新疆荒漠地带裸土剖面微生物群落结构和功能分析

Analysis of microbial community structure and function of bare soil profile in desert area of Xinjiang

摘要

以了解新疆哈密荒漠地带裸土剖面微生物群落特性、为土壤荒漠化防治提供理论依据为目的，运用现场原位采样和高通量测序技术，研究了天山山脉北坡荒漠地带裸地不同海拔高度土壤微生物群落垂向格局及功能特性。PCoA结果表明：表层土壤（0~5 cm）和非表层土壤（10~15 cm、20~25 cm）群落组成存在显著差异，Subgroup_6、γ变形菌纲、Nitrosophaeria、Phycisphaeria是引起差异的主要类群（纲水平），且土壤含水率是驱动土壤微生物整体群落和主要类群垂向分布的重要原因；在门水平上，三层土壤深度均以放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）为新疆哈密荒漠土壤门水平主要类群。Tax4fun2功能预测结果显示，碳代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、外源物质生物降解和代谢随土壤深度增加逐渐减小，推测可能是含水量的增加使得土壤容重增加，氧气含量减小，限制了微生物代谢能力所致。本文研究成果可为探究我国荒漠系统土壤微生物生物地理格局和土壤结构演变提供基础性数据。

Abstract

In order to understand microbial community of bare soil profile from Hami desert in Xinjiang and provide theoretical basis for combating land degradation and desertification， we used in situ sampling and high⁃throughput sequencing technigues to analyze the vertical pattern and functional characteristics of soil microbial communities at different altitudes in the bareland of the desert on the northern slope of the Tianshan Mountains. PCoA show that， the microbial community structure of the surface layers（0-5 cm） is markedly different from the subsurface soil layers（10-15 cm， 20-25 cm）. Subgroup_6， Gammaproteobacteria， Nitrosophaeria， Phycisphaeria are the main taxa（class level） responsible for differences in microbial communities， and soil water content is an important reason to drive the vertical distribution of the whole soil microbial community and main groups. The dominant phyla from the desert zone included Actinobacteria， Acidobacteria， Proteobacteria， Planctomycetes， Chloroflexi. Based on the Tax4fun2 prediction， microbial potential functions related to carbohydrate， amino acid metabolism， xenobiotics biodegradation and metabolism and lipid metabolism were found to gradually decrease with the increase of soil depth. This may be caused by the increase of soil bulk density and the decrease of the oxigen content due to the increase of water content， which limits the metabolic capacity of microorganisms. This study can provide basic data for exploring soil microbial biogeographic pattern and soil structure evolution in desert systems in China.

Graphical abstract

关键词

天山北坡 / 荒漠草地 / 裸土 / 土壤微生物群落 / 多样性 / Tax4fun2

Key words

northern slope of Tianshan Mountains / desert grassland / bare soil / soil microbial community / diversity / Tax4fun2

0 引 言

中国新疆地处欧亚大陆腹地，年降雨量150 mm，且存在大片植被稀疏、盐碱化和沙漠化相对严重、生态环境相对脆弱的荒漠区域。荒漠是陆地生态系统的重要组成部分，其面积变化是草地荒漠化或生态环境变化的重要标志^［1］。新疆的荒漠草地主要分布在干旱⁃半干旱的绿洲或荒漠过渡带、山前平原，是新疆草地面积分布最广的生态类型，对于新疆生态环境变化有重要的指示意义。

微生物是荒漠化土壤生态系统中主要的生态群体，对土壤物质生物地球化学循环、土壤结构与性质的演变等均具有重要意义。土壤环境因素对微生物多样性、群落组成和功能属性的作用，一直以来是研究的热点。土壤养分（如有机碳、氮含量以及存在形式等）是塑造微生物群落组成和分布的重要因素之一^［2］；在任何类型的土壤环境中pH值都是目前公认的驱动微生物分布的关键因子^［3，4］。此外，在森林土壤微生物的垂向分布模式的研究中发现，微生物群落结构随深度的变化归因于地表、渗流带和饱和带土壤的不同物理化学条件，据此得出含水率对土壤微生物分布的重要性^［5］。在水分利用率低的荒漠生态系统，含水率的作用显得尤其重要^［6］。干旱降低了土壤中活性有机碳和氮的含量，并限制了土壤养分的物理扩散和化学形态的转化^［7］，从而限制了微生物的代谢活性。除pH、含水率以及养分含量以外，土壤结构、植被^［8］、氧化还原电位^［9］、盐度^［10］及离子含量^［9］等都对土壤微生物群落分布有重要影响。这些影响因素的相对重要性取决于不同的调查区域，并且各要素之间并不是相互独立的，他们之间存在着密切的相互作用。例如，降水、土壤养分和植被之间不可分割的相互影响会覆盖降水和养分本身对微生物的直接作用。然而，稀缺的营养成分、较低的水分可利用率和常年干旱导致的盐分的富集塑造了荒漠地区独特的土壤环境，独特的环境导致干旱地区土壤微生物明显有别于非干旱地区，发现全球干旱地区土壤微生物群落组成能够调节生态系统多功能性对全球变化的抵抗力，对荒漠生态系统的土壤微生物研究可以深入认识各地区优势物种富集的具体原因，并建立预测模型来阐明土壤细菌群落的时空分布及其对气候变化的响应机制^［11］。土壤深度作为小尺度环境梯度，是研究微生物分布格局和驱动机制的天然试验场，许多重要的循环过程，例如碳氮循环是由整个土壤剖面的微生物共同完成的，对土壤剖面微生物群落结构的研究有助于多角度探究土壤中重要转化过程及机理。因此，深入研究新疆荒漠区裸土微生物的群落结构和分布格局具有重要的理论和实践意义。

基于上述分析，本研究以新疆天山东麓北段典型荒漠生态系统为研究对象，基于Illumina⁃Miseq平台的高通量测序技术，对荒漠裸地沿土壤剖面（0~25 cm）的微生物群落结构进行了分析，并结合主要的地理环境要素，初步探究了裸土剖面微生物垂向生态格局的形成机制。同时利用Tax4fun2和KEGG数据库对新疆荒漠区裸土剖面微生物的潜在功能进行预测，以期为新疆荒漠化土壤保护提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于新疆哈密市伊吾县境内的东天山北麓东段灌木半灌木荒漠地带裸地，东经94°9’，北纬43°21’，海拔范围在2 000~2 100 m，属于温带半灌木、灌木荒漠地带。生长优势植物种类为芨芨草，植被覆盖度比较低，近年来归一化植被指数在0.14~0.16。气候特征为温带大陆性干旱气候，寒冷多雪，年降水量为11.5~200 mm，年蒸发量为2 000~4 378 mm，气温变化在43.5~45.0 ℃，研究区主要土壤类型为棕灰漠土。

1.2 样品采集与处理

在研究区内由低到高均匀设置5个采样单元（50 cm×50 cm），分别命名为M1、M2、M3、M4和M5，每个采样单元设置3个采样点，各采样点之间距离不超过1.5 m。在每个采样点挖取1个土壤剖面表层（0~5 cm）、中层（10~15 cm）和底层（20~25 cm），之后分别将相同采样单元的三个样点同一深度土壤等量均匀混合为一个土样，每个单元获取三个土样，共15个样品，样品基本信息见表1。将采集的土壤分别装入灭菌样品袋，低温运回实验室。到实验室后，将土壤样品过筛（2 mm），并分成两份，一份置于-80 ℃冰箱用于土壤总DNA提取，另一份风干后用于理化指标测定分析。

1.3 土壤基本理化性质测定

参照标准NY⁃T 1377⁃2007和HJ802⁃2016将风干后土壤样品与去离子水按照1∶5（m∶V）混合后分别使用pH计（德国德图，testo pH2）和电导率仪（上海雷磁，DDS⁃307A）测量土壤pH和电导率（soil electric conductivity，EC）。土壤总碳（total carbon，TC）、总氮（total nitrogen，TN）含量使用元素分析仪测定（德国JENA，EA4000）。土壤总有机碳（soil organic carbon，TOC）含量使用TOC仪（德国JENA，Multi N/C2100）测定。使用烘干法测定土壤含水量（soil water content，SWC）。

1.4 DNA提取及高通量测序

使用MN NucleoSpin 96 Soil试剂盒提取土壤DNA；使用515（5'⁃GTGYCAGCMGCCGCGGTAA⁃3'）和926R（5'⁃CCGYCAATTYMTTTRAGTTT⁃3'）扩增引物16s rRNA基因V4-V5可变区，DNA提取和高通量测序（Illumina Miseq platform）由百迈克基因组测序公司（北京）进行测序获得原始序列保存为FASTQ格式，使用FLASH^［12］（version 1.2.11）对原始序列进行拼接，将拼接好的序列用Trimmommatic^［13］（version 0.33）进行质量过滤，并去除嵌合体，最后得到高质量的tags序列。使用USEARCH^［14］软件（USEARCH，version 10.0）在97%的相似度水平下进行分类单元OTUs的划分，以0.005%的群落相对丰度作为阈值展开过滤并获得最终OTUs信息表。根据各个样品OTU与Silva数据库对比后获得各分类水平下的物种丰度信息。使用Mothur（version.1.30，http：//www.mouthur.org/）软件计算Alpha多样性指数。功能基因预测采用Tax4fun2，基于R包Tax4fun2在unix平台进行。将获得的物种信息与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行比对，得到物种功能基因丰度信息，包括KEGG的一级和二级代谢通路划分归类。

1.5 数据分析

使用单因素方差分析（ANOVA）评估不同土壤深度微生物α多样性、土壤理化指标和主要物种相对丰度整体差异，使用配对样本T检验比较任意两个土壤深度的理化性质和α多样性以及主要微生物种群相对丰度差异。利用spearman相关系数衡量土壤性质与α多样性、主要种群（门或纲水平）的相关关系。用基于Bray⁃Curtis距离的主坐标（PCoA）分析不同样本微生物群落结构差异（β多样性），多元置换方差分析（permutational multivariate analysis of variance， PERMANOVA）检验不同深度微生物群落差异性。用基于线性判别分析（LDA）的LEfSe分析来判别差异物种的影响力。PCoA分析使用R语言vegan包实现。用R语言vegan包计算土壤理化指标的方差膨胀因子（VIF），根据DCA分析结果中lengths of gradient大小（<3）选择冗余分析（RDA）和Mantel检验对环境要素和群落结构进行关联分析。用蒙特卡洛置换（Monte Carlo permutation，迭代次数为999次）检验每个环境因子与物种分布相关的显著性。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质特征

各土壤样品的理化特征沿土壤深度表现出不同的递变规律，如图1所示。每个采样单元的土壤总碳表现为表层>中层>底层，土壤含水率表现为表层<中层<底层，经单因素方差分析表明，土壤pH（P=0.168>0.05）、电导率（P=0.607>0.05）和有机碳（P=0.633>0.05）在土壤深度梯度上未呈现显著差异和递变规律。土壤含水率和总碳表现出在中层和底层更同步的变化趋势，说明中层和底层影响土壤环境形成条件较为类似。土壤总氮与土壤总碳含量（r=0.858，P<0.05）、总氮与有机碳含量（r=0.708，P<0.05）之间具有显著的正相关关系。

2.2 土壤微生物多样性

通过高通量测序，从15个样品中共鉴定出 1 124个可操作分类单元（OTU），α多样性计算结果如表2所示。基于表2数据进行单因素方差分析，结果P>0.05，表明物种丰富度和多样性指数在不同土壤深度和海拔梯度间均无显著性差异。

基于Bray⁃Curtis距离的主坐标分析（PCoA）（图2）和PERMANOVA分析表明，土壤深度（P<0.01）和海拔梯度（P<0.01）均显著影响了微生物群落结构，除M1点以外，土壤微生物群落对不同土壤深度条件（R2=30.873%，P=0.008）的响应比海拔梯度（R2=25.997%，P=0.024）更明显。在不同土壤剖面深度上，土壤细菌群落结构在表层与其他两层之间存在明显差异（P<0.05），但中层和底层微生物群落未产生明显差异。

2.3 土壤微生物群落结构和组成

2.3.1 门水平微生物类群分析

在本研究采集的土壤样品中，相对丰度大于1%的门水平类群有9个。其中放线菌门（Actinobacteria），平均相对丰度22.19%；酸杆菌门（Acidobacteria），平均相对丰度16.58%；变形菌门（Proteobacteria），平均相对丰度15.72%；浮霉菌门（Planctomycetes），平均相对丰度13.08%；绿弯菌门（Chloroflexi），平均相对丰度10.99%，是主要类群（图3），平均相对丰度前10的门水平类群均存在于三种土壤深度。单因素方差分析（ANOVA）表明，奇古菌门（Thaumarchaeota）、棒状杆菌门（Rokubacteria）和浮霉菌门的相对丰度在不同土壤深度上差异显著（P<0.05）。其中，奇古菌门在土壤中层（8.55%）的相对丰度最高，其次是底层（5.60%）和表层（3.99%）；浮霉菌门相对丰度沿土壤深度逐渐减小；棒状杆菌相对丰度沿土层深度逐渐增大。

2.3.2 纲水平微生物类群分析

从纲水平上看，土壤深度对于物种分布影响更加显著。在相对丰度前10的门中，共有11个纲在不同土壤深度中差异显著（P<0.05）（如图4所示），其中subgroup_17、subgroup_6、P2⁃11E、δ⁃变形菌、γ⁃变形菌以及NC10共5个纲的相对丰度随深度增加增加，酸微菌纲、Phycisphaerae相对丰度沿深度增加逐渐减小。Nitrososphaeria在中层丰度显著高于表层和底层。

LEfSe分析表明（如图5），在纲分类水平上，Subgroup6、γ变形菌纲、Nitrosophaeria、Phycisphaeria四个类群是影响微生物群落结构的最主要物种，并且这四个类群是相对丰度前10的纲。

2.4 土壤理化因子对土壤微生物群落结构的影响

通过VIF对环境因子去共线性筛选，选取SWC、pH、TC、TOC、EC与不同样点微生物群落进行RDA分析（图6），RDA分析和蒙特卡洛置换检验（如表3所示）表明土壤含水率、电导率、土壤总氮含量对土壤微生物群落具有显著影响（P<0.05），其中含水率对微生物群落的影响最大，Mantel test结果表明，随着含水率差异的逐渐增大，物种组差异也逐渐增大。Spearman相关性表明（图7），芽单胞菌门相对丰度与土壤总有机碳呈显著正相关（r=0.6023，P<0.05），浮霉菌门相对丰度与土壤含水率呈显著负相关（r=-0.6071，P<0.05），相反Rokubacteria相对丰度与土壤含水率呈显著正相关（r=0.688，P<0.01）。并且奇古菌门相对丰度与TC、TOC和TN均呈负相关。在纲分类水平上，丰度前10的物种与环境因子的相关关系比门水平更加显著，嗜热油菌纲（P<0.05）、phycisphaerae（P<0.01）的相对丰度与土壤含水率呈负相关（P<0.05），浮霉菌纲（P<0.05）、γ变形菌纲（P<0.01）、Subgroup_6（P<0.05）的相对丰度与土壤含水率呈正相关。

2.5 Tax4fun2基因预测

基于Tax4fun2进行菌群功能预测，并通过与KEGG数据库对比，共获得6类KEGG一级代谢通路功能基因，及这些一级代谢通路下的46个二级代谢通路功能基因，其中有14类功能基因相对丰度对土壤深度有显著响应（图8），其中碳代谢、氨基酸代谢、外源物质生物降解和代谢、脂质代谢等功能基因表现出随土壤深度增加逐渐减少的特征，说明表层土壤比底层土壤具有更高的代谢潜能。而核苷酸代谢、膜运输以及能量代谢随着土壤深度增加显著增加。此外，研究区域存在较高的基础代谢基因丰度和较低的调控基因。

3 讨 论

以往研究表明，土壤深度和海拔是微生物多样性和群落结构的重要环境梯度^［3］，而植被通常是驱动土壤微生物在垂向和海拔急剧变化的主要原因。通常，受地表植被影响，土壤微生物丰富度和多样性均随土壤深度和海拔增加而显著降低^［15］，然而对于本研究区，地表缺乏植物凋落物以及根系分泌物带来的外源营养输入，未在土壤剖面和海拔高度上形成营养的垂向递减，使得产生不同于以往的微生物α多样性格局。同时，各土层和各海拔之间土壤理化因子没有显著差异也是差异不显著的主要原因之一。

Bray⁃Curtis距离的主坐标分析（PCoA）结果表明，在天山北麓东段荒漠草地，土壤表层微生物群落（0~5 cm）显著区别于非表层（中层15~20 cm和底层25~30 cm），原因可能是土壤表层温差和太阳辐射因素导致表层群落明显区别于底层。含水率和总氮表现出在中层和底层更同步的变化趋势（图2），由此推测含水率和总氮可能是影响表层和底层土壤环境的因素，表层与底层环境变化趋势不同的原因可能是表层土壤更容易受到当地气候或偶然因素，例如：动植物引起的有机物意外输入，而底层土壤则更多受历史沉积因素影响（例如古气候因素）^［10］。土壤微生物多样性的海拔分布格局很大程度上受地理尺度影响^［16］，在东天山典型的小尺度海拔山丘区域，各海拔间无植被类型分异，10 cm深度对微生物群落影响大于海拔。

以往许多研究表明pH^［17］是不同深度土壤细菌群落结构的最佳预测因子，但是本文研究区域为干旱地区，pH变化范围（7~8）较小，pH对其影响并不显著^［18］。而有限的土壤水分是天山北麓荒漠土壤微生物整体群落组成（图5）和主要物种（图6）的控制因素。

天山北麓东段荒漠草地土壤细菌以放线菌门（22.19%）、酸杆菌门（16.58%）、变形菌门（15.72%）、浮霉菌门（13.08%）、绿弯菌门（10.99%）为主要类群，这一结果类似于在泰塔温沙漠土壤细菌主要类群^［19］。与全球干旱地区微生物门水平主要类群相比，本研究区浮霉菌门相对丰度较高^［20］。在门分类水平上，产生显著垂向差异的物种都具有较低物种丰富度，如奇古菌门（只有Nitrososphaeria一个纲被检出），棒状杆菌门（只有NC10一个纲被检出），相反，酸杆菌门亚群较多，不同的亚群具有不同的生活模式^［5］，丰富的基因多样性帮助酸杆菌门生存在各种不同的土壤环境中，酸杆菌门可以利用从简单的糖类到半纤维素、纤维素和几丁质等复杂的糖类^{［21，22］}，本研究土壤中酸杆菌门存在12个纲，使得酸杆菌门的相对丰度总和在垂向分布上差异不明显。在浮霉菌纲分类水平上，存在两个主要类群，分别是Phycisphaerae和浮霉菌纲，其中phycisphaerae的垂向分布是主要引起浮霉菌门相对丰度沿土壤深度减小的原因，它可以在好氧环境下分解多种多糖^［23］，底层土壤的厌氧环境限制其对碳源利用。棒状杆菌门只有NC10一个纲水平类群被检测出，已知NC10是厌氧甲烷氧化功能菌^［24］，NC10的厌氧特性使得棒状杆菌门相对丰度表现出垂向增加，其与含水率的强正相关性不能说明水分直接影响其代谢。在纲分类水平上，土壤深度对于各物种分布的影响更加明显，丰度前10的纲中，有4个纲的相对丰度在土壤深度上存在明显差异（P<0.05）。相关性热图显示（图7），丰度前10的物种在纲水平与环境因子的相关性大于门水平，丰度前10的纲中50%物种与含水率存在显著的相关关系（P<0.05）。

利用Tax4fun2对物种进行功能基因预测结果显示，随着深度增加，碳代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等维持微生物基础代谢基因的相对丰度逐渐减小，表明表层土壤比底层土壤具有更高的代谢潜势。不仅在荒漠生态系统，在草地生态系统和森林生态系统也有相似结论^{［25，26］}。随着土壤深度的增加（图1b），土壤含水率也随之增加（如图1b），使得土壤容重增加^［27］，从而导致土壤含氧量水平逐渐降低^［28］。细菌尤其是好氧细菌通常对高氧浓度环境具有正响应，即高氧环境促进微生物代谢，含水率通过改变土壤容重和含氧量从而影响微生物群落功能。刘慧霞等^［29］曾报道，新疆荒漠地区不同土壤质地下土壤容重均随着土层深度的增加呈增加的趋势。且本研究发现严格好氧菌土壤红杆菌目（Solirubrobacterales）沿土壤深度逐渐减少，更好证实了随着土壤深度的增加，氧气含量逐渐减少。与其他干旱地区土壤微生物功能基因结构类似，天山北麓东段荒漠草地微生物具有相对较高的维持基础代谢所需基因，而参与基因调控和与微生物竞争相关的基因，例如抗生素基因、次生代谢产物相关基因的相对丰度较低，意味着微生物群落对恶劣干旱环境的适应策略。

4 结 论

本文利用高通量测序技术获得北疆典型高海拔荒漠地区土壤剖面微生物群落多样性与结构分布格局，探讨了在无植被干扰下微生物的垂向分布格局和影响因素，为荒漠系统土壤微生物物种组成与多样性地理格局的研究积累了数据与理论基础。

研究结果表明，在哈密地区典型高山荒漠地带，排除植被干扰后，有机物并不是影响土壤微生物垂向分布变化的主要原因，含水率影响了微生物群落整体分布和丰度物种的垂向变化。单个物种的丰富度会极大程度影响门水平物种在土壤剖面上的分布差异。相较于哈密地区东天山典型的小尺度海拔山丘区，土壤深度梯度对微生物群落结构影响更大。Tax4fun2的物种功能基因预测结果显示，沿土壤剖面含水率的增加和含氧量的下降导致微生物整体代谢能力逐渐降低。

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基金资助

国家自然科学基金(42077221)