三株抗多重耐药性金黄色葡萄球菌的放线菌分离筛选与鉴定

Isolation， screening and identification of three strains of actinomycetes resistant to multi drug resistance Staphylococcus aureus

摘要

为了筛选对人体常见病原菌具有显著抑菌活性的放线菌资源，本研究采用六种培养基（GA、CMKA、GW、MM、SCK、HV）对新疆乌鲁木齐南山地区土壤样本中放线菌资源进行分离、并选取8株临床标准致病菌株和1株分离自临床耐药金黄色葡萄球菌RS作为指示菌，通过平板对峙法进行抑菌活性放线菌的筛选，最后对具有显著抑菌活性的放线菌进行菌落形态观察和基于16S rRNA序列的系统进化树分析。在分离的109株放线菌中筛选得到3株（C2⁃4、D4⁃2和E1⁃2）均对多重耐药性金黄色葡萄球菌RS（对苯唑西林、四环素、红霉素及青霉素G均有耐药性）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有显著抑菌活性的放线菌菌株。系统进化树分析表明，放线菌C2⁃4和D4⁃2与拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）放线菌亲缘关系最近，放线菌E1⁃2与链霉属（Streptomyces）放线菌进化关系较近。抑菌活性放线菌C2⁃4、D4⁃2和E1⁃2的鉴定，将为其活性次级代谢产物的分离奠定了基础。

Abstract

To screen actinomycetes with antibacterial activity against common pathogenic bacteria in human body， six media were used for isolating of actinomycetes resources from soil samples of the Nanshan district of Xinjiang. Eight clinical standard pathogenic strains and one multidrug resistant Staphylococcus aureus which was isolated from clinical practice were used as indicators to screen antibacterial activity by plate confrontation assay. Finally， the colony morphology of strains with significant antibacterial activity was observed， and phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA sequence was carried out. Three antibacterial strains （C2⁃4， D4⁃2 and E1⁃2） were obtained from 109 isolates， which showed strong inhibition on the multidrug resistant Staphylococcus aureus （resistance to tetracycline and vancomycin）， staphylococcus epidermidisand Staphylococcus aureus. Phylogenetic tree analysis confirms that C2⁃4 and D4⁃2 strains have the closest relatives with Amycolatopsis strain， and E1⁃2 strain is closely related to Streptomyces strain. Identification of the C2⁃4， D4⁃2 and E1⁃2 will provide foundation for isolation of their active secondary metabolites.

Graphical abstract

关键词

放线菌 / 病原菌 / 抑菌活性 / 系统进化树

Key words

actinomycete / pathogen / antibacterial activity / phylogenetic tree

0 引 言

放线菌是一类分布广泛，应用价值极高的微生物，由于其在生长过程中能产生多种具有特殊结构及生物活性的次生代谢产物，因此在医药、工业、农业、食品及环保等方面有广阔的应用空间^［1~3］。放线菌产生的次生代谢产物是医药抗生素的重要来源，目前临床上使用的蒽环类、烯二炔类、醌类、大环内酯类等多种类别的抗生素大多数来自于放线菌^［4］。抗生素作为一种安全、高效治疗抗细菌和真菌性感染药物^［5］，被广泛应用在临床治疗上，然而随着抗生素等抑菌药物的频繁使用，病原菌的耐药性问题日益严重，严重威胁人类的健康^［6~8］。因此开发新型广谱高效的抗生素成为解决病原菌耐药性问题的重要手段之一。目前，从森林、草原、海洋、动植物体内以及极端环境中分离新型放线菌资源成为开发新型抗生素的重要来源^［9~14］。新疆乌鲁木齐南山地区具有良好的自然环境，植被丰富，其土壤中蕴含着丰富的微生物资源，本研究拟对新疆乌鲁木齐南山地区土壤中放线菌资源进行分离鉴定，并选取多个与人类疾病相关的病原菌，通过抑菌活性分析来筛选广谱高效抑菌的放线菌菌株，从而为新型抗生素的分离提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土壤样品

新疆乌鲁木齐南山地区87°22′E，43°25′N区环境采用“五点采样法”分别在不同的5个区域（见表1）采集土样共5份，用无菌保鲜袋装样并编号，干燥后备用。

1.1.2 本试验所用的指示菌

大肠杆菌（Escherichia coli） ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 29213、耐药性金黄色葡萄球菌RS（对苯唑西林、四环素、红霉素及青霉素G均有耐药性）、白色念球菌（Candida albicans） ATCC 10231、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa） CMCC 10104、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus） ATCC 49453、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）CMCC（B）26069、伤寒杆菌（Salmonella typhi）、副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi）和痢疾杆菌（Dysentery bacilli）均由新疆医科大学基础医学院形态中心微生物室提供。

1.1.3 分离及纯化培养基

① 高氏一号培养基（GA）：可溶性淀粉20 g（加热至溶解），KNO₃ 1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

② 酪蛋白甘露醇培养基（CMKA）：酪蛋白水解物0.5 g，甘露醇1.5 g，KNO₃ 1 g，（NH₄）₂SO₄ 2 g，K₂HPO₄ 0.5 g，CaCO₃ 0.5 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

③ 甘露醇⁃酸水解酪蛋白培养基（GW）：酪水解蛋白3 g，甘露醇0.3 g，NaHCO₃ 2 g，CaCO₃ 0.2 g，（NH₄）₂SO₄ 2 g，KNO₃ 2 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 2 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

④ MM培养基：葡萄糖0.5 g，酵母提取物0.5 g，K₂HPO₄ 0.3 g，NaCl 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，CaCO₃ 0.1 g， MnCl₂·4H₂O 0.02 g， ZnSO₄ 0.07 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

⑤ 淀粉酪蛋白培养基（SCK）：淀粉10 g，酪蛋白水解物0.3 g，NaCl 2 g，KNO₃ 2 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 2 g，CaCO₃ 0.02 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

⑥ 腐殖酸培养基（HV）：腐殖酸0.1 g，CaCO₃ 0.02 g，Na₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 1.7 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，核黄素0.5 g，硫胺素0.5 g，维生素B6 0.5 g，烟酸0.5 g，肌醇0.5 g，泛酸0.5 g，生物素0.25 g，对氨基苯甲酸0.5 g，琼脂18 g，加无菌水定容至1 L，pH 7.2~7.4。

⑦ 细菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（LB）；菌株保存培养基：GA培养基；拮抗实验培养基：LB培养基。

1.1.4 抑制剂

放线菌酮、荼啶酮酸、重铬酸钾均为分析纯。

1.1.5 试剂与仪器

高压灭菌锅（GR60DA，ZEALWAY），生物安全柜（THERMO 1300SERIS A2），恒温培养箱（DH5000BⅡ天津泰斯特），恒温震荡培养箱（金坛华峰，CHA⁃C），离心机（TGJ⁃16G上海安亭），PCR扩增仪（mycycler BIO⁃RAD），凝胶成像仪（Gel Doc EZ凝胶成像BIO⁃RAD），电泳仪（DYY6D，北京六一），电泳槽（DYCP⁃31F，北京六一）等；扩增引物、试剂和Taq酶等分子实验试剂购于博迈德生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤的采集

采用“五点采样法”从新疆乌鲁木齐南山地区采集土壤样本，即在每个采样地点选取5个不同位置进行取样，取样深度为地表以下10 cm，每个采样点取样50 g左右，然后将5个样混合装入一个保鲜袋中，并注明标号、日期和地点。

1.2.2 菌株的分离与保存

土壤样本经干燥及充分研磨后，称取10 g放入含100 mL无菌水的三角瓶中，振荡混匀后，采用梯度稀释法制成10^-2，10^-3，10^-4浓度的土壤悬液，200 r/min充分振荡40 min后，吸取各浓度的土壤悬液100 μL分别涂布到6种分离培养基上，每种分离培养基中均含放线菌酮（50 mg/L），荼啶酮酸（20 mg/L），重铬酸钾（100 mg/L），然后置于28 ℃恒温培养箱内培养15 d左右，挑取菌株形态不同的单菌落在GA培养基进行多次分离纯化培养，将纯化后的菌株接种到甘油管中，在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 病原菌株的培养

将实验室保存的病原菌株接种在LB培养基中，37 ℃培养24 h备用。

1.2.4 拮抗放线菌的筛选

采用平板对峙法，通过观察分离放线菌对9种指示菌生长是否有抑制作用来筛选拮抗放线菌。取少许培养好的指示菌，用无菌蒸馏水稀释，使细菌数量达到10⁸为止，用无菌棉签蘸取菌液，十字交叉法涂布到LB培养基上。将放线菌菌株接种到GA培养基上28 ℃培养3~7 d，然后用6 mm灭菌打孔器制成菌饼，用无菌的镊子夹取菌饼置于涂布有指示菌的平板上，放入恒温培养箱中，37 ℃培养12~16 h。用6 mm无菌琼脂块作阴性对照，每个处理分别做3个重复。通过测定菌饼周围抑菌圈的直径来评估其抗菌活性强弱。

1.2.5 拮抗放线菌菌落显微观察

采用插片法进行拮抗放线菌的菌落观察，将拮抗放线菌采用十字交叉划线法接种在GA培养基上，将已灭菌的盖玻片用无菌镊子倾斜45°插入培养基中（深度约占盖玻片长度的1/2），28 ℃培养3~7 d后取出插片，滴加瑞氏姬姆萨染液染色，滴加A液2滴，20 s后滴加B液4滴，充分混匀，经染色3 min后，用无菌水冲洗盖玻片上的多余染料，然后进行光学显微镜观察。

1.2.6 拮抗放线菌的DNA提取及16S rRNA制备、测序

采用SDS法提取放线菌基因组DNA，使用通用引物27F（5′⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3′）和1492R（5′⁃GGTTACCTTGTTACGACTT⁃3′）进行16S rRNA扩增，PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次，再72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化后，与pGM⁃T载体进行连接，并转入大肠杆菌DH5a中，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h左右，采用蓝白斑筛选法，挑取白色单克隆菌落到LB培养基上，37 ℃、200 r/min培养16 h后，吸取少量菌液，通过菌落PCR筛选阳性单克隆，然后将阳性单克隆送华大基因公司测序。

1.2.7 16S rRNA基因序列分析及系统进化树构建

测序结果经NCBI数据库进行16S rRNA基因序列比对分析后，采用MEGA7.0软件中的邻接法对放线菌的16S rRNA基因序列绘制系统进化树分析。

2 结果与分析

2.1 土壤中放线菌菌株的分离结果

采用含放线菌酮，荼啶酮酸，重铬酸钾的6种分离培养基共分离得到了109株放线菌菌株。在这6种分离培养基中，CMKA培养基分离得到的放线菌菌株最多，共52株，分离率达到47.71%，其余5种培养基分离率均低于15%，其中HV培养基的分离率最低，仅5.5%（见表2）。

2.2 分离放线菌的抗菌活性筛选

经过平板对峙法筛选，获得3株（C2⁃4、D4⁃2、E1⁃2）均对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌及耐药性金黄色葡萄球菌有显著抗菌活性的放线菌（见表3），但对大肠杆菌、白色念球菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾等病原菌均无抗菌活性。这3株拮抗放线菌对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在15 mm以上，其中D4⁃2菌株对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径为18 mm（见表3）。

2.3 菌株的菌落形态及菌丝显微观察

上述3株拮抗放线菌在GA培养基上生长状态良好，其菌落表面干燥、多褶皱，属于典型的放线菌菌落形态。其中D4⁃2菌株菌落呈白色，表面干燥，不易被挑取，菌落显微观察发现菌丝多，孢子丝和孢子较少。C2⁃4菌株的菌落刚开始呈白色，生长后期呈灰白色，菌落疏松，易被挑取，在显微观察中发现大量菌丝、孢子丝及孢子。E1⁃2菌株菌落呈粉红色，菌落疏松，易被挑起，在显微镜下观察到较多的菌丝、孢子丝及孢子。

2.4 活性放线菌的系统进化树分析

放线菌C2⁃4、D4⁃2和E1⁃2的16S rRNA序列（1 477 bp、1 472 bp 和1 487 bp）经测序及序列分析后，提交到NCBI的GeneBank数据库中，其登录号分别为OK083707、OK083708和OK083709。放线菌C2⁃4和D4⁃2在进化关系上较为接近，均聚类在拟无枝酸菌属（Amycolatopsis），两者与苍黄拟无枝酸菌（Amycolatopsis lurida）IMSNU 20057菌株的16S rRNA序列同源性最高，分别为98.97%和99.04%。放线菌E1⁃2与链霉属聚类在一个分支上，其与加利利链霉菌（Streptomyces galilaeus）NBRC 13199菌株的16S rRNA序列同源性最高，为99.45%，见图1。

3 讨 论

由于实验室培养放线菌无法做到完全模拟土壤的自然环境条件，某些放线菌受培养条件的限制，不能正常生长而出现休眠状态^［15］，因此为了最大限度地分离土壤样本中的放线菌资源，选择合适的分离培养基就显得尤为重要。本研究同时采用GA、CMKA、GW、MM、SCK、HV六种培养基对土壤样本进行放线菌菌株的分离，共分离得到109株菌株，其中CMKA培养基出菌率最高，HV培养基出菌率最低，这表明CMKA培养基的营养条件更适合放线菌的生长。

对三株活性放线菌进行系统进化树分析发现，放线菌C2⁃4和D4⁃2与拟无枝酸菌属聚类在一个分支上，这表明放线菌C2⁃4和D4⁃2可能属于拟无枝酸菌属放线菌。拟无枝酸菌属放线菌是一类非运动性的、分枝菌丝丰富的、好氧且不耐酸的革兰氏阳性丝状真菌。目前已从该属放线菌中分离出大量极具应用价值的抗生素、活性酶及酶抑制剂^［16~18］。放线菌D4⁃2对多重耐药性的金黄色葡萄球菌RS具有显著抑菌活性，预示其可能含有新型抑菌活性物质，具有潜在的研究价值。放线菌E1⁃2与链霉属的加利利链霉菌亲缘关系最近，链霉属放线菌在土壤中分布极其广泛，易在人工培养基上生长，常产生水溶性或脂溶性色素，一般对革兰氏阳性菌有较好的抗菌活性，但对革兰氏阴性菌不敏感，由于链霉属成员能产生链霉素、卡那霉素等多种抗生素及抗肿瘤细胞化合物而成为国内外研究的热点^{［19，20］}。总之，放线菌C2⁃4、D4⁃2和E1⁃2的系统进化树分析不仅有助于明确其进化关系，而且为这些菌株的后续研究指明了方向。

本研究通过对乌鲁木齐南山地区土壤中放线菌资源的分离鉴定，并选取9种常见的危害人体健康的耐药型病原菌作为指示菌，从中筛选得到三株对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌和耐药性金黄色葡萄球菌具有抗菌活性的放线菌，尤其是放线菌D4⁃2对多重耐药性的金黄色葡萄球菌RS（对苯唑西林、四环素、红霉素及青霉素G均有耐药性）具有抗菌活性。在后续的研究中，将更多的在医学和农业上的病原菌作为指示菌，对分离的放线菌资源进行抗菌活性的筛选，期望从中获得对其他病原菌有抗菌活性的放线菌资源，为后续的活性次级代谢产物和新型抗生素的分离奠定了基础。

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基金资助

2022年度新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01C182)

陕西省教育厅2021年度一般专项科研计划项目(21JK0639)