油樟叶中黄酮类物质抑菌效果研究

Study on antimicrobial effect of flavonoids in Cinnamomum longipaniculatum camphor leaves

摘要

探究从油樟（Cinnamomum longipaniculatum）叶中提取出的不同极性黄酮样品对大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺杆菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和黄曲霉菌（Aspergillus flavus）五种病原菌的抑制作用。以五种病原菌为指示菌，将不同的黄酮样品滴加在滤纸片上，观察抑菌圈的大小。结果显示，样品Fr1、Fr2、Fr3、Fr4和Fr7对大肠杆菌有抑菌作用；样品Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr7和Fr8对志贺杆菌有抑菌作用；样品Fr4和Fr8对金黄色葡萄球菌有抑菌作用；样品过孔和Fr4对黄曲霉菌有抑菌作用；样品过孔对稻瘟病菌有抑菌作用。故不同极性的黄酮样品有良好的抑菌性。

Abstract

The inhibitory effects of flavonoid samples with different polarity extracted from Cinnamomum longipaniculatum camphor leaves on Escherichia coli， Shigella， Staphylococcus aureus， Magnaporthe grisea， and Aspergillus flavus were explored. Five kinds of pathogens were used as indicators and different samples of flavonoids were dropped onto filter paper to observe the size of inhibition zone. The results show that samples Fr1， Fr2， Fr3， Fr4 and Fr7 have inhibitory effect on Escherichia coli； samples Fr2， Fr3， Fr4， Fr5， Fr7 and Fr8 have inhibitory effect on Shigella； samples Fr4 and Fr8 have inhibitory effect on Staphylococcus aureus； samples Guokong and Fr4 have inhibitory effect on Aspergillus flavus； sample Guokong has inhibitory effect on Magnaporthe grisea. Therefore， flavonoid samples with different polarities have good antimicrobial activity.

Graphical abstract

关键词

油樟叶 / 黄酮类 / 抑菌作用

Key words

Cinnamomum longipaniculatum camphor leaf / flavonoid / antimicrobial effect

0 引 言

油樟（Cinnamomum longipaniculatum）是樟科（Lauraceae Juss.）樟属（Cinnamomum Schaeff.）常绿乔木，主要分布于中国四川省宜宾市，喜温暖湿润的气候。油樟本身可以作为木材，具有耐腐防蛀的特点；油樟的枝、叶、干、皮等部位能提取出芳香油，尤其是叶子含油率最高，被广泛用于食品、化工、香料、国防工业，具有很高的应用价值^［1］。提取过芳香油的脱油油樟叶中含有很多种类的化学物质，包括有机酸、酚、黄酮、挥发油、多糖等物质，其中总黄酮的含量较高，为21.2 mg/g。因此，脱油油樟叶中最容易利用的资源就是黄酮^［2，3］。黄酮类化合物是植物的次级代谢产物，广泛存在于植物当中，主要以游离态或者是与糖结合为苷的形式存在，种类繁多，结构类型复杂，表现出多种多样的生理活性，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗肿瘤等作用^［4］。其中，抑菌活性是黄酮类化合物重要的生理作用。其抑菌范围广泛，对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）等多种菌有一定的抑制效果。因其具有较高的抑菌活性，现已被用于抑菌治疗，并具有替代部分抗生素的能力^［5］。

本课题组基于前期研究所获油樟叶提取物样本，基于对峙平板实验探究不同组分的黄酮样品对大肠杆菌、志贺杆菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和黄曲霉菌（Aspergillus flavus）五种病原菌的抑菌作用，从而更有针对性和高效性地探究油樟叶黄酮的抑菌效果机理。为后续进一步研究其抑菌机制、研发新型食品防腐剂、研究抑菌药物等提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 实验材料与试剂

本实验所用菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌、志贺杆菌和稻瘟病菌。

实验样品编号为初黄、过孔、Fr1~8。油樟叶购自四川宜宾，样品是由北京城市学院梁寒峭老师提供。其中初黄是指初始黄酮，是通过超声法直接从脱油油樟叶中所提取的黄酮组分；过孔指的是将初黄样品经大孔树脂过滤层析所得；Fr1~Fr8是将初始黄酮样品经聚酰胺树脂法分瓶收集、分瓶浓缩，并经聚酰胺薄膜层析将瓶中含有的相同或相似的黄酮化合物组分合并，并分别编号Fr1~Fr8，在通风橱中风干所得。主要试剂见表1。

1.2 主要仪器与设备

精密恒温培养箱（厂商：天津市泰斯特仪器有限公司；型号：SPX⁃70BIII）。

2 方 法

2.1 样品溶解

分别加入1 mL无水乙醇于各类油樟提取物中，震荡摇匀，作为原液，分别标记为：初黄、过孔、Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7和Fr8。以只加入1 mL无水乙醇样品作为对照。准备30只1.5 mL离心管，分为三组，分别加入800 μL、900 μL和950 μL无菌水，从上述实验组原液和对照组原液中分别取出200 μL、100 μL和50 μL制作5倍稀释液、10倍稀释液和20倍稀释液，做好标记。

2.2 菌种培养

2.2.1 细菌的培养

配制30 mL LB液体培养基。灭菌后，将30 mL液体培养基分装在3个10 mL离心管中，取少量的志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌于离心管中震荡摇匀，做好标记后置于37 ℃恒温摇床中培养24 h。

2.2.2 真菌的培养

配制100 mL PDA培养基。将PDA培养基倒平板并标记培养基类型和日期。PDA培养基凝固后，用三点法接种真菌，每组两个平行，做好标记后置于28 ℃恒温培养箱中培养72 h。分别将已经生长的黄曲霉菌，稻瘟病原菌菌丝挑取到带有玻璃珠和无菌水的灭菌锥形瓶中，摇床震荡30 min，制作真菌孢子悬液。

2.3 病原微生物的对峙平板实验

配制3个400 mL LB琼脂培养基和2个400 mL的PDA培养基。灭菌后，待培养基冷却至50 ℃左右，分别将10 mL志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌加入到400 mL LB琼脂培养基中，摇匀后倒平板，并做好标记。向400 mL PDA培养基中加入摇匀的真菌孢子悬液1 mL，摇匀后倒平板。凝固后，用镊子将四个滤纸圆片分别放入培养基中。

实验组分别向四个滤纸片上滴加5 μL的油樟提取物原液，5倍稀释液，10倍稀释液和20倍稀释液，每组两个平行。对照组分别加入无水乙醇原液，无水乙醇5倍稀释液，无水乙醇10倍稀释液，无水乙醇20倍稀释液5 μL。将细菌置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，真菌置于28 ℃恒温培养箱中培养72 h。

2.4 平板对峙实验的定量分析

根据培养出的对峙平板实验结果，量取对照组和实验组各样品稀释浓度梯度抑菌圈的大小，按照下面公式计算出其抑菌效率：

\mathrm{抑菌}\mathrm{效率}(\mathrm{\%})=\frac{R\mathrm{1}-R\mathrm{2}}{R\mathrm{1}}×100%

其中：R1为实验组各样品稀释浓度梯度抑菌圈的大小；R2为对照组各稀释浓度梯度抑菌圈大小^［6，7］。

3 结果与分析

3.1 大肠杆菌实验结果

在Fr1样品中，10倍稀释液的抑菌圈最大，抑菌作用较为明显；相比于10倍稀释液的抑菌圈，5倍稀释液的抑菌圈较小，抑菌作用较小；两组试验相比较而言，原液与20倍稀释液抑菌圈与对照组抑菌圈类似，没有较好的抑菌效果。Fr2样品中，5倍稀释液的抑菌圈最大，其抑制作用最强，相比于5倍稀释液的抑菌圈，原液、10倍稀释液和20倍稀释液与对照组类似，没有明显的抑菌圈，没有抑制效果。Fr3样品中，5倍稀释液的抑菌圈最大，其抑菌效果最好；原液、10倍稀释液和20倍稀释液的抑菌圈与5倍稀释液相比，其抑菌圈与对照组类似，抑菌效果较差。Fr4样品的原液抑菌圈较为明显，其抑菌效果最强，与原液的抑菌圈相比，5倍稀释液的抑菌圈较小，其抑菌效果不明显，10、20倍样品稀释液抑菌圈与对照组抑菌圈类似，几乎无抑菌效果。Fr7样品中的5倍稀释液有较明显的抑菌作用，与5倍稀释液的抑菌圈相比，原液、10倍稀释液和20倍稀释液抑菌圈与对照组类似，没有抑菌作用。除上述样品外，样品初黄、过孔、Fr5、Fr6、Fr8的抑菌圈与对照组类似，没有明显的抑菌圈，即都没有抑菌作用。结果如图1所示。量取有抑菌作用的稀释梯度样品的抑菌环大小，并按照上述公式计算出其关于大肠杆菌的抑菌效率，结果如表2所示。

综上，对大肠杆菌，Fr1的10倍稀释液、Fr2的5倍稀释液，Fr3的5倍稀释液，Fr4的原液和Fr7的5倍稀释液都有较明显的抑菌作用。

3.2 志贺杆菌实验结果

Fr2样品中的原液相比较其他稀释样品，有明显的抑菌圈，抑菌效果明显；5、10、20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌作用。Fr3样品中的原液的抑菌圈最大，抑菌效果最好，5、10、20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌圈，没有抑菌效果；Fr5样品中，原液的抑菌圈最明显，抑菌效果最好；5、10、20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即几乎没有抑菌作用。Fr7样品的原液有明显的抑菌圈，抑菌效果最好；5、10、20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌作用。Fr8样品的原液的抑菌圈相比于其他样品稀释液，有明显的抑菌圈，有明显的抑菌效果，5、10、20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌作用。Fr4样品的原液有抑菌圈，但相对较小，抑菌效果较小；其稀释样品的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即无抑菌圈，无抑菌效果。除上述样品外，样品初黄、过孔、Fr1和Fr6各个稀释梯度的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，没有明显的抑菌圈，即都没有抑菌作用。结果如图2所示。量取有抑菌作用的稀释梯度样品的抑菌环大小，并按照上述公式计算出其关于志贺杆菌的抑菌效率，结果如表3所示。

综上所述，对志贺杆菌，Fr2的原液、Fr3的原液、Fr5的原液、Fr7的原液和Fr8的原液有明显的抑菌作用；Fr4原液有轻微的抑制作用。

3.3 金黄色葡萄球菌实验结果

在Fr8样品中，原液和5倍稀释液均有抑菌效果，其原液的抑菌圈最大，抑菌效果最强，5倍稀释液的抑菌圈相比于原液的抑菌圈来说较小，抑菌效果较小，10倍和20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即几乎没有抑菌圈，没有抑菌效果。Fr4样品中，原液有较为明显的抑菌圈，且比其余稀释样品要大得多，其抑菌的能力较强；5、10倍样品稀释液的抑菌效果较弱，抑菌圈很小，且10倍稀释样品最小，20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌圈，没有抑菌效果。除上述样品外，样品初黄、过孔、Fr1、Fr2、Fr3、Fr5、Fr6和Fr7各个稀释梯度的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，没有明显的抑菌圈，即都没有抑菌作用。结果如图3所示。量取有抑菌作用的稀释梯度样品的抑菌环大小，并按照上述公式计算出其关于金黄色葡萄球菌的抑菌效率，结果如表4所示。

综上，对金黄色葡萄球菌，Fr8和Fr4中原液有明显的的抑菌作用，并且随样品稀释倍数的增加而减少

3.4 黄曲霉菌实验结果

过孔样品的原液和5倍稀释液相比于10倍和20倍的样品稀释液有较强的抑菌作用，其中5倍稀释液的抑制作用最强，其抑菌圈最大，原液的抑制圈相比于5倍的样品稀释液较小，抑制作用稍弱，10倍和20倍稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即抑菌圈几乎没有，没有抑菌作用。Fr4样品中原液的抑菌圈较小，有轻微的抑制作用；相比于原液，5倍、10倍和20倍样品稀释液的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，即没有抑菌圈，其没有抑制作用。除上述样品外，样品初黄、Fr1、Fr2、Fr3、Fr5、Fr6、Fr7和Fr8各个稀释梯度的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，没有明显的抑菌圈，即都没有抑菌作用。结果如图4所示。量取有抑菌作用的稀释梯度样品的抑菌环大小，并按照上述公式计算出其关于黄曲霉菌的抑菌效率，结果如表5所示。

综上，对黄曲霉菌，过孔的原液和5倍的稀释液有明显的抑菌作用，Fr4的原液有轻微抑制作用。

3.5 稻瘟病菌实验结果

初黄原液、5倍、10倍和20倍稀释液都有明显的抑菌圈，且由两个实验组比较来说，其四种样品稀释液的抑菌圈大小基本相同，即抑菌作用大致相同。除上述样品外，样品过孔、Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7和Fr8各个稀释梯度的抑菌圈与对照组抑菌圈类似，没有明显的抑菌圈，即都没有抑菌作用。结果如图5所示。量取有抑菌作用的稀释梯度样品的抑菌环大小，并按照上述公式计算出其关于稻瘟病原菌的抑菌效率，结果如表6所示。

综上，对稻瘟病菌，初黄样品及其稀释液对其都具有强烈的抑制作用。

3.6 分析讨论

油樟叶提取物对大肠杆菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌和稻瘟病菌都有一定的抑制作用。其中，对大肠杆菌有抑菌作用的有样品Fr1的10倍稀释液、Fr2的5倍稀释液、Fr3的5倍稀释液、Fr4的原液和Fr7的5倍稀释液；对志贺杆菌有抑菌作用的有样品Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr7和Fr8的原液；对金黄色葡萄球菌有抑菌作用的有样品Fr4和Fr8的原液，且抑制程度随浓度的减小而减小；对黄曲霉菌有抑菌作用的有过孔原液及其5倍稀释液，样品Fr4的原液对其有轻微的抑制作用；对稻瘟病菌有抑菌作用的样品有过孔原液及其5倍稀释液、10倍稀释液和20倍稀释液，且这四种稀释梯度对稻瘟病菌的抑制程度基本相同。

4 结 论

黄酮是一类广泛存在于多种植物体内的化合物，其提取方法主要是复合酶提取结合超声波辅助提取技术和大孔树脂纯化工艺。有学者通过复合酶提取技术和超声波辅助提取技术相结合的方法提取出金桔叶中的总黄酮，在单因素实验的基础上，采用Box⁃Behnken响应面法建立总黄酮提取方程，得到最佳提取条件，并对提取出的黄酮进行体外抗氧化性实验^［8］。采用静态吸附与解析的方法，优化提取条件，从六种大孔树脂中选出最适宜的来提取柞树叶中较高纯度的总黄酮并分析其抗氧化活性^［9］。采用超声波辅助乙醇⁃水溶液浸提法提取出百色红茶中的总黄酮，在单因素实验的基础上，采用Box⁃Behnken响应面法优化总黄酮的提取工艺，得到最优工艺条件，同时初步对提取出的总黄酮进行理化性质的探究^［10］。通过超声辅助循环提取工艺对秋葵中的黄酮进行提取并优化其方法，同时探究了不同理化条件下对秋葵黄酮物质稳定性的影响^［11］。通过酶法预处理结合超声波辅助提取花生壳中的总黄酮，探究了该方法的最优条件并提高了总黄酮的得率，并优化了大孔树脂纯化工艺，提高了总黄酮的纯度^［12］。本实验所使用的样品是在超声波法和大孔树脂纯化法提取的基础上，通过聚酰胺树脂法和聚酰胺薄层色谱法进一步分离，简化样品成分，有利于在后续研究中快速高效地寻找和利用脱油油樟叶中的抑菌物质。

黄酮类化合物还具有消炎抗菌、降血糖、抗辐射、抗癌、抗氧化、抗肿瘤等生理生化的活性作用^［4］。通过沙棘黄酮对动脉粥样硬化斑块小鼠进行灌胃，对照组给予等量的生理盐水，得出沙棘黄酮能够降低动脉粥样硬化斑块小鼠的血脂，减轻动脉损伤，调节T淋巴细胞的亚群分布，进而保护血管，为人类动脉粥样硬化疾病提供新的解决思路^［13］。通过研究发现黄酮能够影响肠道微生物的生长，缓解肠道微生物紊乱，降低有害细菌中转运蛋白的表达，并且能够改变有害细菌的生理结构，有效抑制有害肠道微生物的生长，对人类健康提供巨大的贡献，同时为食疗提供了希望^［14］。通过牡丹花总黄酮像大鼠高尿酸血症模型注射，得出牡丹花总黄酮能够降低高尿酸血症模型大鼠血清中尿酸的水平，促进尿酸排泄，抑制氧化反应，抑制尿酸合成关键酶的活性，调节尿酸转运蛋白的表达，同时其抗氧化作用也对大鼠肾脏有一定的保护作用，初步验证了牡丹花总黄酮对高尿酸血症小鼠的药效机制，为今后非药用部位的开发和利用提供有效数据支撑^［15］。通过设置野菊花总黄酮浓度梯度，对乳腺癌细胞进行培养，得到野菊花总黄酮能够抑制细胞的增殖，迁徙和侵袭，诱导细胞凋亡，影响细胞周期，促进细胞凋亡相关基因的表达，其抑制作用具有多环节、多靶点等特点，能够有效抑制乳腺癌细胞的转移侵袭，进一步研究的同时为乳腺癌乃至其他癌症的治疗提供新的思路和方法^［16］。向对类风湿关节炎大鼠模型注射禹州漏芦总黄酮，结果表明能够减轻小鼠类风湿关节炎的严重程度，其机制可能是与促进类风湿关节炎大鼠成纤维滑膜细胞凋亡基因的表达，抑制其异常增殖有关，该研究有效推动了禹州漏芦总黄酮进入人类类风湿关节炎临床研究的阶段，为该疾病提供新的防治思路和方法^［17］。由此可见，黄酮类化合物的应用潜力巨大，尤其是在生物治疗方面，进一步研究该类化合物对于人类健康来说有着至关重要的意义。

目前国内对脱油油樟叶的抑菌作用鲜有报道。通过用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对脱油油樟叶的95%乙醇浸膏进行萃取分离，探究不同有机溶剂萃取相对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用，发现石油醚萃取相对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对其他两株菌没有明显活性^［18］；乙酸乙酯萃取相对沙门氏菌抑制作用最强，其次为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；正丁醇萃取相对大肠杆菌的抑制效果最好，对其他两株菌的抑制效果相似。同时乙酸乙酯的萃取相和正丁醇的萃取相的最低杀菌浓度和最小抑菌浓度最低，表明脱油油樟叶中的抑菌成分主要分布在乙酸乙酯和正丁醇这两相中，为今后抑菌活性的追踪奠定基础。而本实验使用四种方法：超声波法、大孔树脂纯化法、聚酰胺树脂法和聚酰胺薄层色谱法进一步分离脱油油樟叶中的黄酮成分，通过平板对峙实验，验证黄酮样品对大肠杆菌、志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、稻瘟病菌和黄曲霉菌五种病原菌的抑制作用，从而有针对性地区分并验证脱油油樟叶中对上述五种菌有抑制作用的黄酮化合物。为今后合理高效利用油樟资源，进一步研究脱油油樟叶提取物的抑菌物质提供实验证明。

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基金资助

四川省科技计划项目(2019YFSY0001)

四川省油樟工程技术研究中心（香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室）(21YZY01)

第22期北京青少年科技后备人才早期培养计划项目