霉酚酸高产菌株短密青霉菌SA⁃2的选育

Screening of Penicillium brevicompactum SA⁃2 with high yield of mycophenolic acid

摘要

为选育出霉酚酸（mycophenolic acid， MPA）发酵生产的优良菌株，以产霉酚酸的短密青霉菌（Penicillium brevicompactum）S⁃225菌株作为原始菌株，利用甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate， EMS）、紫外诱变（ultraviolet， UV）和常压室温等离子体诱变（atmospheric room temperature plasma， ARTP）叠加诱变的方法，选育出1株遗传稳定、且对Cu²⁺耐受性强的菌株SA⁃2，其10 t中试霉酚酸发酵效价达到8 458 mg/L，比原始菌株提高了137.3%，且其200 t发酵生产效价达到了8 769 mg/L。该研究结果对霉酚酸工业化发酵生产具有重要意义。

Abstract

In order to select a good strain for mycophenolic acid fermentation， Penicillium brevicompactum S⁃225 strain producing mycophenolic acid was used as the original strain， and treated by superimposed mutagenesis of ethyl methanesulfonate （EMS）， ultraviolet （UV） and atmospheric room temperature plasma （ARTP）. After mutagenesis， SA⁃2 strain with good genetic stability and high Cu²⁺ tolerance was screened out. Its mycophenolic acid fermentation potency was up to 8458 mg/L， which was 137.3% higher than that of the original strain. The results are of great significance to the industrial fermentation of mycophenolic acid.

Graphical abstract

关键词

霉酚酸 / 高产菌株 / 诱变 / 选育

Key words

mycophenolic acid / high yield strain / mutagenesis / screening

0 引 言

霉酚酸（mycophenolic acid， MPA）又名麦可酚酸（E⁃4⁃甲基⁃6⁃（1，3⁃二氢⁃7⁃甲基⁃4⁃羟基⁃6⁃甲氧基⁃3⁃氧代⁃5⁃异苯并呋喃基）⁃4⁃己烯酸），其分子式为C₁₇H₂₀O₆。霉酚酸及其衍生物霉酚酸酯（mycophenolate mofetil， MMF）具有抗真菌、抗肿瘤、抑制免疫反应等诸多功效，在疫病防治、免疫性疾病治疗等方面应用较为广泛，生产前景广阔^［1~4］。霉酚酸最早发现于灰绿青霉（Penicillium glaucum）的培养物中，随后在其他青霉菌如短密青霉（Penicillium brevicompactum）、匍枝青霉（Penicillium stoloniferum）、娄地青霉（Penicillium roqueforti）和鲜绿青霉（Penicillium viridicatum）等中也有发现，而目前霉酚酸主要通过短密青霉发酵进行生产^［5，6］。但是，霉酚酸发酵生产中普遍存在产率不高、质量不稳等问题，主要原因在于缺少优良的发酵菌株。因此，优良菌株选育是解决上述问题的根本途径。有研究通过紫外（ultraviolet， UV）和亚硝基胍（nitrosoguanidine， NTG）诱变，选育出一株效价为4 500 mg/L的短密青霉MA⁃H8^［7］。有学者运用离子注入技术、UV诱变、复合诱变开展霉酚酸发酵生产菌株的选育，使菌株发酵效价达到6 000 mg/L^［8，9］。但是，目前国内霉酚酸发酵生产水平较发达国家普遍超过10 000 mg/L的发酵效价，还存在一定差距^{［5，10，11］}。其中，可能的主要原因在于缺乏利用复合或者叠加诱变手段对霉酚酸发酵菌株进行系统的选育。鉴于此，本研究以产霉酚酸的短密青霉菌S⁃225菌株作为原始菌株，利用甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate， EMS）、紫外以及常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma， ARTP）叠加诱变的方法，对菌株进行诱变处理，选育出优良发酵菌株，以期提高发酵水平，推动霉酚酸规模化发酵生产。

1 材料

1.1 主要实验材料与试剂

原始菌株为本实验室低温保藏的产霉酚酸的短密青霉菌S⁃225菌株。MPA对照品购自Sigma公司，其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器

恒温振荡摇床（武汉科学仪器厂，编号：HQL150C）、恒温恒湿培养箱（江苏杰瑞尔电器有限公司，LHP160）、ARTP等离子体生物育种机（北京思清源生物科技有限公司，ARTP⁃Ⅱ型），紫外分光光度计（德国耶拿，SPECORD S600）、高效液相色谱仪（Waters公司，E2695）、显微镜（Leica DM500）。

1.3 培养基及培养条件

斜面和分离培养基：葡萄糖5 g/L，麦芽提取物1 g/L，酵母提取物1 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.0，26 ℃培养10 d。种瓶培养基：淀粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，氯化钠2 g/L，碳酸钙2 g/L，pH 7.0。斜面培养基挖块约1 cm³，接种于种子培养基中（250 mL容积的锥形瓶装量40 mL），置于26 ℃摇床，220 r/min，振荡培养26 h。发酵瓶培养基（m/V）：黄豆饼粉3%，玉米浆3%，葡萄糖6%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.1%，碳酸钙0.4%，pH自然，接种量8%（500 mL容积的锥形瓶装量80 mL），26 ℃ 220 r/min振荡培养。中试（10 t）培养基：淀粉20 g/L，蔗糖53 g/L，玉米浆98 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸铵4 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化钙2 g/L，碳酸钙0.5 g/L，pH自然，培养温度26 ℃，培养湿度36%，培养时间7 d。生产发酵（200 t）培养基：与中试一致。

2 方法

2.1 孢子液的制备

取成熟斜面孢子，用4.5 mL无菌水冲洗，将冲洗的孢子液用研磨器研磨，然后将菌液用滤纸过滤，离心管收集滤液，稀释至1×10^-6浓度备用。

2.2 甲基磺酸乙酯（EMS）诱变

取一定量的孢子液于无菌三角瓶中，加入EMS（终浓度为0.2%），放在摇床上振荡培养，诱变处理时间分别为1、2、3、4、5 h，然后将孢子液均匀涂布于分离培养基上，以未经EMS处理的孢子液作为对照，于26 ℃培养箱培养10 d。

2.3 紫外线（UV）诱变

取2 mL制备好的孢子液放入置有圆形磁片的培养皿中（直径为9 cm），打开预热15 W紫外灯（波长253.7 nm）30 min，将紫外灯管置于培养皿垂直高度35 cm处，然后打开皿盖，分别采用照射0（对照）、20、40、60、80 s进行处理，盖上皿盖，诱变处理过程在黑暗条件下进行。诱变结束后，再将培养皿在黑暗处条件下放置2 h，然后吸取孢子液，均匀涂布于分离培养基上，于26 ℃培养箱中培养10 d，统计致死率。

2.4 常压室温等离子体（ARTP）诱变

ARTP的工作气体为纯度为99.99%的氦气，处理功率为80 W，等离子体发生器待处理样品与出口之间的距离为4 mm，气体的流量为9.0 L/min。将准备好的50 μL孢子液均匀涂于载片上，然后进行照射，照射的时间分别为0（对照）、50、100、150、200 s，用50 μL无菌水冲洗，将照射后的菌液洗脱倒入平皿中，反复洗脱4次，均匀涂布在平皿中，在26 ℃培养箱中培养10 d，统计致死率。

2.5 致死率和正突变率

每个诱变处理36培养皿，重复3次，以未经诱变处理的孢子液为对照，致死率（%）=（对照处理平皿菌落-诱变处理平皿菌落）/对照处理平皿菌落×100%；正突变率（%）=诱变处理效价高于对照6%的菌株数/诱变处理的菌株总数×100%。

2.6 菌株遗传稳定性测定

将选育出的高产菌株以斜面形式保存，产生孢子后取少许孢子转入另一斜面，此为一代，连续传代3次，测定每一代菌株的霉酚酸效价，分析其遗传的稳定性。

2.7 Cu²⁺耐受性的检测

将孢子液稀释后，分别均匀涂布在含有1.56×10^-2、3.12×10^-2、6.24×10^-2 mol/L CuSO₄的培养基上，于26 ℃培养箱培养10 d，观察菌株的Cu²⁺耐受性。

2.8 HPLC测定

定量吸取发酵液，加入7倍体积的无水乙醇，充分振荡0.5 h，5 000 r/min离心15 min，过滤，取上清液，利用HPLC测定效价。HPLC测定的条件：色谱柱Agilent Extend⁃C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为三乙胺磷酸缓冲液（10 mL三乙胺加纯水定容到1 L，磷酸调节pH至5.4）和乙腈（V_{三乙胺磷酸缓冲液}∶V_乙腈=60∶40）；流速1.0 mL/min，进样体积为40 μL，检测的波长为250 nm，柱子温度为25 ℃。

2.9 菌丝观察

取培养好的发酵液，均匀涂于载玻片上，0.1%美兰染色液浸染3~5 min，然后用纯净水冲洗5次，置于显微镜下40倍物镜观察，拍照记录菌丝形态。

2.10 中试发酵

菌株在10 t发酵罐中进行发酵生产，接种量为5%，在温度26 ℃、pH自然、溶氧为20%条件下发酵7 d后，分析发酵效价和菌种菌丝形态。

2.11 生产发酵

菌株在200 t发酵罐中进行发酵生产，接种量为5%，在温度26 ℃、pH自然、溶氧20%条件下发酵7 d。

3 结果与分析

3.1 原始菌株的复壮

将保存的产霉酚酸短密青霉菌菌株S⁃225进行复壮，经过传代3次，结果发现菌株发酵效价分别为3 565、3667 、3531 mg/L，表明该菌株的遗传稳定性较好，作为后续诱变处理的原始菌株。

3.2 叠加诱变和优良菌株筛选

S⁃225菌株经EMS诱变处理，结果发现随着处理时间的增加，菌体致死率呈现升高的趋势，处理时间为6 h时，致死率为74.7%，正突变率为23.5%；处理时间为8 h时，致死率最高，达到95.2%，正突变率为19.3%（表1）。综合考虑，确定诱变处理适宜时间为8 h。采用EMS诱变处理8 h，初筛出8株正突变菌株，经摇瓶效价检测复筛，得到3株效价升高的菌株（编号为SE⁃1、SE⁃2、SE⁃3），其效价分别为8 256、8 145和8 187 mg/L，见表2。

SE⁃1、SE⁃2、SE⁃3菌株再分别经UV诱变处理，结果发现随着处理时间增加，菌体致死率呈现升高的趋势，处理时间300 s时，致死率为79.3%，正突变率为42.7%；处理时间为360 s时，致死率最高，达到93.4%，正突变率为25.6%。综合考虑，确定诱变处理适宜时间为360 s。采用UV诱变处理360 s，初筛出13株正突变菌株，经摇瓶效价检测复筛，得到2株效价升高的菌株（编号为SU⁃1、SU⁃2），其效价分别为8 264和8 278 mg/L，见表2。

SU⁃1、SU⁃2菌株再分别经ARTP诱变处理，结果发现随着处理时间的增加，菌体致死率呈现升高的趋势，处理时间为150 s时，致死率为86.6%，正突变率为35.6%；处理时间为200 s时，致死率最高，达到了95.3%，正突变率为25.9%。结合已有的研究报道，确定诱变处理适宜时间为150 s。采用ARTP诱变处理150 s，初筛出9株正突变菌株，经摇瓶效价检测复筛，得到3株效价升高的菌株（编号为SA⁃1、SA⁃2、SA⁃3），其效价分别为8 225、8 320和8 136 mg/L，见表2。

3.3 优良菌株遗传稳定性的检测

对获得的效价升高菌株的遗传稳定性及生长特性进行检测，结果发现菌株SE⁃3、SU⁃1、SA⁃1、SA⁃2的遗传稳定性较好，见表3。原始菌株菌落为圆形扁平状，而SE⁃3、SU⁃1、SA⁃1、SA⁃2菌落中央凸起，呈对称性放射褶皱状；其中SA⁃2菌落直径明显增大，且中心呈现墨绿色，见表3，图1A。

3.4 优良菌株Cu²⁺耐受性检测

对菌株SE⁃3、SU⁃1、SA⁃1、SA⁃2的Cu²⁺耐受性进行检测，结果发现，与原始菌株相比，SA⁃2在含1.56×10^-2、3.12×10^-2、6.24×10^-2 mol/L CuSO₄的培养基上均能较好生长，表明SA⁃2菌株具有较好的Cu²⁺耐受性，见表4。

3.5 优良菌株SA⁃2中试发酵性能的检测

以原始菌株S⁃225为对照，对菌株SA⁃2的中试发酵性能进行了3次检测，结果发现菌株SA⁃2效价范围为8 239~8 458 mg/L，其最高效价较菌株S⁃225的效价3 565 mg/L提高了137.3%。而且，SA⁃2的发酵液中菌丝呈现“舒展网状”，表明其具有较好的发酵生长性能，见表5、图1B。

3.6 优良菌株SA⁃2生产发酵性能的检测

采用生产发酵罐，对菌株SA⁃2的生产发酵性能进行了3次检测，结果发现其效价分别为8 533、8 614、8 769 mg/L，略高于其中试效价。

4 讨 论

菌种的性能对霉酚酸发酵生产效率起着至关重要的作用，而菌株诱变是选育霉酚酸优良发酵菌种的主要途径^［12］。EMS、UV和ARTP诱变是较常见的诱变方法，其中，融合多种方法的复合诱变具有更高的选育效率^［13］。本研究采用EMS+UV+ARTP叠加诱变方法，选育出了产霉酚酸的优良短密青霉菌菌株SA⁃2，大幅度地提高了菌株发酵效价。这与廖爱芳等^［9］采用的技术方法类似。霉酚酸发酵生产菌株短密青霉菌易受Cu²⁺等重金属离子的影响，但发酵生产过程中Cu²⁺等往往难以避免，因此菌株对Cu²⁺等的耐受性尤其重要。本研究将Cu²⁺耐受性作为菌株选育的关键指标，选育出的优良菌株SA⁃2兼具高发酵效价、高Cu²⁺耐受性的特性，这与娄忻等^［14］所采用的选育方式及研究结论相一致。SA⁃2菌株Cu²⁺耐受性的可能机制是，菌体通过次级代谢分泌大量产物或中间体与有毒的金属离子结合，形成无毒或低毒的复合物，从而解除Cu²⁺对菌体生长的抑制作用^［15］。

总体而言，本研究选育出的菌株SA⁃2具有较好的发酵性能，其发酵效价普遍高于国内已报道的其他菌株^［5，12］，且与国外报道的发酵效价10 400 mg/L较为接近^［16］。本研究对SA⁃2的中试发酵性能进行了初步评价，表明菌株生长状态良好，发酵效价较高。而且，在初步发酵生产中SA⁃2效价仍保持较高水平，表示其具有较好的生产性能。下一步优化SA⁃2发酵条件，进一步提高其发酵效价，并最终提升霉酚酸工业化发酵生产水平。

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