基于UHPLC⁃QqQ⁃MS对蟾衣中游离氨基酸与总氨基酸的分析

Analysis of free amino acids and total amino acids in toad coat based on UHPLC⁃QqQ⁃MS

摘要

为探究蟾衣的营养和药用价值，采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC⁃QqQ⁃MS）技术，分析蟾衣中游离氨基酸和总氨基酸的组成及含量。实验结果显示，在蟾衣样品中分析出的游离氨基酸有11种：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、γ⁃氨基丁酸、酪氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸；总氨基酸有18种：精氨酸、胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、γ⁃氨基丁酸、酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸；并检出了17种氨基酸的含量：谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，组氨酸和胱氨酸含量较低。此外，本研究建立的UHPLC⁃QqQ⁃MS技术用于测定上述游离氨基酸和总氨基酸专属性好，灵敏度高，可检测较低质量浓度的氨基酸。蟾衣的氨基酸种类丰富，药用氨基酸种类齐全，具有重要的营养价值和药用价值。实验结果可为深入研究蟾衣药材的资源开发利用提供基础资料。

Abstract

In oder to explore the nutritional and medicinal value of toad coat， the composition and content of free amino acids and total amino acids in toad coat were anlyzed by ultra high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry （UHPLC⁃QqQ⁃MS）. The results showed that 11 free amino acids （aspartic acid， glutamate， lysine， γ⁃aminobutyric acid， tyrosine， threonine， proline， valine， leucine， isoleucine， phenylalanine） and 18 total amino acids （arginine， cystine， histidine， aspartic acid， glutamate， serine， lysine， glycine， threonine， alanine， γ⁃aminobutyric acid， tyrosine， proline， valine， methionine， leucine， isoleucine， phenylalanine） were detected in the toad coat. The contents of 17 amino acids were detected， and glutamate was the highest， followed by aspartic acid， while histidine and cystine were lower. In addition， UHPLC⁃QqQ⁃MS technology established in this study has good specificity and high sensitivity to determine the above free amino acids and total amino acids， and can detect amino acids with low mass concentration. There are many kinds of amino acids in toad coat， which have important nutritional and medicinal values. The results can provide basic data for the further study of the resource development and utilization of toad coat.

Graphical abstract

关键词

蟾衣 / 超高效液相色谱串联三重四极杆质谱 / 游离氨基酸 / 总氨基酸

Key words

toad coat / UHPLC⁃QqQ⁃MS / free amino acid / total amino acid

0 引 言

蟾衣又名蟾宝、月魄、蟾蜕等，是一种民间动物类药材，来源于蟾蜍科（Bufonidae）动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）自然脱下的角质衣膜^［1，2］。蟾衣性凉，味辛，有微毒，具有清热解毒、利水消肿、抗癌止痛等多种功效，可治疗慢性肝病、肺癌、肝癌、糖尿病、慢性气管炎、腹水、疔毒、疮痈等多种疾病^{［3， 4］}。现代药理学研究其具有强心^［5］、降血糖^［6］、抗肿瘤和增强免疫^［7］等作用并对蟾衣抗肿瘤成分如酯蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基等做了较多研究^{［1，2，8］}，蟾衣作为一种蟾蜍蜕皮应富含较多氨基酸蛋白，然而关于这方面的报道却不多见。因此，应进一步对蟾衣中的氨基酸进行研究。氨基酸作为人体的必需营养成分，是蛋白质的基本结构单位和参与代谢过程中的重要物质，一般以游离态或结合态广泛存在于自然界中^［9］。本文应用灵敏度高、分析速度快、特异性强的超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UHPLC⁃QqQ⁃MS）技术对蟾衣中的游离氨基酸和总氨基酸进行分析，旨在清晰了解蟾衣中游离氨基酸和总氨基酸的组成与含量，为蟾衣资源的开发利用提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

① Agilent 1290 UHPLC（配有在线脱气机、DEBAA06309二元泵、DEBAP07937自动进样器、DEBAL12966柱温箱和DEBAF04820二极管阵列检测器，中国安捷伦有限公司）；Sciex API 4000三重四级杆质谱（SCIEX公司）；三重四极杆质谱数据采集软件Analyst® 1.7；三重四极杆质谱数据分析软件Peak View 1.2；万分之一天平ME104、百万分之一天平 XPR2（上海梅特勒⁃托利多国际贸易有限公司）；SIGMA 3K15超高速离心机（上海希格玛高技术有限公司）；R206旋转蒸发仪（上海大颜仪器设备有限公司）。

② 亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、茶氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、γ⁃氨基丁酸、脯氨酸对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度均≥98.0%）；盐酸（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；乙腈（质谱纯，Merck公司）；水（蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司北京饮料分公司）；甲酸铵（质谱纯，赛默飞世尔科技公司）。

③ 蟾衣购自安徽安远县，经贵州医科大学药学院龙庆德教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍产的蟾衣，经处理后并自然干燥。

1.2 方法

1.2.1 对照品储备液的制备

精密称定丙氨酸、脯氨酸各1.5 mg，精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、茶氨酸、胱氨酸和谷氨酰胺各1 mg，均置10 mL容量瓶中，记为瓶1；精密称定γ⁃氨基丁酸1.5 mg、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸各1 mg，均置20 mL容量瓶中，记为瓶2；精密称定苏氨酸2.5 mg、甘氨酸2 mg、组氨酸1 mg，均置于10 mL容量瓶中，记为瓶3；精密称定蛋氨酸1 mg，置于20 mL容量瓶中，记为瓶4；向瓶2、3、4中加适量0.1 mol/L盐酸溶液溶解后定容至刻度，摇匀，各取1 mL均置于瓶1中，加50%乙腈溶液稀释并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备

①游离氨基酸定性分析供试品溶液的制备： 精密称定供试品粉末1 g，置锥形瓶中，加50 mL沸水，水浴加热10 min（每5 min取出摇晃），混匀后取适量样品溶液，15 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

②总氨基酸定性分析供试品溶液的制备： 精密称定供试品粉末0.5 g，置水解管中，加入6.0 mol/L盐酸10 mL，加3~4滴苯酚，混匀，充氮气密封，置110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管，冷却至室温，抽滤，取滤液于旋转蒸发仪中浓缩挥干盐酸，用水洗（每次2 mL）数次至盐酸彻底挥干，0.1 mol/L的盐酸定容至20 mL，混匀。取适量4 ℃ 15 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，于10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L的盐酸稀释并定容至刻度，摇匀，取适量4 ℃ 15 000 r/min离心5 min，即得。

③总氨基酸定量分析供试品溶液的制备： 精密称定供试品粉末0.1 g，平行两份，置水解管中，加入6.0 mol/L盐酸10 mL，加3~4滴苯酚，混匀，充氮气密封，置110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管，冷却至室温，抽滤，取滤液于旋转蒸发仪中浓缩挥干盐酸，用水洗（每次2 mL）数次至盐酸彻底挥干，0.1 mol/L的盐酸定容至25 mL，混匀。取适量4 ℃ 15 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，分别置于25、50 mL容量瓶中，加0.1 mol/L的盐酸稀释并定容至刻度，摇匀，取适量4 ℃ 15 000 r/min离心5 min，即得。

1.2.3 色谱条件

采用Agilent Poroshell 120 HILIC⁃Z色谱柱（3.0×100 mm，2.7 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样量：1 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：A为2 mmol/mL甲酸铵⁃水溶液，B为2 mmol/mL甲酸铵⁃乙腈溶液；洗脱梯度见表1。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子化源（ESI），扫描方式为多反应监测（MRM）模式；正离子模式检测；离子源温度500°C；离子喷雾电压5 500 V；雾化气（Gas 1）50 psi；辅助加热气（Gas 2）50 psi；气帘气30 psi；氮气作为喷雾辅助气体。在上述仪器条件下测定，各氨基酸的质谱采集参数见表2。

1.2.5 标准曲线的制作

取对照品储备液适量，加50%乙腈稀释为含丙氨酸、脯氨酸1.5、3.0、7.5、15.0、30.0 μg/mL，精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL，γ⁃氨基丁酸0.75、1.50、3.75、7.50、15.0 μg/mL，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL，苏氨酸0.25、0.5、1.25、2.5、5.0 μg/mL，甘氨酸0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL，组氨酸0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL，蛋氨酸0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 μg/mL系列的混合标准曲线溶液。按1.2.3和1.2.4项下条件测定，重复3次，以峰面积Y（对照品峰面积与内标峰面积之比）对质量浓度X（对照品质量浓度与内标质量浓度之比）绘制标准曲线并进行计算。

2 结果与分析

2.1 专属性试验

取中浓度混合对照品的标准溶液按1.2.3和1.2.4项下优化条件进行测定，结果显示21种氨基酸对照品峰型良好，均未在相应位置出现其他干扰成分，表明具有良好的专属性。21种氨基酸的MRM图，见图1。

2.2 样品测定

2.2.1 游离氨基酸定性分析

采用UHPLC⁃QqQ⁃MS技术MRM模式采集数据，分析蟾衣样品中的游离氨基酸，样品MRM各通道离子流图分别见图2。结果表明，蟾衣中存在11种游离氨基酸，分别为：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、γ⁃氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）。

2.2.2 总氨基酸定性分析

采用UHPLC⁃QqQ⁃MS技术MRM模式采集供试品数据，分析蟾衣样品水解后的总氨基酸，供试品MRM各通道离子流图见图3。结果表明，蟾衣水解后的总氨基酸有18种：精氨酸（Arg）、胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、赖氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、γ⁃氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）。

2.2.3 总氨基酸定量分析

按照1.2.2项下的提取方法制备供试品溶液，平行制备2份，按1.2.3和1.2.4项下条件进行测定，通过标准曲线法计算蟾衣中各氨基酸的含量，结果见表3。由表3可知，从蟾衣中检出17种氨基酸的含量，谷氨酸含量最高，为13.724%；其次是天冬氨酸，为10.325%；含量较低的氨基酸为组氨酸和胱氨酸，分别为0.984%和0.833%。其中包含7种必需氨基酸和10种非必需氨基酸，必需氨基酸与氨基酸总量的比例（E/T）为32.052%，必需氨基酸总量与非必需氨基酸总量的比例（E/N）为63.718%。检出的药用氨基酸种类齐全，包括谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸9种。

3 讨 论

蟾蜍蜕衣的自然过程是边蜕边吃，所以很难在野外找到蟾衣，古今本草文献也未见蟾衣的药用记载，直到20世纪末，蟾衣才被发现并进行了人工辅助采集，故蟾衣是一种新的蟾蜍药用资源^［10］。蟾衣在民间常用于癌症、慢性肝炎、腹水等疑难杂症的治疗，药理学实验研究也表明蟾衣在体内具有明显的抗肿瘤效果和增强免疫效应^［7］，但蟾衣在体外却无明显抑制肿瘤作用^［11］，据此我们猜想可能是由于蟾衣作为一种蜕皮，其主要成分是氨基酸蛋白有关。氨基酸作为一种功能物质，不仅是营养成分，与药物的活性也有着密切的关系。自然界中氨基酸有20多种，其中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸9种氨基酸一般在植物中含量少，有些人体不能合成，但又是维持机体氮平衡所必需的，称为药用氨基酸^［12］。

因此，本试验利用UHPLC⁃QqQ⁃MS快速对蟾衣中游离氨基酸和总氨基酸进行了分析，结果表明蟾衣中含有游离氨基酸11种，总氨基酸18种，并检出了17种氨基酸的含量。参考FAO/WHO提出的理想蛋白模式，质量较好的氨基酸组成为E/T在40%左右，E/N在60%以上。本研究中，蟾衣的E/T为32.052%，E/N为63.718%，与WHO/FAO规定的标准很接近，说明蟾衣含有较优质的蛋白。蟾衣中检出的药用氨基酸种类齐全，其药用氨基酸占总氨基酸的比例高于枸杞、枇杷等中药，与石斛含量相当^{［13，14］}。谷氨酸和天冬氨酸作为蟾衣中主要的药用氨基酸，在人体氨基酸蛋白质的代谢过程中起着关键的作用。研究表明，谷氨酸具有健脑、保肝护肝、防止癫痫的作用^{［15，16］}；而天冬氨酸具有增强机体免疫力、消除疲劳、促进肝功能、保护心肌和调节脑神经代谢等作用，可治疗心脏病和高血压等疾病^［17~19］。其他药用氨基酸如赖氨酸可促进钙吸收和生长发育、缓解疲劳与人体免疫功能相关^［20］；精氨酸有改善心脑血管疾病、增强机体免疫功能等作用^［12］；蛋氨酸可有效防治动脉硬化及高脂血症、提高肌肉活力和促进皮肤蛋白质及胰岛素的合成^［13］；亮氨酸是蟾衣中含量最低的药用氨基酸，具有控制血糖、提供能量和促进伤口及骨头愈合的作用^{［19，21］}。这些药用氨基酸均有助于患者机体的修复，也是蟾衣在体内具有明显抗肿瘤效果的原因之一。

综上所述，蟾衣中药用氨基酸种类齐全、含量丰富，具有较高的营养和药用价值，并且在采集蟾衣的过程中，不需要杀死蟾蜍，可人工活体取衣循环利用，不会造成蟾蜍资源的破坏。因此，蟾衣是一种很好的可持续利用的中药资源，其潜在的药用和食用价值值得研究。

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基金资助

贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwjkj2019-1-100)

贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术课题研究资助项目(QZYY-2016-060)