海南黎药蛇王藤质量标准研究

Study on the quality standard of Hainan Li nationality medicine Passiflora cochinchinensis

摘要

为制定海南黎药蛇王藤的质量标准，依据《中华人民共和国药典》2020年版质量检定的基本原则为指导，采用性状观察法、显微观察法、薄层色谱法、烘干法、总灰分测定法、醇溶性热浸法分别研究蛇王藤的性状和显微结构特征、薄层色谱鉴别、水分、总灰分以及醇溶性浸出物。本研究明确了蛇王藤药材的性状和显微结构特征，建立了薄层鉴别方法；规定蛇王藤药材水分不得超过12.0%、总灰分不得超过7.0%、水溶性浸出物不得少于8.0%。本研究制定的蛇王藤药材质量标准可为该药材的质量控制提供依据。

Abstract

In order to establish the quality standard of Passiflora cochinchinensis， guided by the basic principles of quality inspection in Pharmacopoeia of the People’s Republic of China （2020 Edition）， character characteristics， microstructural characteristics， TLC identification， water content， total ash content and water⁃soluble extractives of P. cochinchinensis were studied by means of microscopic observation， TLC， drying， total ash determination and alcohol soluble hot soak. This study stipulates that the water content of P. cochinchinensis should not exceed 12.0%， the total ash content should not exceed 7.0%， and the water⁃soluble extractives should not be less than 8.0%. Therefore， the quality standard established in this study can provide the basis for the quality control of this medicine.

Graphical abstract

关键词

蛇王藤 / 质量标准 / 鉴别 / 黎药 / 蛇药

Key words

Passiflora cochinchinensis / quality standard / identification / Li medicine / Chinese drug for snakebite

0 引 言

蛇王藤为西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora L.）植物蛇王藤（P. cochinchinensis）的干燥茎与叶，又名双目灵、蛇王、“雅匹哈”（黎语）^［1］。主要分布于海南儋州、乐东和三亚等地，为海南黎族草医常用传统药材之一^［2］，在历代记载中均无品种变化。蛇王藤，气微，味微苦，常用来治疗毒蛇咬伤，具有清热解毒、消肿止痛等作用。在传统的使用方法中，蛇王藤药材常与食疗的方法相结合，以蛇王藤茎叶煮水冲酒内服或将其与雷公豆（Asiatic Pennywort Herb）、海桐皮（Aralia chinensis L.）加水酒各半煮后内服用于治疗毒蛇咬伤^［3］。有研究者将蛇王藤全草及柚子叶〔Citrus Grandis（L.）Osbeck〕以2∶3比例混合，做成312%煎剂（俗称“广东蛇药”）^［4］，对眼镜蛇、蝮蛇、海蛇等蛇毒中毒症状，均有明显的治疗、保护作用。同时，蛇王藤可减轻肝细胞变性、坏死，从而防治大鼠的肝损伤^［5］。

目前涉及蛇王藤的相关研究均基于“广东蛇药”进行拓展^［6］，而对于蛇王藤所含化学成分、药理作用及其质量标准的研究却很少^［7］。因此，本研究以海南不同产地的10批蛇王藤药材进行质量控制研究，制定了蛇王藤药材质量标准，为蛇王藤药材的质量控制及其深度开发利用与临床应用提供参考依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

本实验中10批蛇王藤药材分别采自海南岛的10个不同产地，包括海口、昌江、万宁、文昌、三亚等。10批蛇王藤药材均为野生，详细信息见表1，所有药材晒干后，粉碎，备用^［8］。其中采自儋州那大镇的蛇王藤药材为此次实验的对照药材。10批样品药材经广东药科大学郑希龙副研究员鉴定为蛇王藤（Passiflora cochinchinensis），凭证（腊叶）标本保存于海南省中药标本馆（中国医学科学院药用植物研究所海南分所内）。

实验用甲苯、乙酸乙酯、石油醚均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司，无水乙醇购自广州市金华大化学试剂有限公司。

1.2 仪器

生物显微镜（ECLIPSE80i型，尼康映像仪器销售有限公司），纤维马弗炉（FURNACE1000C，天津市中环实验电炉有限公司），1/1000电子天平（PL203型，梅特勒⁃托利多上海仪器有限公司），紫外分析仪（JY025型，北京君意东方电泳设备有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG⁃9053A，浙江托普仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 性状检定

蛇王藤的性状检定采用《中国药典》2020年版（四部）^［9］通则0212项下的检定方法，对蛇王藤药材的形状、大小、表面色泽和特征、质地、断面及气味进行观察和描述。

2.2 显微鉴别

参照《中国药典》2020年版（四部）^［9］通则2001项下的显微鉴别法，取蛇王藤药材的茎部位，经软化处理后，用徒手切片法，切成10~20 μm的薄片。选取平整的薄片置载玻片上，滴加水合氯醛试液1~2滴，盖上盖玻片，于生物显微镜下观察蛇王藤药材茎的显微结构^［10］。

2.3 薄层色谱鉴别

取蛇王藤药材粉末1 g，吸取乙醇15 mL作为提取剂，超声处理30 min后进行过滤，滤液加热浓缩至3 mL，作为供试品溶液。另取蛇王藤对照药材（SWT20180308DZ01）1 g，按照同样的步骤制成对照药材溶液^［11］。将所配成的两种溶液各吸取2 μL，按照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部^［9］通则0502）试验，点于同一硅胶G薄层板上，用石油醚（60~90 ℃）⁃甲苯⁃乙酸乙酯（V∶V∶V=5∶3∶2）作为展开剂，对两种溶液的样品点进行吸收展开，展开完成后取出晾干，喷以20%硫酸乙醇溶液，在105 ℃的温度下加热5 min，放置日光灯下检视^［12］。

2.4 水分、总灰分、浸出物的测定

按照《中国药典》2020年版（四部）^［9］通则下的0832项下烘干法、2302项下总灰分测定法、2201项下醇溶性浸出物测定法对不同批次的蛇王藤药材进行水分、总灰分、浸出物的测定^［13］。

3 结 果

3.1 蛇王藤性状检定

如图1所示，蛇王藤老茎呈圆柱形，表面灰褐色或黄白色，有不规则沟纹，具枝痕；体轻质坚硬，难折断，断面不整齐，皮部较窄，棕色，木部浅黄色，呈蜂窝状。幼茎呈压扁状，表面黄褐色，有细纵沟纹，质脆易折断，断面黄白色。叶片皱缩，展平后呈长卵形，先端圆形，有的微尖，基部圆形，全缘，边缘常向背面卷曲，上表面黄褐色或绿褐色，略光滑；下表面呈浅褐绿色，具短柔毛。叶柄长约0.5 cm，其上端两侧有一对长圆形腺体，其腋间有卷须。气微，味微苦。

3.2 蛇王藤显微鉴别

蛇王藤药材茎横切片最外层为表皮，外被厚角质层，或为木栓层。皮层散有纤维和石细胞。中柱鞘纤维束新月形，其内侧常为1~5列石细胞，并切向延伸与射线中的石细胞群成环。韧皮射线向外渐宽，可见锥形或分枝状石细胞。韧皮部细胞大多颓废，有的散有1~3个纤维。形成层窄。木质部导管单个散在或数个切向连接；木射线4~20列。髓部细胞多边形。如图2~4所示。

3.3 蛇王藤薄层色谱鉴别

对比不同批次的蛇王藤药材与对照药材在薄层板中显现的图谱，对比发现，不同批次的蛇王藤药材与对照药材显示的图谱的颜色亮斑相一致，见图5。

3.4 水分、总灰分、浸出物的测定

共10批蛇王藤药材样品的水分、总灰分、浸出物测定结果见表2。根据表中的结果判断，不同批次的蛇王藤药材，其总灰分和水溶性浸出物的差别比较大，其中采于海口石山镇的蛇王藤药材总灰分及水溶性浸出物相对最高，而采于文昌龙楼镇的蛇王藤药材总灰分及水溶性浸出物相对最低。

3.4.1 水分限量标准

参照水分测定法（《中国药典》2020年版四部^［9］通则0832）项下的烘干法测定，测定10批蛇王藤药材水分为9.10%~9.83%，根据10批蛇王藤水分平均值乘120%，得到蛇王藤水分限定标准参考为11.41%，拟规定蛇王藤药材水分不得过12.0%。

3.4.2 灰分限量标准

参照灰分测定法（《中国药典》2020年版四部^［9］通则2302）项下的总灰分测定法，测定10个批次蛇王藤药材总灰分为3.87%~7.23%，根据10批蛇王藤总灰分平均值乘120%，得到蛇王藤总灰分限定标准参考为6.42%，拟规定蛇王藤药材总灰分不得过7.0%。

3.4.3 浸出物限量标准

参照浸出物测定法（《中国药典》2020年版四部^［9］通则2201）项下的热浸法，用乙醇作溶剂时，测定10批蛇王藤药材醇溶性浸出物为2.76%~3.79%；同法下以水作溶剂时，测定10批蛇王藤药材水溶性浸出物为8.48%~12.50%，皆大于醇溶剂所提取的浸出物的量，根据10批蛇王藤水溶性浸出物平均值乘120%，得到蛇王藤浸出物限定标准为8.33%，拟规定蛇王藤药材水溶性浸出物不得少于8.0%。

4 讨 论

4.1 展开剂筛选

薄层色谱鉴别具有很强的专属性，斑点分离效果好，操作简便易行，用其对照鉴别药材有很好的使用价值，因此展开剂的选用是薄层色谱鉴别中最重要的步骤。在蛇王藤药材的薄层色谱鉴别中，将不同批次的蛇王藤药材用醇溶液提取（超声或加热回流）后过滤挥干，溶于蒸馏水中制成供试品溶液。从苯、二甲苯、氯仿、石油醚、乙酸、乙酸乙酯、正丁醇及乙醇中筛选得到了2~3个展开剂体系，最终确定以石油醚（60~90 ℃）⁃甲苯⁃乙酸乙酯（5︰3︰2）为展开剂的效果最佳。

4.2 蛇王藤药材标准的复核

本研究拟定了蛇王藤药材性状检定、显微鉴别、薄层色谱鉴别及水分、灰分、浸出物的标准。为了检验本文拟定的蛇王藤药材标准的准确性，按照拟定的蛇王藤药材标准草案，对3批蛇王藤药材进行验证。在通过自检后，将相同的3批蛇王藤药材交由省级药品检验机构，再次参照拟定的标准草案进行方法的复核。结果显示，本文拟定的蛇王藤标准草案同时满足自检验证和海南省药品检验所复核验证。因此，本研究拟定的蛇王藤药材标准具有准确性，可判定符合要求。

5 结 语

蛇王藤药材所属的西番莲属，其90%的物种分布在美洲大陆，其余多数产于亚洲热带地区，在中国仅海南、广东等少数地区存有，且多为野生种。由于蛇王藤生长环境及分布区域的局限性，导致其主要由我国黎族人民依照传统方法使用，因为缺少严格的科学配比及文字记述，造成了有关蛇王藤单味药方及药用用途的记载稀少。因此，在针对蛇王藤药材的研究中，常常会因为缺少大量的理论依据，而不得不进行大量的实验去验证流传下来的传统使用方法，花费大量的时间去探索蛇王藤的有效成分及药理作用，这也使得研究蛇王藤药材的化学成分及蛇王藤药用价值的进度十分缓慢。

本研究以2020年版《中国药典》为指导，对海南不同地区的蛇王藤药材进行性状鉴别、薄层鉴别以及水分、总灰分、浸出物和多糖的含量测定，初步制定出了蛇王藤药材的质量标准。这一标准的制定，为以蛇王藤药材为原料的产品以及后续蛇王藤药材的分类提供了鉴别、检验检测的依据；同时，为后续蛇王藤药材的化学成分分析及药理作用的进一步研究提供了数据支持和理论基础。

参考文献

[1] 代正福, 彭明. 海南中药资源名录[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009: 81.

[2] Dai Z F, Peng M. List of traditional Chinese medicine resources in Hainan [M]. Beijing: China Agricultural Press, 2009: 81.

[3] 甘炳春, 李榕涛, 杨新全, 等. 海南五指山区黎族药用民族植物学研究[J]. 中国民族民间医药杂志, 2007(4): 194⁃198, 248.

[4] Gan B C, Li R T, Yang X Q, et al. Study on medicinal ethnobotany of Li nationality in Wuzhi Mountain Area of Hainan [J]. Chinese Journal of Ethnic and Folk Medicine, 2007(4): 194⁃198, 248.

[5] 甘炳春, 杨新全, 李榕涛. 黎族民间治疗外伤药用植物的收集整理[J]. 中国民族民间医药杂志, 2005(6): 357⁃360.

[6] Gan B C, Yang X Q, Li R T. Collection and arrangement of folk medicinal plants for treating trauma of Li nationality [J]. Chinese Journal of Ethnic and Folk Medicine, 2005(6): 357⁃360.

[7] 吴秀荣, 曾婉云, 沈宝莲, 等. 广东蛇药对131Ⅰ标记的银环蛇毒在小白鼠膈肌含量的影响[J]. 动物学研究, 1981, 2(S1): 121⁃126.

[8] Wu X R, Zeng W Y, Shen B L, et al. Effect of Guangdong snake medicine on the content of 131Ⅰ⁃labeled ring snake venom in mouse diaphragm [J]. Zoological Study, 1981, 2(S1): 121⁃126.

[9] 周锦超, 刘惠宁, 侯智恒, 等. 香港的生物多样性及其保育工作[J]. 生物多样性, 2000, 8(1): 25⁃35.

[10] Zhou J C, Liu H N, Hou Z H, et al. Biodiversity and conservation in Hong Kong [J]. Biodiversity, 2000, 8(1): 25⁃35.

[11] 马郁琪, 梁彬, 胡本荣, 等. 广东蛇药中水溶性部分有效成分的分离鉴定[J]. 中草药, 1982(5): 1⁃4.

[12] Ma Y Q, Liang B, Hu B R, et al. Isolation and identification of water⁃soluble active components in Guangdong snake medicine [J]. Chinese Herbal Medicines, 1982(5): 1⁃4.

[13] 梁彬. 广东蛇药水溶性有效成分的组合与其协同作用的研究[J]. 中国中药杂志, 1985, 10(8): 42⁃44.

[14] Liang B. Study on the combination of water⁃soluble active components of Guangdong snake medicine and its synergistic effect [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 1985, 10(8): 42⁃44.

[15] 陈文, 王旭, 彭玉姣, 等. 贮藏方式对4种药食两用植物种子萌发的影响[J]. 中国农学通报, 2018, 34(1): 85⁃89.

[16] Chen W, Wang X, Peng Y J, et al. Effects of storage methods on seed germination of four medicinal and edible plants [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2018, 34(1): 85⁃89.

[17] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部)[M]. 北京: 中国医药科技出版社,2020.

[18] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People’s Republic of China (Part 4) [M]. Beijing: China Medical Science Press, 2020.

[19] 陈兰, 冯剑, 刘洋洋, 等. 海南地方习用药材土人参质量标准研究[J]. 热带农业科学, 2022, 42(1): 69⁃74.

[20] Chen L, Feng J, Liu Y Y, et al. Study on quality standard of local traditional medicine panax ginseng in Hainan [J]. Tropical Agricultural Sciences, 2022, 42(1): 69⁃74.

[21] 辛国, 赵昕彤, 黄晓巍. 柴胡化学成分及药理作用研究进展[J]. 吉林中医药, 2018, 38(10): 1196⁃1198.

[22] Xin G, Zhao X T, Huang X W. Research progress on chemical constituents and pharmacological action of Bupleurum chinense [J]. Jilin Traditional Chinese Medicine, 2018,38(10): 1196⁃1198.

[23] 陈兰, 黄梦利, 刘洋洋, 等. 海南黎药接骨草质量标准研究[J]. 生物资源, 2021, 43(4): 408⁃412.

[24] Chen L, Huang M L, Liu Y Y, et al. Quality standard for Sambucus chinensis Lindl [J]. Biotic Resources, 2021, 43(4): 408⁃412.

[25] 王云云, 陈兰, 刘洋洋, 等. 血叶兰药材质量标准研究[J]. 生物资源, 2021, 43(4): 413⁃418.

[26] Wang Y Y, Chen L, Liu Y Y, et al. Research in quality standards of Ludisia discolor [J]. Biotic Resources, 2021, 43(4): 413⁃418.

基金资助

海南省重大科技计划项目(ZDKJ2021034)

中国民族医药学会科研项目(2020MZ196-240601)