基于非靶代谢组学多刺绿绒蒿不同器官代谢物差异分析

Analysis of metabolites in different organs of Meconopsis horridula based on untargeted metabolomics

摘要

为了进一步探究传统藏药植物多刺绿绒蒿（Meconopsis horridula）中代谢物成分以及不同器官差异情况，采用UPLC⁃MS技术对多刺绿绒蒿的叶、根和花三个不同器官代谢物进行分析与鉴定。并利用主成分分析（PCA）、聚类热图分析、正交偏最小二乘⁃判别分析（OPLS⁃DA）和KEGG通路富集分析等方法进行不同器官差异代谢产物筛选与通路分析。结果显示，在ESI⁺和ESI^-模式下，共检测注释到947种代谢物，不同器官间差异代谢物进行分析，叶和根差异代谢物有301个，叶和花中差异代谢物有170个，根和花中差异代谢物有244个。通过聚类热图可以看出，大多数代谢物在根中含量较低；KEGG通路富集分析显示，差异代谢物大多富集在氨基酸代谢、花青素生物合成、黄酮类生物合成和生物碱合成等代谢途径。各器官优势黄酮类、萜类和生物碱类代谢物的分析为进一步探究多刺绿绒蒿的不同器官药用特征成分和开发利用提供一定的帮助。

Abstract

In order to further interrogate the difference between the different organ tissues in the traditional Tibetan medicinal plant Meconopsis horridula， its three parts （flower， leaf， and root） were identified and quantified by UPLC⁃MS/MS. Principal component analysis （PCA）， cluster heat map analysis， orthogonal partial least⁃squares discriminant analysis （OPLS⁃DA）， and KEGG pathway enrichment analysis were used for differential metabolite screening and pathway analysis. There were 947 metabolites detected by non⁃targeted metabolomics in two analytical modes ［ESI⁺ and ESI^-］， of which 301 differed statistically between leaves and roots， 244 differed statistically between roots and flowers， and 170 differed statistically between leaves and flowers. From the cluster heatmap results， most metabolites are low in the roots. Furthermore， enrichment analyses of KEGG pathways for differentially expressed genes revealed that most differential metabolites are enriched in amino acid metabolism， anthocyanin biosynthesis， flavonoid biosynthesis， and alkaloid biosynthesis. The differential metabolites （flavonoids， terpenoids and alkaloids） in different organs were analyzed， and these analyses provide some help for further exploring the medicinal characteristic components of Meconopsis horridula and their development and utilization.

Graphical abstract

关键词

多刺绿绒蒿 / 非靶代谢组学 / 藏药植物 / 黄酮类 / 萜类 / 差异代谢物

Key words

Meconopsis horridula / untargeted metabolomics / Tibetan medicinal plant / flavonoid / terpene / differential metabolite

0 前 言

绿绒蒿属（Meconopsis Vig.）植物大多分布于青藏高原海拔3 600~5 100 m的草坡、砾石和流石滩生境中，目前全世界共有49个种，除1种分布于西欧外，其余都分布在中国以及喜马拉雅地区，绿绒蒿属植物花朵颜色多样，是一类极具观赏价值的高山植物，有“高山牡丹”的美称^［1］。除此之外，绿绒蒿属植物也是一类传统的藏药植物。其中，多刺绿绒蒿（Meconopsis horridula）作为代表性一员，被《藏药志》《晶珠本草》等多部药典收录，具有清热止痛、活血化瘀等功效^［2，3］。

由于多刺绿绒蒿的观赏价值和宝贵的药用价值，有研究对其进行化学和药理学初步分析，结果表明，多刺绿绒蒿在抗氧化、抗炎、抗心肌缺血方面具有显著疗效。对多刺绿绒蒿乙醇提取物进行抗病毒活性筛选，发现药物质量浓度在12.5~50 g/L时，其对甲型流感病毒有抑制作用^［4］。选择左冠状动脉结扎致心肌缺血大鼠为模型，证实了多刺绿绒蒿乙醇提取物具有改善因心肌缺血导致心功能下降的作用^［5］。孙洪祥等^［6］采用分别向帕金森症PD小鼠模型灌胃高剂量OE、低剂量OE和阳性对照药盐酸司来吉兰观察小鼠指标的方式证实多刺绿绒蒿中相对含量高的生物碱———马齿苋酰胺E（OE）具有作用于帕金森和阿尔茨海默病的药效潜力。但是过去对多刺绿绒蒿的研究多集中于化学结构及药理学的分析，对于其不同器官药用代谢物和相关的代谢通路的研究还未见报道。近年来组学技术的发展在植物次生代谢物研究领域得到了广泛应用，因非靶代谢组学具有灵敏度高、检测范围广以及能够进行相对定量检测等优势。因此，本研究基于非靶代谢组学分析，筛选了多刺绿绒蒿不同器官的优势代谢物，分析了多刺绿绒蒿不同器官的优势代谢产物和相关代谢物通路，为进一步探究多刺绿绒蒿的不同器官药用特征成分和开发利用提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料于2021年8月采集于西藏自治区日喀则市江孜县，经武汉大学生命科学学院汪小凡教授鉴定为多刺绿绒蒿。选取了开花期长势相同的3株植株，编号分别为root1~3，leaf1~3，flower1~3。分别对其叶、根和花进行采集，野外采集清洗后分装到EP管后立即放入液氮保存，送往上海美吉生物医药科技有限公司进行非靶代谢组学检测。

1.2 方法

1.2.1 样品提取

精确称取50 mg植物组织样本放置于1.5 mL离心管中，加入由乙腈和甲醇等比例混合的提取液400 µL，涡旋30 s后，放置于低温超声仪中提取30 min（5 ℃，40 KHz），后经4 ℃，13 000 g离心15 min，移取上清液，氮气吹干，120 µL复溶液（V_乙腈∶V_水= 1∶1）复溶，低温超声萃取5 min（5 ℃，40 KHz），4 ℃，13 000 g离心5 min，移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。取等体积的所有样本代谢物混合制备成质控样本（Quality control，QC），以考察整个分析过程的重复性。

1.2.2 仪器分析

利用AB SCIEX公司的超高效液相色谱串联飞行时间质谱UPLC⁃TripleTOF系统对多刺绿绒蒿不同器官进行分析，其中流动相A为0.1%乙酸⁃水溶液，流动相B为等比例的乙腈与异丙醇溶液。洗脱条件为：0~3 min，流动相A从线性95%降至80%，流动相B从5%升至20%；3~9 min，流动相A从线性80%降至5%，流动相B线性从20%升至95%；9~13 min，流动相A线性维持5%，流动相B线性维持95%；13.0~13.1 min，流动相A线性从5%升至95%，流动相B线性从95%降至5%；13.1~16 min，流动相A线性维持95%，流动相B线性维持5%。流速为0.40 mL/min，柱温为40 ℃。质谱信号采集采用正负离子扫描模式，扫描范围设置为50~1 000 m/z。正负离子电压设置为5 000 V/4 000 V。离子喷雾电压，正离子电压5 000 V，负离子电压4 000 V，去簇电压80 V，喷雾气50 psi，辅助加热气50 psi，气帘气30 psi，离子源加热温度500 ℃，20~60 V循环碰撞能。

1.3 数据处理

上机完成之后，将原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）整理得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，即保留至少一组样品中非零值80%以上的变量，再进行填补空缺值（原始矩阵中最小值填补空缺值），为减小样品制备及仪器不稳定带来的误差，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵。同时删除QC样本相对标准偏差（RSD）>30%的变量，并进行log10对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵。同时将MS和MSMS质谱信息与代谢公共数据库HMDB（http：//www.hmdb.ca/）进行匹配，得到代谢物信息。

1.4 差异代谢物

差异代谢物的分析利用R软件包ropls（Version1.6.2）进行主成分分析（PCA）和正交最小偏二乘判别分析（OPLS⁃DA），并使用7次循环交互验证来评估模型的稳定性。显著差异代谢物的选择基于OPLS⁃DA模型得到的变量权重值（VIP）和student’s t检验P值来确定，VIP>1，P<0.05的代谢物为显著差异代谢物。将筛选出来不同组织的优势代谢物进行基因组百科全书（KEGG）pathway 富集分析，绘制火山图与气泡图，并根据HMDB数据库的注释信息，筛选出黄酮类、萜类和生物碱类3种重要次生代谢产物，对它们在不同器官的相对含量进行分析，绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 多刺绿绒蒿代谢物总体分析和PCA分析

为了探究多刺绿绒蒿中代谢物成分以及不同组织之间的差异情况，利用LC⁃MS对叶、根和花进行了非靶向代谢组学分析。在正负离子模式下共鉴定注释到包括147种有机氧化物、90种羧酸及其衍生物、72种黄酮类化合物、63种脂肪酰类化合物、58种异戊烯醇脂类化合物、19种酚类化合物、16种异黄酮类化合物、14种香豆素及其衍生物在内的947种代谢物（图1）。PCA结果显示，第一主成分解释率为30.0%，第二主成分解释率为20.7%。不同组织间的样本在这两个维度上有明显的分离（图2），QC样本的聚类结果也表明实验结果稳定可靠，并且所有样本都处于95%置信区间内，表明多刺绿绒蒿在叶、根和花中的代谢物有明显差异。

2.2 多刺绿绒蒿不同器官差异代谢物分析

为了了解多刺绿绒蒿不同组织之间代谢物的差异情况，对叶、根和花分别进行差异分析，为了消除无关变量的干扰，如图3所示，采用OPLS⁃DA模型进行差异检验，并且根据变量重要性投影（VIP>1且P<0.05）筛选出差异代谢产物，并绘制了火山图。图4所示，在根和叶的差异代谢物分析中，共鉴定出301种差异代谢产物，其中有245种在叶中含量较高，其余56种在根中含量较高。根与花的比较中，共筛选出244种差异代谢产物，其中有189种代谢产物在花中含量较高，55种在根中含量较高。在叶与花的比较中，筛选出170种差异代谢物，其中98种在叶中含量较高，72种在花中含量较高。

有37种代谢物在花中含量显著上升，高于根和叶。这37种优势代谢物主要包括4种有机氧化物、3种黄酮类化合物、3种甘油磷脂类化合物、2种苯及其衍生物化合物、1种萜类化合物。与花和根相比，叶中有66种优势代谢物，其中主要包括12种异戊二烯脂类化合物、11种有机氧化物、6种羧酸及其衍生物、4种黄酮类化合物、4种脂肪酰基类化合物、3种香豆素及其衍生物、2种苯及其衍生物、2种酚类化合物、2种异黄酮类化合物。与叶和花相比，有35种代谢物在根中含量显著上升，其中包括8种羧酸及其衍生物、6种有机氧化物、3种脂肪酰基化合物、2种甘油脂类化合物、1种香豆素及其衍生物、1种黄酮类化合物、1种异黄酮类化合物。

2.3 不同器官优势代谢物所涉及的代谢通路分析

将鉴定得到的叶、根和花三个器官各自的优势代谢物分别进行KEGG代谢通路富集分析（图5），其中叶片中的66种优势代谢物，注释到了7条代谢通路，分别是氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、色氨酸代谢、柠檬烯和蒎烯降解、单萜生物合成、果糖和甘露糖代谢。根中的35个优势代谢物注释到了20条代谢通路，主要包括精氨酸生物合成、组氨酸代谢、氨酰⁃tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、D⁃精氨酸和D⁃鸟氨酸代谢、ABC转运体、氮代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。花中的37个优势代谢物注释到了4条代谢通路，分别是泛酸和辅酶A生物合成、β⁃丙氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换、花青素生物合成相关通路。

2.4 不同器官黄酮类、萜类化合物和生物碱类代谢物分布状况

通过HMDB数据库的注释信息筛选到了包括金丝桃苷、木犀草素3'⁃（3''⁃乙酰葡糖苷酸）、香叶木素、锦葵色素、木犀草苷、表没食子儿茶素、芸薹甙、槲皮素⁃3⁃O⁃葡糖苷酸、山奈酚⁃3⁃O⁃葡萄糖醛酸苷等72种黄酮类化合物以及包括姜黄醇酮、（S）⁃香芹酮、覆盆子苷、心叶荆芥、京尼平苷酸在内的58种萜类代谢物。另外生物碱类代谢物作为绿绒蒿属植物内一类重要的代谢产物，在实验中共注释到了4种生物碱类化合物，分别为六驳碱、血根碱、四氢哈尔醇、氢吗啡酮⁃3⁃葡萄糖苷酸。从表1和表2种可以看出，在叶片中有4种黄酮类和12种萜类为优势代谢物。花中有3种黄酮类和1种萜类代谢物为优势代谢物。根中只有1种黄酮类代谢物为优势代谢物。从聚类热图（图6）可以看出，大多数萜类和黄酮类代谢物在叶和花中的相对含量要高于根部。

3 讨 论

多刺绿绒蒿因其独特的花色和外形，不仅具有很高的观赏价值，而且也是一味重要的传统藏药植物。目前关于多刺绿绒蒿研究大多集中在化学成分和药理作用方面^［7］。例如，多刺绿绒蒿乙醇提取物部分的分离鉴定得到了9个化合物，分别是马齿苋酰胺E，N⁃反式对羟基肉桂酰基⁃对羟基苯乙胺，金圣草黄素，芹菜素，大风子素，对羟基肉桂酸葡萄糖酯，stigmast⁃5⁃ene⁃3β⁃ylformate，3β⁃hydroxy⁃7α⁃ethoxy⁃24β⁃ethylcholest⁃5⁃ene，β⁃谷甾醇^［8］。马明芳等^［9］从中分离得到了4′，5，7⁃三羟基⁃3′，5′⁃二甲氧基黄酮、木犀草素、芹菜素、大风子素和β⁃谷甾醇。在药理作用方面，有研究已经表明其在抗肿瘤、抗病毒、心肌保护和治疗神经系统疾病方面有显著作用^［7，10］。由此可以看出，多刺绿绒蒿作为药用植物，在医药领域具有巨大的开发潜力。

植物次生代谢产物作为植物体内重要的一类化合物^［11］，不仅是天然药物的重要来源，而且在植物应对环境胁迫方面有重要的作用^［12］。研究发现，植物在不同紫外辐射^［13］、温度^［14］、干旱胁迫^［15］以及在不同器官中^［16］，次生代谢物的含量会有显著的差异，因为高原低氧、强辐射、昼夜温差大的环境特点，植物自身势必会产生一系列次生代谢产物来应对环境胁迫。因此，我们对多刺绿绒蒿叶、根和花三个器官进行代谢组学测定，总共鉴定到了947代谢物，从PCA结果中可以看出，不同器官之间差异显著；聚类结果显示，大多数代谢物在叶和花中的含量相对较高，从优势代谢物方面看，在叶中共鉴定到66个优势代谢物，主要为碳水化合物类、萜类、黄酮类和香豆素类化合物。花中鉴定得到37种优势代谢物，主要包括甘油磷酸酯类、黄酮苷类、萜类等。在根中共鉴定到35个优势代谢物，主要包括氨基酸类、碳水化合物类、糖基甘油以及呋喃香豆素类化合物。

黄酮类和萜类化合物作为植物体内两类重要的次生代谢产物，是许多药用植物的特征活性物质，本次实验在多刺绿绒蒿中共鉴定出72种黄酮类代谢物和58种萜类代谢物。从含量上看，大多数黄酮类和萜类代谢物在叶和花中含量较高。在优势代谢物方面，叶片中优势代谢物最多，有4种优势黄酮类代谢物和12种萜类代谢物。根中最少，只有1种黄酮类优势代谢物。花中有3种黄酮类化合物和1种萜类化合物，其中柠檬素⁃3⁃β⁃D⁃葡萄糖苷只在花中检测到；与花和根相比，叶片中银杏内酯A、桃叶珊瑚苷、豌豆香堇苷的含量明显高于其他器官。在生物碱类代谢物方面，鉴定得到4种生物碱，其中血根碱、四氢哈尔醇、氢吗啡酮⁃3⁃葡萄糖苷酸这3种生物碱在根中的含量较高，六驳碱在花中的含量较高，而叶片中生物碱的含量较低。有研究表明这类生物碱类化合物在抗菌、抗肿瘤、镇痛和舒张血管等方面有显著作用^［17~19］。

多刺绿绒蒿作为一味传统的藏药植物，本次研究从中鉴定出多种药用成分。其中生物碱类化合物作为罂粟科植物的特征成分，总共鉴定出4种生物碱，并且在根部含量相对较高，另外黄酮类和萜类化合物作为植物体内两类重要的次生代谢产物，不仅是众多药用化合物的重要来源，而且对于植物应对环境胁迫具有重要的作用。由于青藏高原环境具有海拔高、低氧、强辐射和日照时间长等特点，植物会产生大量次生代谢产物以抵御外界环境胁迫。而这些代谢产物与药用植物的品质密切相关。从聚类分析中可以看出，多刺绿绒蒿在不同器官的次生代谢物差异显著，差异代谢物大多富集在氨基酸代谢、花青素生物合成、黄酮类生物合成和生物碱合成等代谢途径。而关于不同器官优势代谢物以及关键药用成分的研究是药用植物研究的关键，本文对多刺绿绒蒿不同器官代谢产物以及所涉及的相关合成通路进行研究，并且对各器官优势的萜类、黄酮类和生物碱类化合物进行分析，以期为今后更好地对多刺绿绒蒿活性成分的研究和资源的开发利用提供科学的依据和参考。

非靶代谢组学属于高通量检测技术，具有灵敏度高、检测范围广等特点，在进行次生代谢物初步挖掘时具有广泛的应用，但也因其会产生大量冗余数据和错误信号以及注释信息库的限制，非靶代谢组学存在准确性偏低的问题。因此，在下一步实验中，应该扩大样本量以及对鉴定出来的有重要药用价值的次生代谢产物进行靶向代谢组学定量研究。

参考文献

[1] 中国科学院植物志编辑委员会. 中国植物志.第32卷[M].北京: 科学出版社,1999: 46.

[2] Editorial Board of Flora of China, Chinese Academy of Sciences. Flora of China (Vol. 32) [M]. Beijing: Science Press, 1999: 46.

[3] 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志[M]. 西宁:青海人民出版社,1991.

[4] Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences. Record of Tibetan medicine [M]. Xining: Qinghai People’s Publishing House, 1991.

[5] 帝玛尔·丹增彭措. 晶珠本草[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2011.

[6] DanzengpengcuoDimaer. Jingzhu Herbal of Tibetan Medicine [M]. Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers, 2011.

[7] 李长山, 王聚乐, 普珍, 等. 藏药多刺绿绒蒿提取物体外抗流感病毒作用的初步研究[J]. 中药药理与临床, 2012, 28(5): 130⁃132.

[8] Li C S, Wang J L, Pu Z, et al. Study on the inhibitory effects of Tibetan medicine Meconopsis horridula Hook against influenza virus in vitro [J]. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2012, 28(5): 130⁃132.

[9] 郭志琴. 藏药多刺绿绒蒿抗心肌缺血作用与化学成分研究[D]. 北京: 北京中医药大学,2014.

[10] Guo Z Q. Study on the anti⁃myocardial ischemia effect and chemical constituents of the Tibetan medicine Meconopsis spinosa [D]. Beijing: Beijing University of Chinese Medicine, 2014.

[11] 孙洪祥. 马齿苋酰胺E对帕金森病模型的保护作用研究[D]. 济南: 山东大学, 2016.

[12] Sun H X. Neuroprotective effect of oleracein E on Parkinson’s disease models [D]. Jinan: Shandong University, 2016.

[13] 赵凤, 张和新歌, 白睿峰, 等. 藏药多刺绿绒蒿的化学和药理学研究进展[J]. 中国中药杂志, 2017, 42(19): 3676⁃3683.

[14] Zhao F, Zhang H X G, Bai R F, et al. Advance of a representative traditional Tibetan medicine Meconopsis horridula on its phytochemical and pharmacological aspects [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2017, 42(19): 3676⁃3683.

[15] 郭志琴, 郭强, 朱枝祥, 等. 藏药多刺绿绒蒿的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(7): 1152⁃1156.

[16] Guo Z Q, Guo Q, Zhu Z X, et al. Chemical constituents from a Tibetan medicine Meconopsis horridula [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2014, 39(7): 1152⁃1156.

[17] 马明芳, 丁克毅, 丁立生, 等. 多刺绿绒蒿的化学成分研究[J]. 华西药学杂志,2009, 24(3): 227⁃229.

[18] Ma M F, Ding K Y, Ding L S, et al. Chemical constituents of Meconopsis horridula Hook.f.et Thoms.[J]. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009, 24(3): 227⁃229.

[19] 蒋欣豪, 王慧琳, 勉瑞莎, 等. 青藏高原绿绒蒿的药用研究进展[J]. 青海草业, 2022, 31(1): 33⁃36.

[20] Jiang X H, Wang H L, Mian R X, et al. Progress in meconopsis medicinal study of Tibetan Plateau [J]. Qinghai Prataculture, 2022, 31(1): 33⁃36.

[21] Yang L, Yang C, Li C, et al. Recent advances in biosynthesis of bioactive compounds in traditional Chinese medicinal plants [J]. Sci Bull, 2016, 61: 3⁃17.

[22] Pant P, Pandey S, Dall'Acqua S. The influence of environmental conditions on secondary metabolites in medicinal plants: a literature review [J]. Chem Biodivers, 2021, 18(11): e2100345.

[23] Ma C H, Chu J Z, Shi X F, et al. Effects of enhanced UV⁃B radiation on the nutritional and active ingredient contents during the floral development of medicinal chrysanthemum [J]. J Photochem Photobiol B, 2016, 158: 228⁃234.

[24] Gupta N, Reddy K, Bhattacharyya D, et al. Plant responses to geminivirus infection: guardians of the plant immunity [J]. Virol J, 2021, 18(1): 143.

[25] Ashrafi M, Azimi⁃Moqadam M R, Moradi P, et al. Effect of drought stress on metabolite adjustments in drought tolerant and sensitive thyme [J]. Plant Physiol Biochem, 2018, 132: 391⁃399.

[26] Belkheir A K, Gaid M, Liu B Y, et al. Benzophenone synthase and chalcone synthase accumulate in the mesophyll of Hypericum perforatum leaves at different developmental stages [J]. Front Plant Sci, 2016, 7: 921.

[27] Chen W Y, Ko F N, Wu Y C, et al. Vasorelaxing effect in rat thoracic aorta caused by laurotetanine isolated from Litsea cubeba Persoon [J]. J Pharm Pharmacol, 2011, 46(5): 380⁃382.

[28] Su Q, Wang J J, Wu Q, et al. Sanguinarine combats hypoxia⁃induced activation of EphB4 and HIF⁃1α pathways in breast cancer [J]. Phytomedicine, 2021, 84: 153503.

[29] Stannard C, Gaskell H, Derry S, et al. Hydromorphone for neuropathic pain in adults [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2016, 2016(5): CD011604.

基金资助

中央引导地方项目，藏药多刺绿绒蒿黄酮类代谢产物及其生物合成调控机制的研究(XZ202102YD0031C)