利用原生质体融合选育米尔贝霉素高产菌株

Breeding of high⁃yield strain of milbemycin by protoplast fusion

摘要

以米尔贝霉素产生菌株M1834与M18102为出发菌株。用溶菌酶处理米尔贝吸水链霉菌获得原生质体，采用原生质体融合育种技术，通过摇瓶验证选育高产菌株。经大量筛选获得6株米尔贝霉素高产融合菌株，其中融合菌株M19046的发酵效价为6 433 μg/mL，比出发菌株M1834（4 600 μg/mL）、M18102（4 432 µg/mL）分别提高了39.8%和45.1%，并且遗传性状稳定。测试了米尔贝霉素高产菌的保藏方法、培养周期、培养方法等条件对其产量的影响。表明微生物原生质体融合育种技术在理论和实际生产中都具有重要意义。

Abstract

Using milbemycin producing strains S. milbemycinicus M1834 and M18102 as the original strains， 6 fusion strains with high⁃yield were selected after protoplast fusion and screening. The fusant M19046 was obtained with a high yield of 6 432 μg/mL， which was 39.8 % and 45.1 % higher than those of the original strain M1834 （4 600 μg/mL） and M18102（4 432 µg/mL）， and the fusant had the good genetic stability. Effects of different preservation methods， culture time， culture methods on fermentation production were studied. The results show that microbial protoplast fusion breeding technology has great significance in both theoretical research and practical production.

Graphical abstract

关键词

米尔贝霉素 / 原生质体融合 / 高产菌株

Key words

milbemycin / protoplast fusion / high yield strain

0 引 言

米尔贝霉素（milbemycin）是由日本Sankyo公司的青木等于1967年首次从吸水链霉菌金泪亚种（Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus）的发酵液中分离出来，是一种新型16元大环内酯的天然衍生混合物^［1，2］。大环内酯驱除剂的主要作用靶点是无脊椎动物中谷氨酸门控氯通道^［3，4］。1973年，青木筛选的米尔贝霉素菌株B⁃41⁃146的代谢物对农业害虫如蚜虫（aphids）、螨虫（mites）、毛虫（caterpillars）以及肠道蠕虫（intestinal warms）等寄生虫表现出广泛的活性^［5］。米尔贝霉素A3/A4是吸水链霉菌的自然发酵产物，因其活性高、毒性低、易降解被称为环境友好性的工业化农药^［6，7］。

早在20世纪70年代就已经报道了利用聚乙二醇（PEG）融合原生质体的技术，已成功地应用于真菌、酵母和细菌。原生质体融合后产生高频率的重组基因，在重要株系的表型改良中受到广泛关注。本论文主要是将具有高产特性但组分A3含量偏低的菌株M1834与组分A3含量较高但效价较低的菌株M18102为亲本菌株，利用原生质体融合选育技术获得米尔贝霉素高产、稳定、组分符合规定的菌株，为解决实际生产中存在发酵产量不高，组分A3含量偏低等问题提供了有效的解决办法，对于提高米尔贝霉素生产水平有重大意义。

1 材料与方法

1.1 出发菌株

米尔贝链霉菌（S. milbemycinicus）M1834（4 600 μg/mL，A3∶A4=25.8∶74.2）与M18102（4 432 μg/mL，A3∶A4=30.5∶69.5），由宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种室提供。

1.2 培养条件

本研究涉及的培养基及其培养条件如下^［8~10］：

高渗溶液PB：蔗糖103 g/L，MgCl₂·6H₂O 2.02 g/L，NaCl 3 g/L，再加入单独灭菌的KH₂PO₄（0.5%） 10 mL，CaCl₂·2H₂O（3.68%）100 mL，Tris Base （0.25 mol/L，pH 7.2） 100 mL，最后定容至1 L。

再生培养基：蔗糖103 g/L，葡萄糖10 g/L，聚蛋白胨2 g/L，酵母抽提粉4 g/L，MgCl₂·6H₂O 10.12 g/L，琼脂粉12 g/L，明胶6 g/L。加入单独灭菌的下列成分：0.5% KH₂PO₄ 10 mL，5 mol/L CaC1₂·2H₂O 20 mL，0.25 mol/L（pH 7.2）Tris Base 100 mL，最后定容至1 L。

斜面培养基：蔗糖2 g/L，麦芽抽提物1.5 g/L，脱脂奶粉0.8 g/L，酵母抽提物2 g/L，琼脂20 g/L。pH值为7.1~7.3。温度为（27±1） ℃，湿度40%~50%，周期6~7 d。

种子培养基：蔗糖5 g/L，酵母膏2.5 g/L，花生蛋白粉2 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，pH值7.1~7.3。温度为（28±1） ℃，摇床转速230 r/min，周期20~30 h。

发酵培养基：蔗糖15 g/L，黄豆饼粉8 g/L，棉籽蛋白粉8 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.03 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02 g/L，K₂HPO₄ 0.3 g/L，CuSO₄ 0.03 g/L，CaCO₃ 3.5 g/L。pH值为7.1~7.3，温度为（28±1） ℃，摇床转速230 r/min，周期8~10 d。

1.3 原生质体制备

收集菌体，分别取米尔贝霉素菌株M1834与M18102的斜面孢子接种到含甘氨酸0.6%的种子培养基中，27 ℃培养24 h，取指数生长期的菌悬液1 mL于无菌离心管中，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mL无菌蒸馏水洗涤三次。然后将其悬浮于1 mL的高渗缓冲溶液（PB）中^{［11，12］}。

酶解方式为：3 mg/mL溶菌酶溶液，所有处理均在30 ℃、150 r/min、黑暗条件下进行60 min，每个处理分别进行三次重复。酶解液在4 ℃、5 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mL PB液洗涤三次，最后悬浮于1 mL的PB液中备用。

1.4 原生质体的融合与再生

第一步，分别取菌株M1834与M18102的原生质体溶液0.5 mL于10 mL无菌离心管中，加入原生质体融合液1 mL（用PB液配制的42%PEG4000，过滤除菌），30 ℃水浴中保温5 min。

第二步，缓慢地加入1 mL原生质体清洗液PB液稀释后静置10 min，再加入2 mL原生质体清洗液，4 ℃、3 000 r/min离心10 min。第二步连续操作三次，沉淀用PB液稀释后涂于再生培养基上，27 ℃培养8~9 d^{［13，14］}。

1.5 融合菌株的筛选

挑取生长好的再生菌落，涂布在试管斜面上，27 ℃培养6~7 d，在相同培养条件下发酵摇瓶验证。

1.6 分析方法

1.6.1 菌体浓度的测定

取40 mL发酵液，3 000 r/min离心10 min，称重为菌体浓度。

1.6.2 HPLC检测方法

样品制备：用电子天平准确称取发酵液1 g，加入3 mL乙醇，超声清洗仪中加入0~10 ℃冷水，超声30 min。然后3 000 r/min离心10 min，取上清，过0.22 μm微孔有机滤膜后进样。

色谱条件：柱型4 mm×150 mm；流动相=V_乙腈∶V_水∶V_甲醇=350∶50∶100；流速0.8 mL/min；检测波长为242 nm；柱温为35 ℃。精密称取25 mg米尔贝霉素标准品（米尔贝霉素A3为38.9%，米尔贝霉素A4为59.8%），加少量的甲醇溶解后定容至50 mL容量瓶中^［15］。

1.7 高产突变菌株遗传稳定性的检测

米尔贝霉素高产菌株连续传四代培养，经发酵验证后，代间的数据越小表明其遗传性状越稳定。

2 结果与分析

2.1 融合菌株筛选

每天观察再生培养皿上的菌落生长情况，第一天肉眼看不到菌落生长的痕迹；第二天在稀释度大于10^-3的梯度有隐隐约约的菌落出现；第三天菌落明显可见，表面湿润光亮稍泛乳黄色；第四天菌落表面有较薄的白色菌层长出；第五天菌落表面白色菌层较明显；第六天白色菌层增多增厚，菌落直径也越大，表面有梅花型纹理出现；第七天白色菌层继续增厚，有4~8褶裙型，菌落中间有凸起的、有凹下的、有馒头型的、有圆柱型的；第八天后菌落表面有粉粒、白颗粒长出，说明菌体生长已近老化。在菌落生长到6~7 d挑取生长好的再生单菌落如颜色为白灰色，菌层为厚绒状，基质色素为黑绿色的梅型菌落涂布在试管斜面上，共挑取100株，菌株编号为M19001~M19100，（27±1） ℃培养6~7 d，在相同培养条件下发酵摇瓶验证，共筛选出效价高于6 000 µg/mL以上的菌株共6株，结果见图1。

由图1可见，获得的6株高产菌株，菌株号及效价分别为M19046（6 420 µg/mL）、M19086（6 411 µg/mL）、M19074（6 390 µg/mL）、M19027（6 377 µg/mL）、M19079（6 341 µg/mL）、M19075（6 215 µg/mL）。比原始菌株M1834（4 600 µg/mL）、M18102（4 432 µg/mL）分别提高了35.1%~39.6%、40.2%~44.9%。这只是米尔贝霉素总效价分析，还需对其两个组分A3、A4占总效价的比例继续分析评估。

2.2 米尔贝霉素组分A3、A4含量占总发酵单位的比较试验

米尔贝霉素以组分A3与A4混合物形式存在，是菌体发酵代谢过程中同时产生的。A3、A4的结构相似，仅C⁃25上的取代基不同，A3是甲基，A4是乙基。发酵液中的米尔贝霉素A3∶A4=（20±5）∶（80±5）的比例才能符合要求^{［16，17］}，结果见表1。

由表1可知，融合菌株M19046（A3∶A4=32.6∶67.4）、M19086（A3∶A4=32.3∶67.7）与M19074（A3∶A4=30.2∶69.8）比出发菌株M1834（A3∶A4=25.9∶74.2）中的A3比例提高到30%以上。所以融合处理不仅提高了发酵单位还解决组分A3比例偏低的问题。因此，我们选择上述3株菌继续进行发酵生长速率方面的验证评估。

2.3 高产融合菌株发酵产率比较试验

将高产融合菌株M19046、M19086、M19074的斜面菌体继续发酵摇瓶验证，每天检测发酵液浓度及发酵单位，从生长速率方面继续考察评估，结果见图2、图3。

由图2可知，各菌株发酵前三天发酵液菌体浓度从初始的约9%增长到34%~46%，4~8 d菌体浓度增长缓慢，9 d后趋于稳定，说明发酵液菌体的累积主要在前3 d。融合菌株的发酵菌体浓度生长速率明显高于对照菌株。其中融合株M19046增长最快。由图3可知，发酵1~3 d发酵单位增长慢，4 d后快速增长，8 d增长缓慢。融合菌株的发酵单位产率明显快于对照菌株，其中融合菌株M19046在第9 d的发酵单位达到6 433 µg/mL，比原始菌株M1834（4 600 µg/mL）、M18102（4 432 µg/mL）分别提高了39.8%、45.1%。所以，融合处理可以提高米尔贝霉素菌体的生长速率与发酵产量。

2.4 高产菌株遗传稳定性试验

在抗生素发酵生产实践中，上罐菌株不仅有较高的生产能力，还必须具有稳定的遗传性。将高产融合菌株M19046、M19086、M19074与M19027菌株的一代斜面连续传到第四代，发酵摇瓶验证各代斜面，查看高产菌株的遗传稳定率，实验结果见表2。

由表2可知，菌株M19046前三代产量稳定，到第四代稍有降低，在实际生产中用一代、二代斜面菌体均可，三代后的斜面可用于其他试验。菌株M19086前两代产量稳定，从第三代开始降低。菌株M19074与M19027斜面传代稳定性较差。比较后稳定性良好的菌株是M19046。

2.5 斜面菌体最适保藏方法确定

要维持高产菌株M19046的高产性状，必须注意控制影响其发酵单位的重要影响因子。基于斜面菌体不易保藏的特殊需求，共设置了四种保藏方法，分别为0~4 ℃冰箱保藏、15~25 ℃密封箱保藏、15~25 ℃保鲜袋保藏与25~28 ℃培养箱保藏。每种保藏方法保藏周期为5~50 d，斜面菌体外观变化情况描述如下：斜面菌体存放于0~4 ℃冰箱保藏，保存3 d后菌体容易吸水潮解；放于15~25 ℃密封箱菌体仍然缓慢生长；存于15~25 ℃保鲜袋菌体慢慢变成深灰色；存于25~28 ℃培养箱后斜面菌层又长出白色菌斑。各种保藏方法保藏至第5 d开始，第10 d后每隔10 d发酵摇瓶验证一次，查看不同保藏方法随着时间的延长对发酵单位的影响。实验结果见图4。

由图4可知，0~4 ℃冰箱保藏与25~28 ℃培养箱保藏这两种保藏方法仅仅保藏5 d后效价明显下降，从高产菌株M19046的初始效价6 420 μg/mL分别降到4 800 μg/mL、5 541 μg/mL，降低幅度分别为25.2%、13.7%，说明此两种保藏法不能用。15~25 ℃密封箱保藏5~30 d效价降低了0.1%~3.4%，保藏30 d后效价明显降低，所以最多可以保藏30 d。15~25 ℃保鲜袋保藏5~40 d效价降低了0.7%~8.4%，40 d后效价明显降低，可以保藏40 d。为了菌株的高产特性更好地用于生产实践，所以最适保藏法为15~25 ℃密封箱保藏法并且存放周期不得超过10 d。用15~25 ℃保鲜袋保藏法发酵效价下滑较缓慢，说明环境湿度对菌体生长有一定的影响，需继续查看湿度对菌株发酵单位影响。

2.6 斜面菌体培养湿度（RH）/培养周期/发酵单位之间的关系

斜面菌体分别放在RH为20%、30%、45%、55%的环境中培养，分别在第6、8、10、15、20和30 d记录斜面生长情况并发酵摇瓶验证。主要研究不同湿度下随着培养周期延长斜面菌体生长变化对发酵产量的影响。斜面外观变化见表3，验证结果见图5。在斜面培养周期为7天时，仅查看湿度对发酵单位的影响，试验结果见图6。

由表3可知，在不同湿度下，斜面培养6 d为白色厚绒菌层；8 d后菌层基本变灰，在湿度低的情况下斜面菌层逐渐有白色斑点长出，20 d后白斑很多成薄层。随着湿度的不断增大，白斑菌层会延迟长出，在湿度高时菌层越来越灰、越来越湿，有少量的白斑长出。结合图5的验证数据可知，若发现菌层有白斑菌时发酵单位就明显开始降低，一定的培养湿度可以延缓白斑的生长，从而维持了菌株的高产特性，但湿度过高斜面菌层湿度过大也会降低发酵单位。所以，培养湿度为45%，斜面在6~15 d内效价相对稳定。又对斜面培养周期为7 d时，单独验证分析湿度对发酵单位的影响，由图6可知，培养湿度为45%发酵效价最高，所以斜面的最适培养湿度为45%。

3 讨 论

本论文主要利用原生质体融合选育技术，共筛选出效价高于6 000 µg/mL以上的菌株6株，其中融合菌株M19046（A3∶A4=32.6∶67.4）、M19086（A3∶A4=32.3∶67.7）与M19074（A3∶A4=30.2∶69.8）比出发菌株M1834（A3∶A4=25.9∶74.2）中的A3比例提高到30%以上。所以融合处理不仅提高了发酵单位还解决组分A3比例偏低的问题。将高产融合菌株从发酵生长速率考察，融合菌株的发酵单位产率明显快于对照菌株，其中融合菌株M19046在第9 d的发酵单位达到6 433 µg/mL，比原始菌株M1834（4 600 µg/mL）、M18102（4 432 µg/mL）分别提高了39.8%、45.1%，并且遗传稳定性良好。对米尔贝霉素产生菌的培养条件进行研究确定其最适合保藏法为15~25 ℃密封箱保藏法并且存放周期不得超过10天。培养湿度为45%，斜面在6~15 d内效价相对稳定。

本文为解决实际生产中存在发酵产量不高，组分A3含量偏低等问题提供了有效的解决办法，并找出影响发酵单位的一些关键参数，如最适的保藏法、培养周期及培养湿度等。这些对于提高米尔贝霉素生产水平有重大意义。

原生质体融合技术可用于提高抗生素的产量^［18］。有学者利用原生质体融合技术获得一株耐酸和耐胆盐能力强的菌株La⁃F1^［19］。也有研究将米曲霉HL和L5进行原生质体融合，筛选得到一株融合株R6的中性蛋白酶，活力分别比2株亲本菌株提高25.6%和19.9%，酱醅氨基氮值也比亲本菌株提高8%和5.6%^［20］。综上所述，这些实验结果证实了原生质体融合育种确实是一种操作简便，高效的技术。在发酵行业用于高产菌株选育，对实际生产的产量提高具有重要意义。利用原生质体融合技术使亲本菌株基因组之间的交换可能会带来不同的基因组合，使米尔贝链霉菌的形态和产素能力在工业发酵中获得更好的匹配^［21］。筛选出的优良菌株M19046发酵摇瓶效价分别较之前的研究高出37.6%^［22］和58.1%^［10］。M19046有关基因方面的深入研究及工业化生产有待进一步考察。

参考文献

[1] Aoki A, Fukuda R, Nakayabu T, et al. Antibiotic substances b⁃41, their production and their use as insecticides and acaricides: US, 1976/3984564 [P]. 1976⁃10⁃05.

[2] Takiguchi Y, Mishima H, Okuda M, et al. Milbemycins, a new family of macrolide antibiotics: fermentation, isolation and physico⁃chemical properties [J]. J Antibiot, 1980, 33: 1120⁃1127.

[3] Shoop W L, Mrozik H, Fisher M H. Structure and activity of avermectins and milbemycins in animal health [J]. Veterinary Parasitology 1995, 59(2): 139⁃156.

[4] Mckellar Q A. Chemotherapy and delivery systems—helminths [J]. Veterinary Parasitology 1994, 54(2): 249⁃258.

[5] Ono M, Mishima H, Takiguchi Y, et al. Milbemycins, a new family of macrolide antibiotics: fermentation, isolation and physico⁃chemical properties and bioconversion of milbemycins J and K [J]. J Antibiot, 1983, 36: 509⁃515.

[6] Blackhall W J, Prichard R K, Beech R N. Selection at a γ⁃aminobutyric acid receptor gene in Haemonchus contortus resistant to avermectins/milbemycins [J]. Molecular & Biochemical Parasitology, 2003, 131(2): 137⁃145.

[7] Yamaguchi M, Sawa Y, Matsuda K, et al. Amino acid residues of both the extracellular and transmembrane domains influence binding of the antiparasitic agent milbemycin to Haemonchus contortus AVR⁃14B glutamate⁃gated chloride channels [J]. BBRC, 2012, 419(3): 562⁃566.

[8] 丁亚莲, 李春玲, 党红娟,等. 应用基因组重排技术提高泰乐菌素产量[J]. 中国抗生素杂志, 2017, 42(10): 902⁃909.

[9] Ding Y L, Li C L, Dang H J, et al. Enhanced production of tylosin fermentation by genome shuffling [J]. Chin J Antibiot, 2017, 42(10): 902⁃909.

[10] Baehman L R, Glatz B A. Protoplast production and regeneration in Propionibacterium [J]. Journal of Dairy ence, 1989, 72(11): 2877⁃2884.

[11] 张艳艳. milR在米尔贝霉素生物合成中的调控机制[D]. 北京: 中国农业科学院,2016.

[12] Zhang Y Y. Regulatory mechanisms of milR in mibemycin biosynthesis in Streptomyces bingchenggensis [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016.

[13] Kim K S, Ryu D D Y, Lee S Y. Application of protoplast fusion technique to genetic recombination of Micromonospora rosaria [J]. Enzyme Microb Technol, 1983, 5(4): 273⁃280.

[14] Mirdamadi⁃Tehrani J, Mitchell J I, Williams S T, et al. Genetic analysis of intraspecies recombinant formation by protoplast fusion with three species of Streptomyces [J]. FEMS Microbiology Letters, 2010, 36(2⁃3): 299⁃302.

[15] Chand P K, Davey M R, Power J B, et al. An improved procedure for protoplast fusion using polyethylene glycol [J]. Journal of Plant Physiology, 1988, 133(4): 480⁃485.

[16] Reymond P, Fevre M. Recombination following protoplast fusion of Penicillium strains used in the dairy industry [J]. Enzyme Microb Technol, 1986, 8(1): 41⁃44.

[17] Wang X J, Zhang B, Yan Y J, et al. Characterization and analysis of an industrial strain of Streptomyces bingchenggensis by genome sequencing and gene microarray [J]. Genome, 2013, 56(11): 677⁃689.

[18] 安稳定. 米尔贝肟中特定杂质的分离,鉴定与控制[D]. 杭州: 浙江大学, 2014.

[19] An W D. Separation, identification and control of specific impurities in milbemycin oxime [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

[20] 周丽. 米尔贝霉素单组分高产菌株选育及发酵放大研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2020.

[21] Zhou L. Study on the breeding of high⁃yield strain for single component and fermentation scale⁃up of milbemycin [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2020.

[22] 谭周进, 杨海君, 林曙, 等. 利用原生质体融合技术选育微生物菌种[J]. 核农学报, 2005, 19(1): 75⁃79.

[23] Tan Z J, Yang H J, Lin S, et al. Protoplast fusion technology and microbial breeding [J]. J Nucl Agric Sci, 2005, 19(1): 75⁃79.

[24] 王玉华,张桂荣,刘景圣.原生质体融合提高嗜酸乳杆菌耐酸及耐胆盐能力[J].食品科学,2006, 27(3): 96⁃99.

[25] Wang Y H, Zhang G R, Liu J S. Improvement study on acid and bile tolerance of Lactobacillus acidophilus protoplast fusion [J]. Food Sci, 2006, 27(3): 96⁃99.

[26] 武金霞, 赵睿, 张贺迎. 米曲霉种内原生质体融合选育优良菌株 [J]. 中国酿造, 2012, 31(2): 132⁃136.

[27] Wu J X, Zhao R, Zhang H Y. Breeding Aspergillus oryzae strain by intraspecific protoplast fusion [J]. China Brew, 2012, 31(2): 132⁃136.

[28] Badr⁃Elden A M, Nower A A, Nasr M, et al. Isolation and fusion of protoplasts in sugar beet (Beta vulgaris L.) [J]. Sugar Tech, 2010, 12(1): 53⁃58.

[29] 向文胜, 王海燕, 刘雨晴, 等.一种米尔贝霉素合成正调控基因kelR,编码蛋白,基因工程菌及其制备方法和应用, CN108753799A [P]. 2018.

[30] Xiang W S, Wang H Y, Liu Y Q, et al. A preparation method of positive regulatory gene kelR in milbemycin biosynthesis, protein encoding, genetically engineered bacteria and application, CN108753799A [P]. 2018.