新生儿期长江江豚和印太江豚肠道微生物群落结构特征及差异分析

Characteristics and differences of gut microbial community of neonatal Yangtze finless porpoises and Indo⁃Pacific finless porpoises

摘要

鉴于肠道微生物对于宿主的营养吸收以及免疫抵御等生理机能至关重要，肠道微生物已经成为保护生物学的重要研究内容之一。然而，目前濒危鲸类肠道微生物的研究还非常有限。为了探究新生儿期长江江豚（Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis）和印太江豚（N. phocaenoides）的肠道菌群结构和多样性，本文采用Illumina Miseq高通量测序技术，对新生儿期长江江豚和印太江豚不同肠段的肠道菌群16S rRNA基因V3⁃V4区进行了测序和微生物群落分析。结果表明，新生儿期长江江豚和印太江豚的肠道菌群多样性、组成和潜在功能均存在显著性差异。与新生儿期印太江豚相比，新生儿期长江江豚肠道菌群多样性相对较低。长江江豚肠道内的优势菌门和菌属分别为厚壁菌门（Firmicutes）（65.25%）和梭菌属类群1（Clostridium sensu stricto 1）（40.67%）；而印太江豚的优势菌则分别为变形菌门（Proteobacteria）（57.78%）和弧菌属（Vibrio）（27.85%）。功能方面，新生儿期长江江豚肠道菌群中全局及概要图、碳水化合物代谢以及复制与修复等功能丰度显著高于印太江豚，而细胞群落⁃原核生物、膜运输以及能量代谢等功能丰度显著低于印太江豚。此外，在新生儿期长江江豚和印太江豚中，直肠菌群多样性以及信号转导等功能丰度均低于肠道其他部位（前肠、中肠和后肠），而糖生物合成和代谢的功能丰度高于肠道其他部位。本研究拓展了我们对新生儿期江豚肠道微生物群落组成和多样性的认识，将为探究婴幼儿江豚肠道微生物的建立和发育奠定基础。

Abstract

Because of the importance of gut microbes for host’s physiological functions such as nutrient absorption and immune defense， gut microbes have become one of the important research contents of conservation biology. However， the reserch on gut microbes of endangered cetaceans is still very limited. In order to investigate the gut microbial community structure and diversity of neonatal Yangtze finless porpoises （YFPs， Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis） and Indo⁃Pacific finless porpoises （IFPs， N. phocaenoides）， the 16S rRNA gene V3⁃V4 regions of microbial communities in different gut regions of YFPs and IFPs were sequenced by the Illumina Miseq high⁃throughput sequencing technique， and the microbial community structure and diversity were then analyzed. The results showed that the microbial diversity， taxonomic composition and functional potentials from neonatal YFPs and IFPs were significantly different. The dominant phylum and genus of YFPs were Firmicutes （65.25%） and Clostridium sensu stricto 1 （40.67%）， while the dominant phylum and genus of IFPs were Proteobacteria （57.78%） and Vibrio （27.85%）. Additionally， predicted functions including global and overview maps， carbohydrate metabolism， and replication and repair were more abundant in YFPs than those in IFPs； however， predicted functions including cellular community⁃prokaryotes， membrane transport， and energy metabolism were less abundant in YFPs than those in IFPs. In both YFPs and IFPs， lower microbial diversity and smaller proportion of predicted signal transduction were found in the rectal samples than those in other gut regions （foregut， midgut and hindgut）， while the function of glycan biosynthesis and metabolism was predicted higher in the rectal samples compared with that in other gut regions. This study expands our knowledge on the gut microbial community composition and diversity of the neonatal finless porpoises， and will provide basis for further exploring the gut microbial establishment and development in the early life stages of finless porpoises.

Graphical abstract

关键词

长江江豚 / 印太江豚 / 肠道微生物 / 新生儿

Key words

Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis / N. phocaenoides / gut microbial community / neonate

0 引 言

作为宿主的“第二套基因组”，肠道微生物与宿主在长期的协同演化过程中形成了互利共生的密切关系，并且对宿主的营养物质代谢以及免疫系统的发育和功能调节等方面都至关重要^［1，2］。近十几年来，得益于高通量测序技术的快速发展以及学科交叉融合，肠道微生物已经成为“保护宏基因组学”（conservation metagenomics）这一新兴分支学科的重要研究内容，为濒危动物的保护和研究提供了新的思路和方向^［3］。许多关于哺乳动物肠道微生物的研究表明，新生儿期是肠道微生物最初定植的关键时期，新生儿期肠道微生物对宿主的免疫系统构建以及各器官的成熟发育起着决定性作用^［4，5］。并且，新生儿期肠道微生物菌群极其不稳定，容易受到多种因素影响，新生儿期肠道菌群异常与儿童时期及成年期许多疾病（炎症性肠病、肠易激综合征、过敏性疾病等）的易感性有关^［6，7］。因此，探究新生儿期肠道微生物菌群结构特征及其变化规律，可为今后开展濒危动物肠道菌群的生理机能、稳态维持以及疾病防治等研究奠定理论基础。

长江江豚（Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis）是鼠海豚科（Phocoenidae）唯一的淡水种群，也是我国特有的小型淡水鲸类，仅分布于长江中下游干流以及鄱阳湖和洞庭湖中^［8］。目前长江江豚已处于极度濒危状况，其自然种群数量仅剩约1 012头^［9］，2021年升级为国家一级保护野生动物。长江江豚作为长江生态系统中的顶级捕食者，其生存状况直接反映了长江生态的健康程度。因此，亟需进一步加强长江江豚的研究和保护工作。目前长江江豚保护生物学研究主要集中在种群生态学、生理学、行为学、生物声学以及保护遗传学等方面，而关于长江江豚肠道微生物的研究相对薄弱。

由于对新生儿期鲸类进行粪便样品收集非常困难，因此当前关于新生儿期鲸类动物肠道微生物的研究非常有限。有研究对豢养条件下一头哺乳期瓶鼻海豚（Tursiops truncatus）三个年龄点（刚出生时、五月龄和八月龄）的粪便样品进行测序分析，发现哺乳期瓶鼻海豚肠道菌群的组成结构与成年瓶鼻海豚明显不同，而与母乳中的微生物组成结构更为相似^［10］。这可能预示着哺乳期鲸类肠道微生物的组成结构比较独特，并且会受到母乳的影响。由于食物和宿主的系统发育地位均对塑造肠道微生物的群落组成和功能有影响^［11］，要想全面了解鲸类动物生命早期肠道微生物的菌群特征并探索其普适性规律，还需开展其他鲸类物种，特别是野生鲸类的相关研究。此外，由于肠道各部位理化环境存在差异，肠道各部分的菌群结构及功能也可能有所不同^［12］。基于此，本研究拟对新生儿期长江江豚肠道不同部位的肠道菌群结构和多样性进行初步分析，并与其同属的海洋印太江豚（N. phocaenoides）进行比较分析，以期为研究江豚早期肠道微生物的建立和发育奠定基础，继而为江豚肠道菌群稳态维持及其健康管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 肠道内容物样品收集

用于本研究的新生儿期长江江豚和印太江豚个体信息如表1所示。实验利用的江豚个体均为新鲜的搁浅死亡的江豚幼崽。根据体长、上颌唇部触毛、脐带残留形态等特征判断出生不足一个月，完全依赖母豚乳汁生存。肠道内容物样品在病理解剖过程中进行收集。采样过程在无菌条件下进行，具体操作步骤如下。首先使用75%的酒精擦拭江豚腹部体表，随后用灭菌解剖刀把腹部剖开，并将肠道分离出来。将整个肠道划分为4个部分，包括前肠（从幽门胃末端到肠道前三分之一处）、中肠（肠道中部三分之一）、后肠（肠道后部三分之一到直肠前端）以及直肠。用扎条将各个部位的两端扎起，防止肠道内容物泄漏。对每部分肠道均采用三次局部采样，即截取三段肠道，每段2~5 cm，分别收集其内容物。采样之前先使用无菌磷酸盐缓冲溶液冲洗肠道外壁，随后将肠道中的内含物慢慢挤出，分别放入无菌离心管中。本研究共计收集60个样品用于后续DNA提取，共计58个样品用于后续测序（YFP3的一个后肠样品以及IFP1的一个中肠样品的DNA质量不能满足测序要求）。所有样品采集完毕后均放于液氮中保存，直至DNA抽提。

本研究涉及的江豚标本收集及解剖采样操作严格遵守《中华人民共和国野生动物保护法》等相关法律法规的规定。

1.2 微生物DNA提取及高通量测序

称取约150 mg肠道内容物放置在1.5 mL无菌Eppendorf离心管中，采用ZR Fecal DNA试剂盒（Zymo Research Inc.，CA，USA）进行基因组DNA提取，所有操作严格按照说明书进行。将得到的DNA溶液用Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）进行质量检测和浓度测定。总DNA保存于-80 ^oC用于后续PCR扩增。

以上述提取的基因组DNA作为模板，使用通用引物338F 5'⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCAG⁃3'和806R 5'⁃GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3'^［13］对细菌16S rRNA基因V3⁃V4高变区进行第一步PCR扩增。第一步的PCR产物用Agencourt Ampure XP磁珠（Beckman Coulter Inc.，CA，USA）进行纯化。将纯化后的PCR产物作为模板，使用带有barcode的引物进行第二步PCR扩增。把第二步PCR产物用QuantiFluor荧光定量仪（Life Technologies，CA，USA）进行定量。第一轮PCR反应体系如下：2.5 μL 10×PCR buffer Ⅱ（含有dNTPs）、0.25 U DNA聚合酶（FastPfu Polymerase）、0.4 μmol/L引物、10 ng DNA模板，补充灭菌去离子水至终体积25 µL。第二轮PCR反应体系同上，模板为第一轮PCR产物。PCR扩增条件如下：92 ℃预变性3 min、94 ℃变性20 s、53 ℃退火25 s、68 ℃延伸45 s，在此退火温度下继续循环10次（第二轮循环20次），最后68 ℃延伸10 min。之后，将不同样品的PCR产物等摩尔质量混合建成文库，在Illumina MiSeq测序平台（上海美吉生物医药科技有限公司）进行测序。

1.3 数据分析

①下机数据处理。首先基于Uchime去除嵌合体^［14］以及低质量序列^［15］。其次，采用UPARSE^［16］对所有样品的有效序列按照97%相似度聚类，形成operational taxonomic unit（OTU），并获得抽平（按照最小样本序列数）后的OTU表格。之后采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列参照Silva 138/16s_bacteria数据库（置信度为0.7）进行分类学比对，得到每个OTU的物种分类信息。利用FastTree algorithm^［17］对OTU构建系统发育进化树。

②alpha多样性分析。使用R软件中Picante安装包^［18］计算所有样品的alpha多样性指数，包括Richness（即taxonomic diversity）和Faith’s index（即phylogenetic diversity）。在R软件中利用Wilcoxon秩和检验对不同分组的微生物alpha多样性进行统计检验，显著水平为P<0.05。

③beta多样性分析及组间差异检验。基于抽评后的OTU表格，使用R软件进行beta多样性计算，基于Taxonomic distance（weighted Bray⁃Curtis distance）进行PCoA分析。使用Adonis（Permutational multivariate analysis of variance）分析检验组间以及组内的群落组成相似性。

④物种差异分析。为了比较不同江豚物种以及不同肠段肠道菌群丰度组成的差异，在R软件中利用Wilcoxon秩和检验获得组间显著性差异物种，并使用Fisher精确检验进行FDR校正。基于LEfSe（LDA effect size）分析进一步识别不同分组间具有显著性差异的菌群。

⑤微生物功能预测。利用PICRUSt 2.0软件进行功能预测^［19］，获得所有样品的功能丰度表格，并利用STAMP^［20］对不同分组的微生物功能丰度进行统计检验。

2 结果与分析

2.1 高通量测序序列情况

本研究中平均每个样品获得46 225条序列，对测序数据按照最低序列数（29 316）进行标准化处理后，共得到924个OTU，所有OTU注释到23门131目202科350属。以Observed OTUs指数为代表的稀疏曲线趋于平坦，并且所有样品的测序深度指数（Good’s coverage）均高于99.8%，表明本实验获得的测序数据量足够代表样品中的细菌多样性水平。

2.2 新生儿期长江江豚和印太江豚肠道不同部位的细菌多样性比较分析

本研究中，不同长江江豚个体以及不同印太江豚个体之间，肠道微生物的分类多样性指数（Richness）和系统发育多样性指数（Faith’s index）均无显著性差异（表2），表明本研究中新生儿期长江江豚和印太江豚的肠道微生物多样性不存在个体差异。通过比较两个江豚种发现，新生儿期长江江豚肠道微生物分类多样性指数显著低于印太江豚（P<0.05），而两者的系统发育多样性指数没有显著差别（P>0.05）。通过比较不同肠段发现，新生儿期长江江豚分类多样性指数在前肠处于较高水平，在中肠、后肠及直肠处于较低水平，而不同肠段的系统发育多样性指数没有显著性差异。新生儿期印太江豚不同肠段肠道微生物分类多样性指数和系统发育多样性指数变化规律一致，即前肠、中肠及后肠多样性指数均显著高于直肠（表2）。

2.3 新生儿期长江江豚和印太江豚肠道不同部位的细菌组成与结构

新生儿期江豚肠道微生物组成在不同个体间、不同江豚物种间以及不同肠段间均存在显著性差异，并且个体差异（Adonis： R²=0.56，P<0.001）对肠道微生物组成的影响最高，其次为物种（Adonis： R²=0.19，P<0.001），最后为不同肠段（Adonis： R²=0.07，P<0.001）。基于Bray⁃Curtis距离的PCoA分析也证实了上述结果，即肠道菌群组成明显地根据不同个体、物种以及不同肠段进行聚类（图1）。

统计分析发现，不同江豚个体两两之间的肠道菌群组成（OTU水平）存在显著性差异（Adonis，P<0.001），并且在门水平上表现出巨大差异（图2）。长江江豚个体YFP1（88.82%）和YFP2（97.39%）的优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes），但是长江江豚个体YFP3的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）（56.19%）和梭杆菌门（Fusobacteriota）（25.26%），其厚壁菌门仅占4.91%（图2）。虽然印太江豚个体IFP1和IFP2中占比最高的菌群均为变形菌门（分别为59.08%和54.09%），但是蓝藻菌门（Cyanobacteria）（28.38%）在个体IFP1中占比较高，而在个体IFP2中占比极低（<0.01%）。此外，与IFP1（厚壁菌门占比为5.17%，梭杆菌门占比低于0.01%）相比，个体IFP2中厚壁菌门（34.22%）和梭杆菌门（8.83%）的相对丰度较高（图2）。

通过比较两个江豚物种发现，新生儿期长江江豚肠道优势菌群为厚壁菌门（65.25%），而印太江豚肠道优势菌群为变形菌门（57.78%）（图3A）。物种间组成差异显著性检验分析显示（图3B）：印太江豚肠道内蓝藻菌门的相对丰度显著高于长江江豚；在纲水平，长江江豚肠道内梭菌纲（Clostridia）（63.25%）丰度较高，而印太江豚肠道内γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）（56.28%）和蓝藻菌纲（Cyanobacteriia）（14.2%）的相对丰度较高。两种江豚肠道内有显著性差异的细菌科（相对丰度>5%）主要包括梭菌科（Clostridiaceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）（图3B）。两种江豚有显著性差异的细菌属（相对丰度>5%）主要包括梭菌属类群1（Clostridium sensu stricto 1）、弧菌属（Vibrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）、梭菌属类群2（Clostridium sensu stricto 2）、Paeniclostridium、发光杆菌属（Photobacterium）和代尔夫特菌属（Delftia）（图3B）。

利用LEfSe差异分析筛选出新生儿期两种江豚不同肠段具有显著差异的微生物类群（LDA阈值为2）（图4）。结果显示，在长江江豚直肠中显著富集的菌群有黄杆菌科（Flavobacteriaceae）（2.03%）和黄杆菌属（Flavobacterium）（1.62%），而前肠中富集的物种包括肠杆菌目（Enterobacterales）（4.54%）、丛毛单胞菌科（5.26%）和代尔夫特菌属（5.26%）等（图4A）。在印太江豚肠道样品中，坦纳菌科（Tannerellaceae）（1.99%）和副杆菌属（Parabacteroides）（1.99%）在直肠样品中显著富集，而假单胞菌目（Pseudomonadales）（5.41%）、假单胞菌科（5.41%）和假单胞菌属（5.41%）等在前肠中富集，丙酸杆菌科（Propionibacteriaceae）（2.34%）、梭菌属类群7（Clostridium sensu stricto 7）（4.42%）和丙酸杆菌属（Cutibacterium）（2.23%）等在中肠中富集，草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）（2.25%）、棒状杆菌属（Corynebacterium）（1.87%）和马赛菌属（Massilia）（2.45%）等在后肠富集（图4B）。

我们进一步分析找出新生儿期两个江豚物种不同部位之间的共享菌群。在长江江豚中，共发现60个共享OTU。这些共享菌群主要包括梭菌属类群1（40%）、梭菌属类群2（18.44%）、代尔夫特菌属（8.97%）以及鲸杆菌属（Cetobacterium）（8.66%）等（图4C）。在印太江豚中，共发现58个共享OTU。这些共享菌群主要包括弧菌属（Vibrio）（29.88%）、假单胞菌属（17.84%）以及Paeniclostridium（15.31%）等（图4D）。

2.4 新生儿期长江江豚和印太江豚肠道菌群的功能预测

基于PICRUSt 2.0功能预测分析，新生儿期长江江豚和印太江豚肠道菌群在二级功能分类上共获得了46个KEGG功能簇，其中相对丰度较高的功能类别有：全局及概要图（global and overview maps）（38.8%）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）（9.8%）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）（7.2%）、辅助因子与维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）（4.3%）、膜运输（membrane transport）（3.9%）及能量代谢（energy metabolism）（3.8%）。通过对不同江豚个体进行比较分析发现，不同长江江豚个体以及不同印太江豚个体之间的KEGG三级功能分类类群组成均存在显著性差异（Adonis： P<0.001）。在相对丰度排名前十的KEGG三级功能分类类群中，长江江豚不同个体中有关次级代谢物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、不同环境下的微生物代谢（microbial metabolism in diverse environments）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、ABC转运蛋白（ABC transporters）、群体感应（quorum sensing）和嘌呤代谢（purine metabolism）等功能丰度在两两个体之间均存在显著差异（P<0.05）。印太江豚IFP1个体中代谢通路（metabolic pathways）、不同环境下的微生物代谢以及双组分信号系统（two⁃component system）等功能的相对丰度均显著高于IFP2个体，而核糖体（ribosome）、群体感应和嘌呤代谢等功能的相对丰度显著低于IFP2个体（P<0.05）（图5）。

通过比较两个江豚物种发现，新生儿期长江江豚肠道菌群中全局及概要图（如氨基酸及次级代谢产物的生物合成）、碳水化合物代谢（如果糖和甘露糖代谢）以及复制与修复（核苷酸剪切修复）等功能丰度显著高于印太江豚，而在细胞群落⁃原核生物（霍乱弧菌Vibrio cholerae及大肠杆菌Escherichia coli的生物膜形成）、膜运输（如ABC转运蛋白和细菌分泌系统）以及能量代谢（如氮代谢）等功能丰度则显著低于印太江豚（图6和表3）。

在新生儿期长江江豚不同肠段未检出有显著性差异的功能类别。在新生儿期印太江豚的前肠、中肠和后肠中，膜运输（图7a）以及信号转导（图7b）等功能丰度显著高于直肠粪便样品，而内分泌与代谢疾病（图7c）、复制与修复（图7d）以及糖生物合成与代谢（图7e）等功能丰度显著低于直肠样品。值得注意的是，在新生儿期长江江豚不同肠段中，信号转导（图7f）以及糖生物合成与代谢（图7g）两种功能的相对丰度表现出与印太江豚相同的变化趋势，虽然并无显著性差异。

3 讨 论

随着人类微生物组计划的实施，人类新生儿期肠道微生物的研究已经广泛开展，为揭示人类疾病和健康的关键问题提供了重要见解^{［21，22］}。相比之下，由于采样困难，鲸类动物新生儿期肠道微生物的研究极为匮乏。本研究我们利用扩增子高通量测序方法，对搁浅死亡的新生儿期长江江豚和印太江豚肠道不同部位的细菌微生物群落特征及其潜在功能进行了初步分析。虽然本研究收集利用的新生儿期长江江豚和印太江豚的个体数量有限，但是基于这些珍贵样品的研究填补了我们在新生儿期江豚肠道微生物研究方面的空白，为后续进一步研究濒危鲸类生命早期肠道微生物的定植、建立及发展过程奠定了科学基础。

虽然新生儿期的长江江豚和印太江豚均以母乳为食物来源，但是本研究发现长江江豚和印太江豚肠道微生物的多样性、组成及潜在功能均存在显著性差异（表2，图1、2和3）。值得注意的是，新生儿期印太江豚肠道微生物中细菌（霍乱弧菌Vibrio cholerae及大肠杆菌Escherichia coli）生物膜形成的功能丰度显著高于长江江豚（表3）。细菌形成的生物膜是一道保护性物理屏障，是细菌应对环境压力（如pH降低）的一种生存策略^［23］。由于细菌生物膜，特别是致病菌生物膜对抗生素药物以及宿主免疫防御机制有很强的抗性^［24］，因此，与长江江豚相比，新生儿期印太江豚可能面临着较高的肠道疾病风险。这可能与印太江豚主要分布在人类活动比较密集的沿海浅水海域有关。

通过与已有的齿鲸研究进行比较分析发现，新生儿期印太江豚肠道菌群组成与哺乳期瓶鼻海豚的肠道菌群组成显著不同，新生儿期印太江豚的优势菌门为变形菌门（57.78%），其次为厚壁菌门（Firmicutes）（图2A），而哺乳期瓶鼻海豚的优势菌门为厚壁菌门（86%），变形菌门的丰度则相对较低（8%）^［10］。虽然新生儿期长江江豚和哺乳期瓶鼻海豚的优势菌门均为厚壁菌门，但是二者在科水平上具有显著差异（图2A）。新生儿期长江江豚的优势菌科为梭菌科（59.7%）、假单胞菌科（9.59%）和丛毛单胞菌科（8.87%），而哺乳期瓶鼻海豚的优势菌科为梭菌科（34%）和消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）（31%）^［10］。由于母乳的营养成分可能会受到食物资源（食物的多样性以及可获得性）的影响^［25］，我们推测，哺乳期长江江豚、印太江豚和瓶鼻海豚肠道微生物的差异可能与不同豚类的母乳成分差异有关。当前人工环境下长江江豚新生儿的人工哺乳主要依赖海豚配方奶粉，鉴于肠道微生物对于宿主的营养吸收以及免疫抵御等方面至关重要^{［26，27］}，因此，根据海豚的标准设计的配方奶粉不一定适合淡水长江江豚新生儿肠道菌群的稳态维持，以及幼豚个体的生长发育。所以，研制适合长江江豚新生儿的配方奶粉并且做到精准营养补充是目前人工环境下新生幼豚护理需要攻克的一大技术瓶颈。通过对婴幼儿时期长江江豚的肠道微生物进行长期监测，了解其肠道微生物的定植、建立和发展过程，并且同步解析母豚不同泌乳阶段的乳汁营养成分和乳汁微生物的动态变化过程，可以更好地探究肠道微生物和乳汁微生物对长江江豚生长和发育的影响，进而为研制更接近母乳的长江江豚配方奶粉提供科学支撑。

通过与其他海洋哺乳动物的肠道微生物进行比较分析，发现新生儿期长江江豚和印太江豚肠道中的优势菌门（厚壁菌门和变形菌门）在其他齿鲸和鳍脚目（Pinnipedia）中丰度也较高，如东亚江豚（N. a. sunameri）、南象海豹（Mirounga leonina）和斑海豹（Hydrurga leptonyx）^{［12，28］}。但是，长江江豚和印太江豚的肠道微生物组成与须鲸明显不同。如太平洋座头鲸（Megaptera novaeangliae）和露脊鲸（Eubalaena glacialis）肠道内的优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）^［11］，而拟杆菌门在成年及新生儿齿鲸肠道中的丰度都极低，如成年长江江豚（0.12%）^［29］、新生儿期长江江豚（0.08%）、新生儿期印太江豚（0.14%）以及成年东亚江豚（0.76%）^［12］。与主要捕食小型鱼类的齿鲸不同，须鲸主要滤食富含几丁质外骨骼的甲壳类动物和小型鱼群。因此，须鲸肠道内拟杆菌门丰度较高可能与拟杆菌门的一些细菌类群能够有效降解多糖几丁质有关^［30］。

本研究发现，在新生儿期长江江豚和印太江豚肠道内，直肠样品的微生物多样性较低，而前肠、中肠和后肠的微生物多样性较高（表2）。在目前已有的研究中，不同动物的不同肠段菌群多样性变化规律并不一致。在大鼠中，菌群多样性随着肠道从前往后逐渐增加^［31］，大菱鲆（Scophthalmus maximus）菌群多样性随着肠道从前往后递减^［32］，而大西洋鲑鱼（Salmo salar L.）肠道不同部位菌群多样性无显著性差异^［33］。此外，成年东亚江豚肠道内粪便（直肠）、后肠和胃的微生物（细菌和真菌）多样性较高，而前肠的微生物多样性较低^［12］。不同宿主中肠道微生物多样性的不同分布规律可能是由于采样方法（肠道内容物、肠道黏膜物）、宿主肠道理化环境（如各部位酸碱度差异）以及样品数量较少等原因导致。鲸类动物肠道微生物多样性的变化规律是否具有普适性，还需通过扩大样本量对不同鲸类物种的肠道微生物开展进一步研究证实。

参考文献

[1] Shi N, Li N, Duan X, et al. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system [J]. Military Medical Research, 2017, 4(1): 1⁃7.

[2] Frame L A, Costa E, Jackson S A. Current explorations of nutrition and the gut microbiome: a comprehensive evaluation of the review literature [J]. Nutrition Reviews, 2020, 78(10): 798⁃812.

[3] Wei F W, Wu Q, Hu Y B, et al. Conservation metagenomics: a new branch of conservation biology [J]. Science China Life Sciences, 2019, 62(2): 168⁃178.

[4] Sanidad K Z, Zeng M Y. Neonatal gut microbiome and immunity [J]. Current Opinion in Microbiology, 2020, 56: 30⁃37.

[5] Stewart C J, Ajami N J, O'Brien J L, et al. Temporal development of the gut microbiome in early childhood from the TEDDY study [J]. Nature, 2018, 562(7728): 583⁃588.

[6] Munblit D, Peroni D G, Boix⁃Amorós A, et al. Human milk and allergic diseases: an unsolved puzzle [J]. Nutrients, 2017, 9(8): 894.

[7] Milliken S, Allen R M, Lamont R F. The role of antimicrobial treatment during pregnancy on the neonatal gut microbiome and the development of atopy, asthma, allergy and obesity in childhood [J]. Expert Opinion on Drug Safety, 2019, 18(3): 173⁃185.

[8] Jefferson T A, Wang J Y. Revision of the taxonomy of finless porpoises (genus Neophocaena): the existence of two species [J]. Journal of Marine Animals and their Ecology, 2011, 4(1): 3⁃16.

[9] Huang J, Mei Z G, Chen M, et al. Population survey showing hope for population recovery of the critically endangered Yangtze finless porpoise [J]. Biological Conservation, 2020, 241: 108315.

[10] Soverini M, Quercia S, Biancani B, et al. The bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) faecal microbiota [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2016, 92(4): fiw055.

[11] Sanders J G, Beichman A C, Roman J, et al. Baleen whales host a unique gut microbiome with similarities to both carnivores and herbivores [J]. Nature Communications, 2015, 6(1): 1⁃8.

[12] Wan X L, McLaughlin R W, Zheng J S, et al. Microbial communities in different regions of the gastrointestinal tract in East Asian finless porpoises (Neophocaena asiaeorientalis sunameri) [J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 1⁃10.

[13] Roggenbuck M, Bærholm Schnell I, Blom N, et al. The microbiome of New World vultures [J]. Nature Communications, 2014, 5(1): 1⁃8.

[14] Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection [J]. Bioinformatics, 2011, 27(16): 2194⁃2200.

[15] Kong Y. Btrim: a fast, lightweight adapter and quality trimming program for next⁃generation sequencing technologies [J]. Genomics, 2011, 98(2): 152⁃153.

[16] Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads [J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996⁃998.

[17] Price M N, Dehal P S, Arkin A P. Fast Tree: computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix [J]. Molecular Biology and Evolution, 2009, 26(7): 1641⁃1650.

[18] Kembel S W, Cowan P D, Helmus M R, et al. Picante: R tools for integrating phylogenies and ecology [J]. Bioinformatics, 2010, 26(11): 1463⁃1464.

[19] Douglas G M, Maffei V J, Zaneveld J, et al. PICRUSt2: an improved and customizable approach for metagenome inference [J]. BioRxiv, 2020: 672295.

[20] Parks D H, Tyson G W, Hugenholtz P, et al. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles [J]. Bioinformatics, 2014, 30(21): 3123⁃3124.

[21] Sanidad K Z, Zeng M Y. Neonatal gut microbiome and immunity [J]. Current Opinion in Microbiology, 2020, 56: 30⁃37.

[22] Wong E, Lui K, Day A S, et al. Manipulating the neonatal gut microbiome: current understanding and future perspectives [J]. Archives of Disease in Childhood⁃Fetal and Neonatal Edition, 2021, doi:10.1136/archdischild-2021-321922 .

[23] Rinaudi L V, Giordano W. An integrated view of biofilm formation in rhizobia [J]. FEMS Microbiology Letters, 2010, 304(1): 1⁃11.

[24] Kumar A, Alam A, Rani M, et al. Biofilms: Survival and defense strategy for pathogens [J]. International Journal of Medical Microbiology, 2017, 307(8): 481⁃489.

[25] Zeng X Y, Huang S L, Qian Z Y, et al. Characterization of milk composition in narrow⁃ridged finless porpoises (Neophocaena asiaeorientalis) at different lactation stages [J]. Marine Mammal Science, 2017, 33(3): 803⁃816.

[26] Frame L A, Costa E, Jackson S A. Current explorations of nutrition and the gut microbiome: a comprehensive evaluation of the review literature [J]. Nutrition Reviews, 2020, 78(10): 798⁃812.

[27] Broom L J, Kogut M H. The role of the gut microbiome in shaping the immune system of chickens [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2018, 204: 44⁃51.

[28] Nelson T M, Rogers T L, Carlini A R, et al. Diet and phylogeny shape the gut microbiota of Antarctic seals: a comparison of wild and captive animals [J]. Environmental Microbiology, 2013, 15(4): 1132⁃1145.

[29] Wan X L, Ruan R, McLaughlin R W, et al. Fecal bacterial composition of the endangered Yangtze finless porpoises living under captive and semi⁃natural conditions [J]. Current Microbiology, 2016, 72(3): 306⁃314.

[30] Bauer M, Kube M, Teeling H, et al. Whole genome analysis of the marine Bacteroidetes ‘Gramella forsetii’ reveals adaptations to degradation of polymeric organic matter [J]. Environmental Microbiology, 2006, 8(12): 2201⁃2213.

[31] Li D Y, Chen H Q, Mao B Y, et al. Microbial biogeography and core microbiota of the rat digestive tract [J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1⁃16.

[32] Xing M, Hou Z, Yuan J, et al. Taxonomic and functional metagenomic profiling of gastrointestinal tract microbiome of the farmed adult turbot (Scophthalmus maximus) [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 86(3): 432⁃443.

[33] Navarrete P, Espejo R T, Romero J. Molecular analysis of microbiota along the digestive tract of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar L.) [J]. Microbial Ecology, 2009, 57(3): 550⁃561.

基金资助

中国博士后科学基金(2020M682530)

中国科学院生物多样性保护项目(ZSSD-004)