401744相似度为92.14%；这四株为潜在的新属，其他35株为潜在的新种。CNGBBF3SY08005A和CNGBHF3SY08006A为厌氧细菌，且与其最接近的种均为八叠厌氧球菌（Anaerococcus octavius） NCTC 9810，其余37株均为好氧细菌；CNGBJF3SD12003B、CNGBIF3SD19007B、CNGBBF3SF12001B、CNGBSF3SF12005B、CNGBMF3SH05005B、CNGBPL3SL20005B、CNGBPF3SN18001B和CNGBSF3SY18005B共7株为在培养基中添加5%的脱纤维羊血是筛选所得，其中CNGBPF3SN18001B菌株与其最接近的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis） NBRC 100911也在未添加5%的脱纤维羊血的培养基筛选获得，剩余6株细菌与其最接近菌种，只在添加5%的脱纤维羊血的培养基筛选获得。

2.6 不同个体可培养细菌多样性

本项目采集了18个健康中国人的皮肤样品，对不同个体可培养细菌多样性进行分析。在门水平中，厚壁菌门在每个个体样品中均存在可培养细菌，拟杆菌门仅在1个个体样品中存在可培养细菌，放线菌门仅有1个个体样品中未获得可培养细菌，变形菌门在6个个体样品中存在可培养细菌；在属水平中，仅葡萄球菌属在每个个体中均存在可培养细菌，食酸菌属、厌氧球菌属、蛛网菌属、短杆菌属、金黄杆菌属、另位球菌属、芬戈尔德菌属、孪生球菌属、创伤球菌属、惰球菌属、克吕沃尔氏菌属、巨大球菌属、哺乳动物乳球菌属、奈瑟菌属、嗜胨菌属和玫瑰单胞菌属仅在1个个体样品中未获得可培养细菌，占所有属的48.49%；在种水平中，仅人葡萄球菌抗新霉素败血症亚种在每个人体样品中筛选获得可培养细菌，有59个种仅在1个个体中筛选获得可培养细菌，占所有种的54.63%，见图5。

3 讨论与结论

高通量培养组学技术在获得各类生境中的可培养微生物、发现潜在的疑似新种属及菌株相关功能及机制研究方面，发挥着越来越重要的作用。尤其是在人体肠道微生物研究方面，有研究学者利用33种培养基在有氧及厌氧环境下，对5份新鲜的肠道粪便样品进行筛选，证明粪便中丰度大于0.1%的细菌，95%可被培养获得^［41］；也有研究者通过高通量培养组学技术，获得了1 057个人体肠道菌种，使人体肠道菌种增加了531种，其中包括197个潜在的疑似新菌种^［40］。近年来，基于培养组学研究人体其他部位可培养细菌多样性及菌株与相关疾病之间的关系也越来越受关注，但是基于培养组学进行人体皮肤有关研究在国内却鲜有报道。

3.1 不同部位细菌多样性差异

为全面了解人体皮肤各个部位微生物多样性，本研究选取了8个皮肤部位进行研究，通过对筛选获得的3 580株细菌来源分析可知：SE筛选获得了25种102株；SD筛选获得了33种679种；SN筛选获得了29种751株；SH筛选获得了13种39株；SY筛选获得了37种739株；SZ筛选获得了34种468株；SL筛选获得了6种106株；SF筛选获得了43种696株，详见表4。从8个部位获得的菌株及菌种数量来看，SD、SN和SF最多，其原因可能是这些部位皮肤相对较为温暖潮湿、阴暗幽静、有腺体或毛孔分泌较多物质，还有充足的养分促进细菌生长，尤其是SF和SN处，皮肤环境较适合细菌滋生，SH和SL获得的菌株及菌种数量较少，可能是因为这两个部位为开放区域，经常受到外部环境影响，且会经常清洗，皮肤分泌的物质及其他物质会被清洗掉，已有研究表明使用清洗剂可能会改变皮肤菌群组成^［42］，人体不同部位的菌群受皮肤的生理影响很大，潮湿环境主要存在链球菌属及棒杆菌属^{［43，44］}。也有研究表明皮肤所处的身体位置是决定其菌群组成的主要因素，这与本研究的结果一致^［45］。

此外，本研究还表明中国健康人不同个体之间的皮肤可培养菌群差异较大，从18个健康人皮肤样品获得的可培养细菌菌种分析，共有菌种仅为葡萄球菌属中的人葡萄球菌。通过对本研究使用的培养基、培养条件等分析，可能是因为本研究采用的培养基种类不够全面，培养条件较少，不适合有些共有菌株筛选培养条件，后续需增加扩大培养基种类、培养条件及样品采集部位，进一步培养收集更多的皮肤可培养细菌。

3.2 培养组学对菌株筛选影响

为尽可能地筛选获得人体皮肤细菌，全面系统地了解人体皮肤可培养细菌分布情况，本研究通过使用9种培养基，在好氧和厌氧环境下，并在不同的培养基中添加5.0%的脱纤维羊、微量元素和维生素等，对18个人体皮肤微生物样品进行筛选，获得了3 580株细菌，覆盖4门33属108种，其中包含26个潜在的新属新种39株。其中使用B培养基筛选获得了45种425株；G培养基筛选获得了41中454株；H培养基筛选获得了52种488株；I培养基筛选获得了47种493株；J培养基筛选获得了50种494株；M培养基筛选获得了31种337株；P培养基筛选获得了39种428株；S培养基筛选获得了40种369株；U培养基筛选获得了12种92株；从9种培养基筛选获得菌株及菌种数量来看，H和J培养基筛选效果最佳，U培养基筛选效果最差，可能是因为H培养基不仅添加了各类蛋白胨丰富培养基的碳氮源及生长因子，氨基酸溶液、各类糖溶液提供碳氮源及促进细菌生长，而且添加了硫化钠可去除培养基中的氧气，HEPES维持培养基的pH，各类钠盐维持培养基的渗透压，盐溶液为细菌生长提供各类盐离子；其中J培养基是H培养基稀释10倍。从9种培养基整体分析可知，培养基的碳氮源及生长因子越丰富，其筛选获得的细菌数量及种类越多，可能是因为皮肤微生物是定植于皮肤表面，其能够从皮肤中获得大量的营养物质，因此皮肤细菌生长需要的营养成分种类较多。

通过对所有筛选获得的菌株使用的培养基中是否添加5%脱纤维羊血分析可知，5%脱纤维羊血对于皮肤菌群筛选获得可培养细菌菌种的影响不大，且在未添加脱纤维羊血的情况下，筛选出更多的细菌种，可能是因为脱纤维羊血在含有某些因子对于皮肤细菌的生长具有抑制作用。但是分析39株潜在的新属或新种可知，添加脱纤维羊血的培养基筛选获得了7种8株，占所有疑似新菌株种的26.92%、株数的20.51%；因此，虽然是否添加脱纤维羊血对于整体可培养细菌的种类筛选结果影响不大，但是对于获得潜在的新属或新种很有作用，可能是脱纤维羊血中存在某些生长因子促进了之前不可培养的细菌的生长。

3.3 筛选菌株需氧性分析

对获得的3 580株细菌需氧性分析，厌氧细菌仅54株，占比仅为1.51%，主要原因可能是皮肤为开放性环境，与空气直接接触，而对于厌氧细菌而言，氧气是其重要致死因子。本研究获得的7种厌氧细菌：厌氧球菌属细菌（Anaerococcus nagyae）^［46］、八叠厌氧球菌 ^［47］、痤疮丙酸杆菌^［48］、颗粒丙酸杆菌^［49］、大芬戈尔德菌^［50］和嗜胨菌属细菌（Peptoniphilus lacydonensis）^［51］6个种为严格厌氧细菌；鼠肠球菌^［52］为微需氧细菌。皮肤8个部位中，SE、SH、SL和SF中未分离到厌氧细菌，这四个部位除了SF，其余三个部位处于开放状态，与环境氧气接触密集，SF；而SY分离到37株，占所有厌氧细菌的68.52%，可能原因在于腋窝皮肤经常处于半开放状态，其与氧气接触面积较小，接触时长较短，且其褶皱内部环境长期昏暗且缺氧，更适合厌氧细菌滋生。好氧菌株92种1 079株，兼性厌氧菌株9种2 447株，表明皮肤菌株整体偏兼性厌氧，这与之前的文献报道相一致^［53］。

3.4 潜在新种与皮肤益生菌分析

本研究共获得26个潜在的新种或新属39株，可进一步扩展现有的皮肤菌种资源库，加深对皮肤菌群的理解，也表明皮肤中存在丰富的微生物资源。另外本研究获得的108个细菌种，其中有些菌种已有报道是一些具有潜在应用价值的益生菌。例如，有研究学者报道了一株皮肤人葡萄球菌菌株可产生的微球菌素P1抑制多种致病菌、抗生素抗性细菌生长^［54］；表皮葡萄球菌菌株的抗原通过非经典的MHCIb递呈，可激活CD8⁺T细胞，促进皮肤伤口愈合^［55］；路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）可产生一种新型含噻唑烷环肽抗生素路邓菌素可阻止了金黄色葡萄球菌在皮肤上定植^［56］；拥挤棒杆菌在体外培养时通过水解三油酰甘油酯释放油酸抑制肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的生长^［57］；痤疮丙酸杆菌可能表达一种新的硫肽抗生素cutimycin，有益与皮肤毛囊微生物群的生态学，并有助于减少葡萄球菌属对皮肤毛囊的定植^［58］。这些菌株有助于后续开展皮肤菌群与皮肤生态、皮肤疾病及皮肤益生菌机制方面的研究。

3.5 与已有的研究结果比较分析

已有研究报道，皮肤细菌的定植及其丰度差异，与环境、个体和家庭等因素相关^［59］；因此，本研究首先选择与中国人群皮肤多样性的宏基因组数据进行比较分析。有研究学者对中国香港40个人5个部位的200个样品进行了宏基因组研究，发现皮肤细菌隶属于52门750属，本研究获得的3 580株细菌隶属于4门33属，筛选培养结果和宏基因组研究结果差别较大^［36］。在门水平，宏基因组研究中放线菌门，变形菌门，厚壁菌门和拟杆菌门4个门，占总OTU的94%，这与本研究获得的4个细菌门一致。在属水平，宏基因组研究最优势的10个属占总OTU的53%，主要是丙酸杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、链球菌属、栖水菌属（Enhydrobacter）和棒杆菌属，与本研究的优势属葡萄球菌属（占总菌株数的82.07%）相近。在种水平，宏基因组分析和本研究分别获得了452个和108份细菌种，本研究获得细菌种占宏基因组细菌种的23%，种水平差异较大，但优势种保持一致。另外，宏基因组获得的OTU中82.2%与已知OUT的相似性小于97%，本研究获得的细菌中以序列相似度≤98.65%为疑似新种可知，株数的1.09%、细菌种的26%为疑似新种。总的来说，本研究获得的细菌种属与宏基因组分析结果总体一致，宏基因组的结果也说明，在皮肤菌群的研究中以培养技术为主的研究尚待发展。

国内尚未有通过培养组学技术进行皮肤细菌多样性研究，2020年国外有研究学者通过对17个西方健康人体皮肤使用12种培养基筛选获得了818株细菌，分布于3门38细菌属，通过构建系统发育树聚集为83个clusters，此研究中优势门为厚壁菌门，优势属为葡萄球菌属，优势种为表皮葡萄球菌，这与本研究获得的培养结果一致^［60］。国外研究虽然获得了38个细菌属，但是在门水平上未获得拟杆菌门，在种水平上种数也较少，尤其是两项研究在种水平上只有12个种是一致的，分别为：彼特拉斯葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、龋罗斯氏菌、宫颈玫瑰单胞菌（Roseomonas gilardii）、奥斯陆莫拉氏菌、酪黄肠球菌、人皮肤杆菌（Dermabacter hominis）、痤疮丙酸杆菌、矮小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。两项研究进一步表明，人体皮肤细菌虽然总体上在优势门属种上基本一致，但是皮肤菌群在种水平上个体差异较大，且与人类所处的环境和生活习性等密切相关。

3.6 结论

皮肤细菌的分离鉴定对于深入研究皮肤微环境、皮肤疾病以及开发利用皮肤微生物资源具有重要意义。本研究通过高通量培养组学对18个健康中国人皮肤菌群进行筛选培养，获得了3 580株好氧、兼性厌氧及厌氧细菌，覆盖4门33属108种，其中包括26种潜在新菌种39株，初步构建了中国健康人皮肤微生物菌株资源库。研究表明人体皮肤蕴藏着丰富的微生物资源，这些筛选获得菌株资源将为皮肤疾病的治疗、皮肤修复以及皮肤微生物与皮肤生态关系研究等提供重要的菌株资源基础。因此我们需要优化培养组学，例如设置培养温度梯度、采用不同pH的培养基等不同的条件，并扩大样品来源，进一步加强对皮肤微生物菌株的获得。后续我们还将对获得的这些菌株进行全基因组测序，构建皮肤微生物基因集，更好地为后续的医药开发、皮肤疾病研究等提供菌株及基因资源。本研究获得的所有菌株保藏于深圳国家基因库。该研究的相关结果数据已收录在国家基因库生命大数据平台（CNGBdb）的国家基因库序列归档系统（CNSA），项目编号：CNP0001936。

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基金资助

华大生命科学研究院项目(P17Z10200N0399)