春兰根内生真菌的分离鉴定及生防菌筛选

Isolation and identification of endophytic fungi from the root of Cymbidium goeringii and screening of biocontrol fungi

摘要

为从野生春兰根中分离并筛选出有益内生真菌，应用于提高春兰对环境的适应性和抗病性，本研究从春兰根段中分离培养获得内生真菌，结合真菌形态特征和分子生物学技术进行分类鉴定，将获得的真菌与三种兰科植物病原菌进行对峙培养以筛选拮抗菌，再用其发酵液进行复筛。从春兰根段内分离到11株真菌，经鉴定9株为常见的兰科菌根真菌美孢胶膜菌（Tulasnella calospora），1株为产红色色素的篮状菌（Talaromyces sp.），1株为毛壳菌（Chaetomium sp.）。11株真菌对齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）均无明显的抑制作用，9株美孢胶膜菌对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抑制率较低，但分离株毛壳菌Cg2⁃10⁃11对胶孢炭疽菌的和立枯丝核菌均表现出明显的抑制效果，其抑制率分别为（71.21±1.52）%和（87.04±5.78）%；篮状菌Cg2⁃10⁃7对立枯丝核菌的抑制率为（95.37±1.61）%，明显高于其对胶孢炭疽菌的抑制率（34.34±0.88）%。本研究结果显示春兰根中受到广泛认知的兰科共生真菌美孢胶膜菌对兰科常见病原菌拮抗效果不佳，而分离鉴定的篮状菌Cg2⁃10⁃7和毛壳菌Cg2⁃10⁃11则具有生防菌开发潜力，以期用于兰科植物的资源保护。

Abstract

In order to isolate and screen beneficial endophytic fungi from the root of wild Cymbidium goeringii， and apply them to improve the adaptability and disease resistance of C. goeringii to the environment， endophytic fungi were isolated and cultured from the root segments of C. goeringii， and then taxonomically identified in combination with morphological characteristics and molecular biological techniques. The obtained fungal strains were cultured against the pathogens of three pathogenic fungi to screen antagonistic strains， and then re⁃screened with their fermentation broth. Eleven fungal strains were isolated from the root segments of C. goeringii， nine were identified as the common orchid mycorrhizal fungus Tulasnella calospora， one as the red pigment producing fungus Talaromyces sp.， and one as Chaetomium sp. These eleven strains had no significant inhibitory effect on Sclerotium rolfsii， and nine strains of T. calospora had low inhibitory rates on Colletotrichum gloeosporioides and Rhizoctonia solani. However， the isolated strain （Chaetomium sp.） Cg2⁃10⁃11 showed obvious inhibitory effects on C. gloeosporioides and R. solani， and the inhibition rates were （71.21±1.52）% and （87.04±5.78）% respectively. The inhibition rate of （Talaromyces sp.） Cg2⁃10⁃7 against R. solani was （95.37±1.61）%， which was significantly higher than that against C. gloeosporioides （34.34±0.88）%. The results of this study show that the widely recognized orchid symbiotic fungus T. calospora in the root of C. goeringii has poor antagonistic effect against common orchid pathogens， while the isolated and identified strains Talaromyces sp. Cg2⁃10⁃7 and Chaetomium sp. Cg2⁃10⁃11 have the potential for biocontrol development and are expected to be used for resource conservation in orchids.

Graphical abstract

关键词

春兰 / 内生真菌 / 分离鉴定 / 生防菌

Key words

Cymbidium goeringii / endophytic fungi / isolation and identification / biocontrol fungus

0 引 言

春兰（Cymbidium goeringii）属于兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物中的地生兰类，是一种深受大众喜爱的中国传统花卉，且具有药用价值。但由于春兰等兰科植物的种子微小、缺少胚乳，是一类需要依赖真菌共生才可萌发和正常生长发育的植物，加之生境的破坏导致其野生种群资源稀少^［1］，因此春兰逐渐成为一种珍稀濒危植物。兰科植物的根内生菌包括了形成菌根特定结构的菌根真菌（orchid mycorrhizal fungi， OMF）和非菌根真菌（non-mycorrhizal fungi， NMF）的内生菌，统称为根相关真菌（root⁃associated fungi， RAF）^［2］。目前在兰科植物中发现的OMF多为担子菌门（Basidiomycotina）的角担菌科（Ceratobasidiaceae）、蜡壳耳科（Sebacinaceae）和胶膜菌科（Tulasnellaceae）真菌^［3］。OMF能为兰科植物提供营养物质，促进兰科植物生长，在增强植物的抗逆和抗病能力方面有积极作用^［4~6］。但在根中发现的NMF中也有能促进兰科植物种子萌发的真菌，说明这些RAF在兰科植物的生活史中都具有重要作用^［7］。因此，国内学者常将兰科植物根部的内生真菌当作菌根真菌的一部分进行研究，这增加了菌根真菌的多样性。在植物内生真菌的功能研究中发现它们对宿主植物也具有许多积极作用。例如增强植物抗逆性、拮抗病原菌、促进植物生长发育和促进药材有效成分积累等^［8~11］。植物内生真菌生产运用前景广阔，除了常将其作为生防菌剂和植物促生菌外，利用内生真菌合成例如紫衫醇等具有重要价值的活性物质，对人类重大疾病的治疗具有十分重要的意义。

兰属植物中的春兰、蕙兰（C. faberi）和建兰（C. ensifolium）等国兰种类观赏价值高，在居室园艺中应用广泛。基于植物组织培养技术的人工扩繁已经较为成熟，但组培无菌苗出瓶移栽后存在成活率低、生长缓慢和抗病性差等问题，并且在栽培过程中兰花的根、茎和叶常受到病原菌的侵害^［12］。由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）和胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodes）等病原菌所引起的兰花根腐病、白绢病和炭疽病大大降低兰花的观赏和经济价值，严重时致植株死亡，兰花病害成为制约兰花人工栽培生产的重要因素之一^［13］。本文从健康的野生春兰根中分离内生真菌，结合形态特征观察和rDNA⁃ITS序列分析对其进行鉴定，从中筛选出具有拮抗功能的生防菌，为进一步提高春兰对环境的适应性和抗病性的栽培应用提供菌种资源，同时可为春兰等兰科植物的资源保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的植物材料野生春兰采集于湖南省娄底市新化县渠江源景区川坳村部，供试指示菌由中国农业微生物菌种保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China， ACCC）提供，分别为齐整小核菌、立枯丝核菌和胶孢炭疽菌，现暂存于湖南省中亚热带优质花木繁育与利用工程技术中心。

1.2 仪器和试剂

超净工作台、摇床、离心机（Centrifuge 5418R）、超微量紫外分光光度计（DeNovix DS⁃11）、PCR扩增仪（ABI Veriti96 Well）、电泳仪（BIO⁃RAD PowerPac HV）、凝胶成像系统（BIO⁃RAD Universal HoodⅡ）、恒温培养箱、电子显微镜（Leica D⁃35578）、真菌DNA提取试剂盒（OMEGA D3390⁃01）以及PCR扩增试剂盒（Vazyme P505⁃01）等。

1.3 实验方法

1.3.1 培养条件

固体培养基均选用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA），液体培养基选用马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth， PDB），均采用28 ℃避光条件培养。

1.3.2 菌根真菌的分离和纯化

采用平板分离法。将春兰根段经流水清洗后在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗3~4次，尔后用0.1%HgCl₂溶液进行6 min、8 min和10 min三组不同时长消毒处理，最后用无菌水清洗5次。吸取200 μL最后一次洗脱水均匀涂布于PDA培养基上，另将表面消毒完成的根段轻压于PDA培养基表面上进行蘸根印迹法验证。每组均设3个重复，培养观察是否长出菌落判断根段表面消毒最适宜时长。将表面消毒处理后的三组根段切成2~3 mm厚的根片放置于PDA培养基上，每个平板放置4个根片，每组设置3个重复。以洗脱水和蘸根印迹法培养的三组平皿中均未长出菌落的处理时长为最佳，将表面消毒效果最佳的根片中分离培养的菌株进行纯化，多次纯化后接种于PDA斜面试管中培养，保存于4 ℃冰箱用于后续实验。

1.3.3 菌根真菌的鉴定

① 形态学鉴定。观察记录菌落生长速度、菌落形态特征、产孢情况等，用显微镜观察菌丝形态及其产孢结构，结合《真菌鉴定手册》^［14］等相关资料进行真菌初步鉴定。

② 分子生物学鉴定。取适量菌丝加入液氮研磨成粉，用真菌DNA提取试剂盒提取菌株总DNA，利用通用引物ITS1（5′⁃TCCGTAGGTGAACCTGCGG⁃3′）和ITS4（5′⁃TCCTCCGCTTATTGATATGC⁃3′）PCR扩增测序。PCR反应体系：ddH₂O 18 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix（10 mmol/L） 1 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各2 μL，Phanta Max Super⁃Fidelity DNA Polymerase 1 μL，模板DNA 1 μL，共计50 μL。PCR反应程序：预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 15 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min，彻底延伸72 ℃ 5 min，共35个循环。PCR产物的测序结果登录到NCBI GenBank数据库中运用BLAST（basic local alignment search tool）比对鉴定，并在NCBI中下载相似序列用于后续系统发育分析。

1.3.4 拮抗真菌的筛选

① 拮抗菌初筛。在平板（内部直径约8.5 cm）中央接种直径0.6 cm的病原菌菌饼，在距离病原菌菌饼2.5 cm处的3个角点处各接种一个测试真菌的菌饼，以在3个角点接种相同大小的空白培养基块为对照，均设置3个重复，培养并观察抑菌情况。菌落生长抑制率（%）=（对照组病原菌直径-处理组病原菌直径）/（对照组病原菌落直径-菌饼直径）×100%。考虑到不同种类真菌的生长速度不同，在本实验中所选取培养时间标准为平板中测试菌或病原菌长到平板最边缘处停止培养。

② 拮抗菌复筛。将初筛中抑菌效果较好的菌株接种于PDB液体培养基中，在摇床中设置转速180 r/min并培养10 d。将培养后的发酵液于4 ℃下8 000 g离心2 min，吸取上清液，用0.22 μm过滤器进行过滤，在平板中加入2 mL无菌滤液与PDA培养基混匀，中央接种病原菌，以接种到培养皿中加入等量无菌水的PDA培养基为对照组，每组均设置3个重复。观察记录病原菌生长情况并以病原菌平均直径计算菌落生长大致减少量。

1.3.5 数据分析

本文数据用Microsoft Excel记录和整理，并使用SPSS 25.0进行方差和差异显著性分析；采用软件ClustalW进行多重序列比对，使用软件MEGA 10.2.6以邻接法构建系统进化树，将Bootstrap设置为1 000；使用SigmaPlot 14.0绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌的分离

分离培养一周后表面灭菌处理时长为10 min的涂布组和蘸根组均无菌落长出，其表面灭菌效果最好。将该组中分离出的真菌进行多次纯化，共分离得到11株真菌，将其编号为Cg2⁃10⁃1至Cg2⁃10⁃11。

2.2 菌根真菌的鉴定结果

2.2.1 形态特征观察

如图1所示，根据真菌培养前期（7 d左右）和后期（20 d左右）的菌落形态特征将11株菌初步归类为三类：第一类真菌共9株，其菌落形态相似，包括菌株Cg2⁃10⁃1~Cg2⁃10⁃6，Cg2⁃10⁃8、Cg2⁃10⁃9、Cg2⁃10⁃10；第二类真菌为菌株Cg2⁃10⁃7；第三类真菌为菌株Cg2⁃10⁃11。

这三类真菌在菌落形态和显微结构上（图2）均有着较大差别，为三个明显不同的类群。第一类真菌菌落前期呈淡黄褐色，后期出现米白色同心环并紧贴培养基，整体呈革质或胶膜状；菌丝分隔，紧贴培养基的菌丝较粗短，多呈短念珠状（图2⁃A1），部分菌丝顶端横隔略明显且顶部可产生球状的担孢子（图2⁃A1和图2⁃A2）；菌落表面少量气生菌丝细长且通直，分支较少，呈锐角或近直角分支（图2⁃A3），常多根菌丝聚集相互交织成束（图2⁃A4）。第二类真菌培养前期边缘菌丝为白色至淡红色，稍靠内部表面呈淡黄色略带粉末状，中部浅红色且有许多细小孔洞，有微红色液体渗出，培养后期菌落表面有大量的灰绿色分生孢子，并产生红色色素将培养基染成酒红色；该菌具有双轮生或单轮生扫帚状的分生孢子梗（图2⁃B1），分生孢子椭球形或卵形，呈链状排列（图2⁃B2）；有少量椭球形的子囊果（图2⁃B3）；部分菌丝顶端含有红色色素（图2⁃B4）。第三类真菌培养前期整体呈现白色，隐约有黑色环纹，培养后期整体呈深灰色，白色的菌丝逐渐减少；观察到菌丝有隔膜，白色部分的菌丝较短小且常有不规则膨大（图2⁃C1）；深灰色部分的菌丝细长通直，近黑色，几乎不分支（图2⁃C2），且该部分的一些菌丝周围存在许多点状物（图2⁃C3）；子囊果表生，呈球型或烧瓶状，透明或灰暗色，附属丝钢毛状或短棒状（图2⁃C4），子囊孢子呈橄榄色，近柠檬形（图2⁃C3）。

2.2.2 分子生物学鉴定

将11株真菌的rDNA⁃ITS 序列片段测序，获得序列登录到GenBank利用BLAST进行同源序列比对。结果如表1所示，第一类9株真菌均与美孢胶膜菌（Tulasnella calospora）FJ613176.1的ITS序列片段的相似度达99%以上；第二类真菌与产紫篮状菌（Talaromyces purpureogenus）KM458841.1的ITS序列相似度在99%以上；第三类真菌仅与毛壳菌属真菌（Chaetomium sp.）KR154909.1 的ITS序列相似度最高（98.95%）。

以菌株Cg2⁃10⁃1作为第一类真菌中的代表菌株，与NCBI中真菌的相似序列构建系统进化树。如图3所示，菌株Cg2⁃10⁃1在系统进化树可与美孢胶膜菌聚在同一分支，且遗传距离较近；第二类真菌与产紫篮状菌和白双轮篮状菌（Talaromyces albobiverticillius）两个菌株同聚为同一分支；第三类真菌与毛壳菌属真菌为同一类群。

基于形态特征和rDNA⁃ITS研究结果， 参考《真菌鉴定手册》及相关文献^{［15～17］}将11个分离真菌鉴定为：第一类分离菌株Cg2⁃10⁃1~Cg2⁃10⁃6、Cg2⁃10⁃8~Cg2⁃10⁃10为美孢胶膜菌；第二类分离菌株Cg2⁃10⁃7为篮状菌；第三类分离菌株Cg2⁃10⁃11为毛壳菌。

2.3 拮抗真菌的筛选

2.3.1 拮抗真菌初筛

将分离获得的内生真菌作为测试菌与三株兰科植物常见病原菌进行平板对峙培养，培养结果显示齐整小核菌在培养3 d后快速布满整个培养基，此时11株测试菌仅有少量菌丝长出，病原菌菌丝可以覆盖或包裹在测试菌菌饼上，表明11个分离菌株对齐整小核菌均无抑制作用。但这些分离菌株对另外两种病原菌有不同程度的抑制效果。根据抑制率的统计结果（如图4）可知，毛壳菌Cg2⁃10⁃11对胶孢炭疽菌和立枯丝核菌均具有良好的抑制效果，其抑制率分别可达（71.21±1.52）%和（87.04±5.78）%；而篮状菌Cg2⁃10⁃7对立枯丝核菌的抑制率（95.37±1.61）%为所有测试菌中最高，且明显高于其对胶孢炭疽菌的抑制率（34.34±0.88）%，菌株Cg2⁃10⁃7能明显抑制立枯丝核菌的生长，病原菌仅在菌饼顶部长出少量菌丝；9个鉴定为美孢胶膜菌的菌株对胶孢炭疽菌和立枯丝核菌抑制率均较低，其中对胶孢炭疽菌的抑制率在（22.07±1.49）%~（31.34±0.88）%之间，对立枯丝核菌的抑制率在（30.56±11.12）%~（41.67±8.34）%之间。

2.3.2 拮抗真菌复筛

依据初筛试验结果，筛选出对两种病原菌抑制率均较高的菌株Cg2⁃10⁃7和Cg2⁃10⁃11以及挑选对两种病原菌平均抑制率较高的美孢胶膜菌Cg2⁃10⁃4作为测试菌进行复筛。将胶孢炭疽菌和立枯丝核菌两种病原真菌分别接入到含上述3个菌株发酵的培养液中，8 d后停止培养。病原菌生长情况如图5所示，与未加真菌发酵液的PDA培养基对比，胶孢炭疽菌和立枯丝核菌两种病原真菌在含美孢胶膜菌发酵液的PDA培养基中正常生长。立枯丝核菌在含篮状菌Cg2⁃10⁃7和毛壳菌Cg2⁃10⁃11发酵液的PDA培养基中生长受到抑制，表现在病原菌菌落大小和形状都有明显变化，与对照组相比其菌落直径分别平均减少约41%和49%，且菌落形状变得不规则。但胶孢炭疽菌在上述两种含有测试菌发酵液的培养基中生长未受到明显影响。

3 讨 论

近年来，国内外学者对兰科植物内生菌领域有许多的研究，由于兰科植物的生长发育离不开兰科菌根真菌，因此许多人以研究兰科菌根真菌及其与兰科植物共生应用为主，但却往往忽视兰科植物中内生菌对于兰科植物病害防治的重要性。目前化学农药对于环境污染问题愈加严重，并可能对植物本身产生不利影响，从植物体内获得内生菌作为生防资源开发为新型农药正逐渐成为一种广泛提倡的方式。春兰兼有良好的观赏价值和药用价值，但由于其需要在特定的环境中生长，野生资源较少，加之人为地过度采摘和环境的破坏，目前已经将其列为重点保护野生植物，因此提高春兰的抗病性对于保护春兰资源具有重要意义。

本实验从春兰菌根中分离获得11株真菌，通过形态特征将他们分为三类。rDAN⁃ITS序列分析结果表明，第一类分离菌株的序列与美孢胶膜菌的同源性很高。因此，将第一类分离菌株Cg2⁃10⁃1~Cg2⁃10⁃6和Cg2⁃10⁃8~Cg2⁃10⁃10鉴定为美孢胶膜菌。虽然第二类分离菌株的ITS序列与产紫篮状菌相似度高，但由于篮状菌属真菌物种间的显微结构特征差别较小，ITS序列不能够区分该属近缘种^［18］，而在基于rDNA⁃ITS序列构建的系统进化树中出现了该菌与两种篮状菌聚为一类的情况。根据已有经验得知篮状菌属真菌在不同培养基中形态差异较大，并且篮状菌属真菌在命名和分类上还存在有很大的争议，因此只能将第二类分离菌鉴定为篮状菌属（Talaromyces sp.）的成员，不能鉴定到种。第三类分离菌以形态特征鉴定和分子生物学手段能将其划归为毛壳菌属。美孢胶膜菌是兰科植物常见的共生真菌，目前已经多次报道；毛壳菌在春兰等兰科植物中分离频率较高，但通常毛壳菌不被认为是菌根真菌^［19］；篮状菌亦称踝节菌，目前在春兰中未见分离出该类真菌的报道，仅少数文献报道石斛属植物分离出了该类真菌并表现出较强抗真菌能力^{［20，21］}。

本实验结果显示，9株美孢胶膜菌对兰科常见病原菌抑制率均较低，而目前也未见此类真菌在拮抗病原菌上具有良好特性的报道，表明这类真菌可能并不具备良好的拮抗病原菌的特性。因此，在春兰等兰科植物人工栽培中除了考虑共生真菌的因素外，还应适当增加其他途径以提高春兰幼苗的抗病性。已有研究表明，篮状菌具有分泌纤维素酶降解木质纤维素、促进植物矿质元素吸收 、分泌物质增强植物抗病性以及拮抗多种病原菌等积极作用^［22~25］，而篮状菌中一些能产生红色色素的菌种还可用于食品工业^［26］。毛壳菌是重要的生防资源，具有广谱抗菌特性，这类真菌可通过多种方式协同作用以抑制病原菌，如与病原菌进行营养竞争、产生细胞壁降解酶和其他抑菌产物等^［27］，其产生的卵孢菌素具有良好的杀虫、抗菌及抗病毒活性^［28~31］。通过本实验可知从春兰菌根中分离的菌株Cg2⁃10⁃7对立枯丝核菌抑制效果较好，菌株Cg2⁃10⁃11对胶孢炭疽菌和立枯丝核菌具有较好的抑制效果，这两个分离菌具有开发为生防菌的潜力。真菌的生物防治机制有生长竞争、菌寄生、产生细胞壁降解酶、产生抗菌代谢产物和诱发植物防卫反应等^［32］。在本实验中菌株Cg2⁃10⁃7和菌株Cg2⁃10⁃11生长较快，在平板对峙中对病原菌产生较大的竞争作用，而在拮抗复筛中胶胞炭疽菌在含上述两株真菌发酵液的培养基中生长并未受到明显抑制，说明以上两株真菌与胶孢炭疽菌之间具有生长竞争关系但其代谢产物不能有效抑制胶胞炭疽菌的生长。

本研究从野生春兰的健康根中分离内生真菌，并采用多种方法对其进行鉴定，通过拮抗菌的筛选试验，从中获得两株鉴定为篮状菌属和毛壳菌属的真菌对兰科植物的病原菌具有良好的抑菌效果，为深入研究内生真菌对兰科植物抗病性影响的作用机制以及未来生防菌剂的开发奠定了一定基础。

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基金资助

湖南省教育厅项目(18B101)

湖南省研究生科研创新项目(QL20210170)

国家自然科学基金(31800522)