基于转录组数据藏波罗花WRKY转录因子鉴定与表达分析

Identification and expression analysis of WRKY transcription factors in Incarvillea younghusbandii Sprague based on transcriptome data

摘要

为了解在藏波罗花中转录因子WRKY基因家族的结构和组织特异性表达情况，进而为其特征成分萜类化合物的合成与调控提供一定的借鉴，本研究从藏波罗花的转录组数据中共鉴定出了38个WRKY转录因子，进行生物信息学分析。根据WRKY转录因子保守结构域将38个藏波罗花WRKY转录因子分为三类（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ），长度为115~623。表达量分析结果表明，有16个转录因子在叶和根中差异表达，其中10个在叶中显著上调，6个在根中显著上调。选取了5条WRKY转录因子进行qRT⁃PCR验证，结果与转录组数据相一致，表明转录组数据可靠。这些在藏波罗花中不同组织之间的差异WRKY转录因子可能在应对极端环境和介导组织特异性次生代谢产物方面发挥作用，这也为后续探究植物在应对高海拔极端环境和次生代谢产物的合成与积累提供一定的帮助。

Abstract

WRKY is a plant specific transcription factor family. To understand the structure and tissue⁃specific expression of the WRKY gene family in I. younghusbandii， bioinformatics analysis based on the structural characteristics of the conservative domains was performed. Thirty⁃eight WRKY transcription factors were identified and categorized into three groups： groups Ⅰ，Ⅱ， and Ⅲ， which ranged from 115 aa to 623 aa. Tissue⁃specific expression analysis revealed that 16 transcription factors are differentially expressed in leaves and roots， of which 10 are significantly up⁃regulated in leaves and 6 are up⁃regulated in roots. 5 transcription factors were selected to perform qRT⁃PCR analysis， and the results were consistent with transcriptome data. WRKY transcription factor family may play an essential role in environmental adaptability and secondary metabolites. This study can provide some help for exploring the plant response to extrame environment at high altitude and the synthesis and accumulation of secondary metabolites.

Graphical abstract

关键词

药用植物 / 藏波罗花 / WRKY转录因子 / 转录组分析

Key words

medicinal plant / Incarvillea younghusbandii Sprague / WRKY transcription factor / transcriptome analysis

0 引 言

藏波罗花（Incarvillea younghusbandii Sprague）为紫葳科（Bignoniaceae）角蒿属（Incarvillea Juss.） 的矮小草本，常分布于青藏高原海拔3 000~5 000 m的山坡草甸和砾石生境中，是一种传统的藏药植物^［1］，具有悠久的药用历史，《藏药志》记载其有治疗产后贫乳、身体虚弱、贫血等功效^［2］。有研究表明藏波罗花具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等药理作用^［3，4］。单萜类化合物作为角蒿属植物中的特征成分^［5］，不仅是重要的药用活性成分，而且萜类化合物在植物适应外界环境胁迫方面也具有重要作用^［6］。因此对藏波罗花不同部位的萜类生物合成途径相关的调控因子进行研究将有助于解析其生物合成和积累分子机制，为藏波罗花药用活性成分的生物学合成以及适应机制提供分子生物学依据。

转录因子作为一类可以和靶基因保守结构域结合的调节蛋白，可以通过调控DNA的转录和表达进而调节植物的生长发育和响应胁迫等过程^［7］。根据能否特异性与靶基因结合的特点，将植物中的转录因子分为特异性和非特异性两大类，现阶段主要的研究热点集中在特异性的转录因子上，并且根据转录因子与目的基因结合的保守结构域分类，已在植物中鉴定出超过50种转录因子基因家族，常见的有MYB、NAC、WRKY、AP2等^［8］。WRKY作为植物中一类特有的重要转录因子，最早是在甘薯中发现，如今已经在拟南芥、大豆、水稻等多种植物中报道。WRKY转录因子突出的特征是由N端WRKYGQK保守序列和C端的两类锌指结构域（C-C-H-H和C-C-H-C）构成^［9］。根据保守结构域的数量和类型将其分为三类，Ⅰ类包含两个保守的WRKY结构域和一个C-C-H-H锌指结构；Ⅱ类含有一个保守的WRKY结构域和一个C-C-H-H锌指结构；Ⅲ类中含有一个保守的WRKY结构域和一个C-C-H-C锌指结构。近年来，关于WRKY转录因子功能的研究取得了重要的进展。研究发现WRKY转录因子在生物碱类、萜类、黄酮类化合物生物合成过程中起重要作用。例如，Suttipanta等^［10］发现通过过表达长春花中CrWRKY1基因，能够显著上调长春花中吲哚生物碱的含量。穿心莲中鉴定出的APWRKY9、APWRKY19、APWRKY36和APWRKY58转录因子可正向调控其体内萜类化合物的生物合成^［11］。

目前，藏波罗花的分子生物学研究还不深入。本研究以藏波罗花转录组数据为基础，对WRKY基因家族进行筛选和鉴定，并对其理化性质、保守基序、进化关系和不同部位表达模式进行分析，以期为藏波罗花中萜类等活性物质的积累以及高海拔环境适应性研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 藏波罗花材料的采集

2021年7月份在西藏自治区林周县旁多乡、当雄县羊八井、定日县扎加宁巴三个地点采集实验材料，样品具体信息见表1。经武汉大学生命科学学院汪小凡教授鉴定为藏波罗花。每个居群采集长势相同的三株植株的叶片和根，液氮冷冻保存，送往上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序。

1.2 藏波罗花WRKY转录因子基因的筛选和理化性质预测

将组装获得的转录组序列与NR，Swiss⁃Prot， Pfam，COG，GO和KEGG数据库进行比对，获得在各数据库的注释信息，提取注释为WRKY转录因子的序列，并进一步将筛选出的WRKY转录因子的蛋白序列导入MEGA7中进行多序列比对，筛选具有完整结构域的基因。总共鉴定出38条具有完整结构域的WRKY转录因子，按顺序命名为IysWRKY1~IysWRKY38。使用在线工具ExPASy Protparma（https：//web.expasy.org/protparam/）和Plant⁃mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行蛋白质理化因子和亚细胞定位预测。

1.3 多序列比对和保守结构域分析

将筛选获得的38条蛋白序列导入MEGA7中用ClustalW进行序列比对，将比对结构保存为fasta格式导入GeneDoc（https：//github.com/Karlnicholas/GeneDoc）中进行保守结构域的标识。利用MEME在线软件对筛选得到的38条藏波罗花IysWRKY家族蛋白序列进行分析，保守基序数目选择10，其他参数选择默认值，进行保守结构域分析。

1.4 系统发育树构建和表达量分析

从拟南芥网站（www.arabidopsis.org/）下载37条拟南芥WRKY转录因子的蛋白序列，与筛选的藏波罗花WRKY转录因子基因的蛋白序列导入MEGA7中进行多序列比对。采用NJ法构建系统发育树，bootstrap选择1 000次重复，其他选择默认参数构建系统发育树。以藏波罗花3个居群叶和根的转录组数据为基础，获取基因表达量TPM数值，利用TBtools软件绘制表达量聚类热图。

1.5 qRT⁃PCR分析

选取5条IysWRKY转录因子进行qRT⁃PCR分析，验证转录组测序结果的可靠性，利用Primer Premier 5.0软件设计了5对特异性PCR引物，引物详情见表2。通过PCR扩增、电泳验证了引物特异性。选取GAPDH为内参基因，使用Bio⁃Rad CFX96TM系统进行实时荧光相对定量检测，反应体系按照qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）试剂盒说明书进行，采用2^-∆∆CT法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 藏波罗花WRKY转录因子基因的鉴定与理化性质预测

利用第二代测序技术获得藏波罗花转录组数据，经保守结构域分析，共鉴定出38条具有完整WRKY结构域的基因，分别命名为IysWRKY1到IysWRKY38（表3）。利用在线软件ExPASy protparam tool进行氨基酸序列特征分析，IysWRKY1编码的蛋白序列最长为623，理论等电点（PI）为8.48，分子量69 372.14；IysWRKY16编码的蛋白质序列最短为115，理论等电点（PI）为9.51，分子量为12 814.45。38个IysWRKY蛋白的脂肪系数均小于100，推断其为亲水蛋白，亚细胞定位预测结果表明38个IysWRKY都位于细胞核。

2.2 藏波罗花IysWRKY转录因子保守结构域分析

利用MEME在线软件对藏波罗花IysWRKY家族蛋白序列进行分析，结果如图1所示，共预测了10个保守基序，所有的IysWRKY蛋白序列都含有motif1、motif2、motif3，并且motif1和motif5中含有WRKY基因家族特征结构域WRKYGQK。IysWRKY1、IysWRKY3、IysWRKY4、IysWRKY27、IysWRKY34这5条序列中含有两个WRKY保守结构域，这一结果与多序列比对的结果（图2）相同。其余序列则只含有一个WRKYGQK保守结构域。所有38条序列中，仅IysWRKY15、IysWRKY16的保守七肽结构域存在变异，为WRKYGEK结构域，其余的为高度保守的WRKYGQK结构域。IysWRKY25、IysWRKY36两条序列存在变异的C-C-H-C锌指基序，剩余序列均为保守的C-C-H-H锌指基序。

2.3 藏波罗花IysWRKY转录因子基因系统进化树分析

选取了37条拟南芥WRKY基因序列同获得的38条藏波罗花WRKY基因进行多序列比对后构建系统发育树（图3）。参照拟南芥分类标准进行划分，38条WRKY序列被划分到Ⅱ类的最多，有24条。其中Ⅱ⁃a类2条、Ⅱ⁃b类3条、Ⅱ⁃c类10条、Ⅱ⁃d类2条、Ⅱ⁃e类7条。Ⅰ类有12条，其中IysWRKY1、IysWRKY3、IysWRKY4、IysWRKY27、IysWRKY34的分类结果与多序列比对结果相一致，这5条序列都包含两个保守的WRKYGQK结构域。剩余序列发现只存在一个完整的WRKYGQK结构域，可能是因为转录组测序和装配错误导致。Ⅲ类有IysWRKY25和IysWRKY36两条，这2条为C-C-H-C型锌指结构。

2.4 藏波罗花IysWRKY转录因子基因组织特异性表达分析

基于转录组数据，对藏波罗花根和叶IysWRKY转录因子基因的表达水平进行分析，并绘制聚类热图（图4）。分析发现有16条基因在根和叶中的表达存在显著差异。其中IysWRKY21、IysWRKY22、IysWRKY23、IysWRKY24、IysWRKY25、IysWRKY28、IysWRKY31、IysWRKY34、IysWRKY35、IysWRKY36在叶子中表达显著上调；IysWRKY3、IysWRKY5、IysWRKY9、IysWRKY11、IysWRKY18、IysWRKY33在根中显著上调。从表达量聚类热图上也可以看出，叶和根被分为两类。可见，IysWRKY转录因子基因在藏波罗花中存在显著的组织特异性表达。

2.5 实时荧光定量PCR验证

为了验证转录组数据的准确性，选取了5条WRKY转录因子IysWRKY3、IysWRKY8、IysWRKY24、IysWRKY28、IysWRKY33和内参基因GAPDH进行了qRT⁃PCR验证，结果如图5所示，大多数基因的表达模式与qRT⁃PCR结果相一致，表明RNA⁃seq测序结果准确可靠。

3 讨 论

藏波罗花属于角蒿属植物，分布于青藏高原海拔3 000~5 000 m的高山坡地中，是传统藏药“欧曲”的重要组成成分^［2］。其中单萜化合物作为角蒿属植物中重要的特征成分，在镇痛方面有显著的作用^［12］。而目前关于藏波罗花的研究，主要集中在药理作用和化学成分方面，关于其活性成分的合成和调控机制的研究还未见报道。因此，利用分子生物学方法，挖掘与单萜生物碱合成和调控相关的关键基因和转录因子，通过合成生物学等技术获取目的产物，以满足药用需求。

WRKY转录因子作为植物体内重要的转录因子家族，广泛参与植物生长发育和响应逆境胁迫等重要生理过程。通过其保守结构域与目的基因上的W⁃box结构域特异性结合，通过调控编码次生代谢产物的基因表达，进而调控植物体内次生代谢物的合成。研究发现，WRKY转录因子在调控药用植物萜类和生物碱次生代谢产物合成方面有重要作用。例如，在白木香中AsWRKY44转录因子能够与沉香倍半萜合酶的W⁃box结合，从而对沉香倍半萜合成进行调控^［13］。桂花中OfWRKY36的表达模式与单萜类代谢物的含量呈显著正相关^［14］。在应对环境胁迫方面，在拟南芥中，WRKY转录因子通过正向调控PDR8基因的表达来提高对镉的耐受性^［15］，在拟南芥中过表达小麦中相关的WRKY基因能够提高拟南芥的耐旱和耐热性^［16］。这表明WRKY转录因子在调控植物萜类次生代谢产物的合成以及应对环境胁迫方面有重要意义。

本研究首次从藏波罗花转录组数据中筛选出38条WRKY转录因子基因，进行多序列比对，将藏波罗花转录因子划分为三类，其中Ⅱ类最多共有24条，Ⅰ类12条，Ⅲ类最少有2条。这与拟南芥、柠条和木薯等植物中的WRKY基因家族分类数量排序相一致。从系统发育结果表明IIc亚类与Ⅰ类的WRKY转录因子聚在一个分支上，从进化层面分析，这两类WRKY转录因子可能有共同的起源，这与枇杷中WRKY转录因子分析结果一致^［17］。在鉴定出的38条WRKY转录因子中，IysWRKY15、IysWRKY16两条序列存在单个氨基酸变异的WRKYGEK结构域，而这种现象在拟南芥、番茄和橡胶树等多种植物中也存在，表明藏波罗花WRKY转录因子在长期进化过程中出现了多样性。研究发现，在多种植物中参与次生代谢产物的编码基因和转录因子的表达模式与植物体内次生代谢产物的分布显著相关^{［18，19］}。有研究表明，在拟南芥中AtWRKY18转录因子能够调节植物防御相关基因的表达，从而提高植物的抗病性^［20］；AtWRKY53转录因子能够通过调控气孔运动，从而增强植物耐旱性^［21］。这两条基因对应聚类在一个分支的，来自藏波罗花IysWRKY8、IysWRKY24和IysWRKY25转录因子也极有可能具备类似功能。在对藏波罗花最主要的两个部位叶和根中38条WRKY转录因子基因表达模式分析结果表明，其中叶和根被聚类为两类，其中10条基因在叶中显著表达上调。6条在根中显著上调。叶片直接暴露在环境当中，受到的高海拔强光辐射和温差变化的影响更为剧烈，为了适应这种极端环境，势必会在基因的表达调控和次级代谢物产物的积累方面做出不同的响应。而这些在不同部位差异表达的转录因子可能在植物适应环境和介导次生代谢产物合成方面有重要作用。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志-第六十九卷, 第一分册[M]. 北京: 科学出版社, 1990: 46⁃49.

[2] Editorial Board of Flora of China, Chinese Academy of Sciences. Flora of China (Vol. 69) [M].Beijing: Science Press, 1990: 46⁃49.

[3] 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志 [M] .西宁: 青海人民出版社, 1991: 463.

[4] Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences. Record of Tibetan Medicine [M].Xining: Qinghai People’s Publishing House, 1991: 463.

[5] Gao Y P, Shen Y H, Zhang S D, et al. Incarvilleatone, a new cyclohexylethanoid dimer from Incarvillea younghusbandii and its inhibition against nitric oxide (NO) release [J]. Org Lett, 2012, 14(8): 1954⁃1957.

[6] Pan W G, Jiang S P, Luo P, et al. Extracts from the roots of Incarvillea younghusbandii on antioxidant effects and life span prolonging in Drosophila melanogaste r [J]. Chin J Nat Med, 2012, 10(1): 48⁃52.

[7] 邹琼宇, 陈德力, 黄园园, 等. 角蒿属植物化学成分及药理活性研究进展[J]. 中草药, 2016, 47(3): 499⁃511.

[8] Zou Q Y, Chen D L, Huang Y Y, et al. Research progress in study on chemical constituents in plants of Incarvillea Juss. their pharmacological activities [J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(3): 499⁃511

[9] Yeshi K, Crayn D, Ritmejerytė E, et al. Plant secondary metabolites produced in response to abiotic stresses has potential application in pharmaceutical product development [J]. Molecules, 2022, 27(1): 313.

[10] Hoang X L T, Nhi D N H, Thu N B A, et al. Transcription factors and their roles in signal transduction in plants under abiotic stresses [J]. Curr Genomics, 2017, 18(6): 483⁃497.

[11] Mitsuda N, Ohme⁃Takagi M. Functional analysis of transcription factors in Arabidopsis [J]. Plant Cell Physiol, 2009, 50(7): 1232⁃1248.

[12] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends Plant Sci, 2000, 5(5): 199⁃206.

[13] Suttipanta N, Pattanaik S, Kulshrestha M, et al. The transcription factor CrWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus [J]. Plant Physiol, 2011, 157(4): 2081⁃2093.

[14] 黄辰昊. 穿心莲的中药资源鉴定及其萜类生物合成相关的WRKY TF家族基因的克隆与表达 [D]. 淮北: 淮北师范大学, 2019.

[15] Huang C H. Identification of traditional Chinese medicine resources of Andrographis paniculata and cloning and expression of WRKY TF family genes related to terpenoid biosynthesis [D]. Huaibei: Huaibei Normal University, 2019.

[16] Nakamura M, Chi Y M, Yan W M, et al. Structure⁃antinociceptive activity studies of incarvillateine, a monoterpene alkaloid from Incarvillea sinensis [J]. Planta Med, 2001, 67(2): 114⁃117.

[17] Sun P W, Xu Y H, Yu C C, et al. WRKY44 represses expression of the wound⁃induced sesquiterpene biosynthetic gene ASS1 in Aquilaria sinensis [J]. J Exp Bot, 2019, 71(3): 1128⁃1138.

[18] Ding W J, Ouyang Q X, Li Y L, et al. Genome⁃wide investigation of WRKY transcription factors in sweet osmanthus and their potential regulation of aroma synthesis [J]. Tree Physiol, 2019, 40(4): 557⁃572.

[19] Sheng Y B, Yan X X, Huang Y, et al. The WRKY transcription factor, WRKY13, activates PDR8 expression to positively regulate cadmium tolerance in Arabidopsis [J]. Plant Cell Environ, 2019, 42(3): 891⁃903.

[20] He G H, Xu J Y, Wang Y X, et al. Drought⁃responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis [J]. BMC Plant Biol, 2016, 16(1): 116.

[21] 李晓颖, 徐红霞, 陈俊伟. 枇杷WRKY转录因子鉴定与表达分析[J]. 园艺学报, 2019, 46(5): 939⁃954.

[22] Li X Y, Xu H X, Chen J W. Identification and expression analysis of WRKY transcription factors in Eriobotrya japonica [J]. Acta Hortic Sin, 2019, 46(5): 939⁃954.

[23] Zhang Y, Ji A J, Xu Z C, et al. The AP2/ERF transcription factor SmERF128 positively regulates diterpenoid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza [J]. Plant Mol Biol, 2019, 100(1): 83⁃93.

[24] Li Z X, Liu C, Zhang Y, et al. The bHLH family member ZmPTF1 regulates drought tolerance in maize by promoting root development and abscisic acid synthesis [J]. J Exp Bot, 2019, 70(19): 5471⁃5486.

[25] Chen C H, Chen Z X. Potentiation of developmentally regulated plant defense response by AtWRKY18, a pathogen⁃induced Arabidopsis transcription factor [J]. Plant Physiol, 2002, 129(2): 706⁃716.

[26] Sun Y, Yu D. Activated expression of AtWRKY53 negatively regulates drought tolerance by mediating stomatal movement [J]. Plant Cell Rep, 2015, 34(8): 1295⁃1306.

基金资助

中央引导地方科技发展资金项目(XZ202001YD0028C)