一株新海洋粘质沙雷氏菌产灵菌红素发酵条件优化

Fermentation optimization of a new prodigiosin⁃producing marine Serratia marcescens strain

摘要

灵菌红素是由微生物产生的一种红色次级代谢产物，因其具有抗菌、抗癌和抗疟疾等功效，受到了生物医药领域的广泛关注。微生物发酵是当前产灵菌红素的主要方法，分离筛选高产灵菌红素的微生物、优化发酵条件是提高灵菌红素产率的重要途径。本研究从深圳湾筛选出一株含有红色色素的菌株，并基于16S rRNA基因序列对该菌株进行了系统发育分析和物种鉴定。紫外可见光全波长扫描和HPLC⁃MS图谱分析证明，该菌株所产红色色素为灵菌红素。进一步通过单因素试验和正交优化法优化了该菌产灵菌红素的发酵条件和发酵培养基组分。系统发育分析表明，该菌株为一株海洋粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），并将其命名为S. marcescens SOCE 001。产灵菌红素的最佳发酵条件为：温度28 ℃、振荡培养转速220 r/min、培养基pH 7。发酵培养基最佳组合为：果糖添加量2 g/L、蛋白胨添加量10 g/L，MgSO₄添加量2 g/L。优化发酵条件后，经24 h培养， 灵菌红素产量可达2.468 g/L。

Abstract

Prodigiosin is a red⁃colored secondary metabolite naturally produced by diverse microbes， which has drawn much attention from the biomedical field due to its antimicrobial， anti⁃cancer and antimalarial activities. Prodigiosin is mainly produced by microbial fermentation， and selecting high⁃yield microbial strains or optimizing fermenting conditions are the two major approaches to improve prodigiosin production. In this study， we isolated a red pigment⁃producing strain from Shenzhen Bay， which was identified as Serratia marcescens based on 16S rRNA gene phylogenetic analysis. Ultraviolet⁃visible （UV⁃Vis） spectrophotometry and high performance liquid chromatography⁃mass spectrometry （HPLC⁃MS） confirmed that the red pigment was prodigiosin. To improve the yield of prodigiosin， the fermentation conditions and medium composition were further optimized using single factor and orthogonal experiments. Phylogenetic analysis revealed that this strain was a marine Serratia marcescens， and was named S. marcescens SOCE 001. The optimal fermentation conditions for prodigiosin production were at 28 ℃， with 220 rpm of shaking cultivation， and in a culture medium with pH 7. The optimal culture medium should be composed of 2 g/L of fructose， 10 g/L of peptone， and 2 g/L of MgSO₄. Under the optimized medium and culture conditions the yield of prodigiosin can reach 2.468 g/L after 24 h of culture.

Graphical abstract

关键词

粘质沙雷氏菌 / 次级代谢产物 / 灵菌红素 / 微生物发酵优化

Key words

Serratia marcescens / secondary metabolite / prodigiosin / microbial fermentation optimization

0 引 言

灵菌红素（prodigiosin）是一种微生物次生代谢产物，其分子式为C₂₀H₂₅N₃O，是一类具有三吡咯环骨架结构的脂溶性天然色素（图1）。众多研究表明，灵菌红素具有抗菌、抗癌、抗疟活性、免疫抑制活性等功能 ^［1~6］，在生物医药领域备受关注。研究表明，灵菌红素对多种癌细胞具有细胞毒性，是一种天然有效的抗癌物质^［6］；在抗疟疾方面，灵菌红素与奎宁有类似的抗疟疾效果；而在抗菌方面，灵菌红素对多种细菌具有抗菌活性，且对于革兰氏阳性菌的抑制效果要优于革兰氏阴性菌^［1~3］。此外，据报道灵菌红素还具有改善糖尿病等功效^［5］。灵菌红素主要由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、假单胞菌（Pseudomonas）及一些放线菌等产生^{［1； 6⁃8］}。灵菌红素几乎不溶于水，且对pH敏感，在碱性条件下呈黄色，而在酸性条件下呈红色 ^［4］。粘质沙雷氏菌常作为工程菌用来发酵产灵菌红素。

粘质沙雷氏菌是一种广泛存在于空气、土壤和水等环境中的兼性厌氧菌，呈球状或者短杆状。粘质沙雷氏菌是一种条件致病菌，对免疫力低下的人群表现出感染能力 ^［9］，大多数具有耐药性的致病性粘质沙雷氏菌不产生灵菌红素 ^［10］。目前灵菌红素的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法存在易形成同分异构体、体系稳定性较差、生产成本较高且合成工艺控制难度大等问题 ^［11］；微生物发酵产灵菌红素具有发酵产率稳定、条件温和、发酵条件易于控制、且不受季节和环境影响等优点。粘质沙雷氏菌是发酵生产灵菌红素的主要菌株^［12~14］，但存在产量不高、产品纯度较低、发酵底物成本高等问题。目前主要通过高产菌株筛选、诱变育种以及发酵条件优化等措施来提高灵菌红素的产量。据报道，以大豆油为碳源利用粘质沙雷氏菌发酵，灵菌红素产量达到2.98 g/L ^［15］。经过常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma， ARTP）诱变和筛选，有研究者得到了一株灵菌红素产量较高的粘质沙雷氏菌，灵菌红素产量可达（3.285±0.026） g/L ^［14］。通过单因素试验对24孔板发酵产灵菌红素条件进行了优化，灵菌红素产量达到了0.948 g/L ^［16］。有学者通过小型发酵罐进行发酵实验优化，灵菌红素产量在发酵14 h后最大可达1.21 g/L ^［17］。以虾蟹壳和鱿鱼须等海洋废弃物为原料，实现了粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素高达3.45 g/L ^［1］。据报道，在合适的碳、氮源和微量元素的发酵条件下，灵菌红素产量可达4.8 g/L ^［5］。粘质沙雷氏菌偏好利用油脂作为碳源，使用富含脂肪酸的橄榄油作为发酵底物进行优化后，灵菌红素最高产量可达6.011 g/L，相比优化前提升了2.845倍^［18］。

本研究从深圳湾海域筛选到一株产红色色素的菌株，经16S rRNA基因序列比对和系统发育分析等，鉴定该菌株为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。通过紫外全波长扫描及高效液相色谱质谱联用技术分析表征了该红色素的结构特征。为进一步提高灵菌红素的产量，本研究在实验室内通过单因素以及正交优化法，确定了该株粘质沙雷氏菌的最佳发酵参数和培养基组分，为应用于实际生产奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 海水样品

2021年12月在深圳湾下沙（北纬22°52′43″，东经114°01′30″）采集新鲜海水（叶绿素a浓度为5.8 µg/L）后，立即转移至无菌塑料容器内，于4 ℃低温运输到南方科技大学实验室用于海洋菌种分离培养。

1.1.2 培养基

菌种分离使用海生菌肉汤（Zobell Marine Broth 2216，ZMB）培养基，其主要成分为：每1 L培养基含有蛋白胨5.00 g，酵母提取物1.00 g，柠檬酸铁0.10 g，NaCl 19.45 g，MgCl₂ 5.90 g，Na₂SO₄ 3.24 g，CaCl₂ 1.80 g，KCl 0.55 g，NaHCO₃ 0.16 g，KBr 0.08 g，SrCl₂ 34.00 mg，H₃BO₃ 22.00 mg，Na₂SiO₃·9H₂O 4.00 mg，NaF 2.40 mg，NH₄NO₃ 1.60 mg，Na₂HPO₄ 8.00 mg，培养基最终pH约为7.6。

1.2 主要仪器与试剂

仪器设备：立式压力蒸汽灭菌器（Yamato，日本）；洁净工作台VS⁃840K⁃U（苏州安泰空气技术有限公司，苏州）；pH计（赛多利斯 ，美国）；梯度PCR仪（ABI，美国）；微量台式离心机（Thermo Scientific，美国）；超纯水机（力康，上海）；电泳仪和电泳槽（北京六一生物科技有限公司，北京）；超低温保存箱（海尔，青岛）；生化培养箱（上海一恒，上海）；紫外可见分光光度计（岛津UV2550，日本）；全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon，上海）；显微镜XSP⁃12CA（光学仪器，上海）。

试剂：菌株DNA提取试剂Chelex⁃100由BIO⁃RAD有限公司提供，PCR所用的2 ×Taq PCR Mastermix由北京天根生化科技有限公司提供。16S rRNA基因扩增用PCR通用引物（27F：5′⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3′；1492R：5′⁃GGTTACCTTGT2TACGACTT⁃3′），委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ZMB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，其他常规试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离纯化

用孔径为0.22 μm，直径为47 mm的硝酸纤维素膜过滤新鲜海水500 mL，然后在超净台内将滤膜无菌放置到ZMB培养基上。为尽可能避免环境微生物的污染，滤膜和转接过程在超净台内靠近酒精灯火焰操作。将转接后的培养平板置于恒温培养箱中于28 ℃静置培养3~7 d，挑选培养基上长出的红色单一菌落，在含有无菌ZMB培养基的平板上接种划线分离，随后置于恒温培养箱中28 ℃好氧静置培养24 h。如此重复划线分离培养3次，获得纯化的单菌落。将纯化后的菌株接种于ZMB琼脂斜面培养基，于28 ℃有氧培养24 h后置于4 ℃冰箱保存备用。取处于对数生长期的该菌株菌液1 mL，加入1 mL 50%的甘油混匀后，置于-80 ℃冰箱冻存保藏菌种。

1.3.2 菌株初步鉴定

①Chelex⁃100法快速提取待鉴定菌株的基因组DNA^［19］：采用Chelex⁃100快速提取待鉴定菌株的基因组DNA。在无菌1.5 mL离心管中加入0.5 mL 5%（w/V）的无菌Chelex⁃100溶液，用无菌接种环从ZMB固体培养基上挑取直径约0.5 cm大小的红色单菌落于该1.5 mL离心管中。在旋涡混合器上振荡5 s，100 ℃水浴10 min，冷却至室温后10 000 r/min离心10 min。取裂解液上清液作为PCR的模板，置于-20 ℃保存备用。

②16S rRNA基因扩增：将上一步提取的裂解上清液作为PCR模板进行扩增。25 μL反应体系包括1 mL PCR模板，12.5 μL 2×Taq PCR Master mix溶液，16S rRNA通用引物各1 μL （10 μmol/L），ddH₂O 9.5 μL。反应在PCR仪上进行，具体反应步骤为：首先在94 ℃下预变性1.5 min；然后进行30个循环的扩增，参数为94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min；最后再在72 ℃下延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用全自动数码凝胶图像分析系统观察，取扩增出约1.5 kb单一条带的样品进行Sanger测序（由上海生物工程有限公司完成）。将得到的16S rRNA基因序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线比对，选取核酸相似度在97%以内序列并手动去重后作为16S rRNA基因序列，使用muscle默认参数进行多序列比对和采用MEGA 10软件进行系统发育分析，确定菌株在系统发育分类学上的归属。

1.3.3 菌种的培养

①菌种活化与培养。将保藏于-80 ℃的菌种转接于ZMB培养基斜面，28 ℃培养24 h。将活化的斜面菌种接入装有50 mL ZMB培养基的250 mL平底锥形瓶，于28 ℃、200 r/min振荡培养24 h。

②生长曲线的绘制。将上述种子液以4%的接种量分别接入3组1 L ZMB培养基锥形瓶中，于28 ℃、200 r/min振荡培养。培养期间，每间隔2 h吸取4 mL发酵液置入无菌干燥的离心管中，以未接种培养基为空白对照，分别测定3组培养液600 nm处的OD值（OD_{600 nm}）。以培养时间作为横坐标，以OD_{600 nm}为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

1.3.4 灵菌红素的萃取与分离

将菌株发酵培养18 h后，发酵液于2 600 r/min条件下离心10 min，菌体沉淀经无菌蒸馏水重悬、再离心沉淀洗涤3次后，离心收集菌体。加入2倍于菌体体积的甲醇抽提，辅以超声波破碎10 min后，于2 600 r/min离心萃取灵菌红素。如此重复3次萃取过程，将上清抽提液合并后，置于黑暗处保存。抽提液经低温浓缩干燥至恒重后，称重，计算色素粗品产量。

1.3.5 灵菌红素的紫外全波长扫描

以甲醇溶液为溶剂将红色素配制成pH约为3的体系，采用紫外可见分光光度计在300~600 nm波长段每隔1 nm进行吸收光谱扫描。

1.3.6 灵菌红素的液质联用

使用正相液相色谱质谱联用仪（HPLC⁃APCI⁃MS； Agilent 1200 series）检测萃取得到灵菌红素⁃甲醇溶液中灵菌红素的纯度，配备APCI离子源（atmospheric pressure chemical ionization source），UPLC色谱柱（BEH HILIC columns， 2.1×150 mm， 1.7 μm， Waters）。使用正己烷和异丙醇（V_正己烷∶V_异丙醇=65∶35）作为流动相，在0.2 mL/min的流速下（进样体积为20 μL）等度洗脱后，于40 ℃和535 nm波长下检测10 min，并采用峰面积归一法确定灵菌红素的纯度。

1.3.7 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素培养条件优化

①最佳培养温度的确定。将2 mL对数生长期种子液接入装有50 mL ZMB无菌培养基的250 mL平底锥形瓶后，分别在20、24、28、32、37 ℃的培养温度和200 r/min的转速^{［14，15］}下培养12 h，每个温度条件设置3组平行。每隔2 h取样后分别测定600 nm和535 nm处的吸光值，以此测定粘质沙雷氏菌的生物量和发酵所产灵菌红素含量。

②最佳培养转速的确定。将2 mL对数生长期种子液接入装有50 mL ZMB培养基的250 mL平底锥形瓶后，分别设置160、180、200、220、240 r/min转速，基于上一步的结果，于28 ℃下摇床振荡培养12 h，每个转速3组平行。同上述方法测定菌体生物量和灵菌红素含量。

③培养基最佳pH对生物量和灵菌红素的影响。使用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH溶液将ZMB发酵培养基的pH分别调节为5、6、7、8、9后，分别装入250 mL锥形瓶中，接种2 mL处于对数生长期的种子液后，根据基于前2步的结果，置于温度为28 ℃、转速为220 r/min的摇床中振荡培养12 h。每个pH组设置3个平行样，同上述方法测定菌体生物量和灵菌红素含量。

1.3.8 粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素培养基成分优化

在ZMB基础培养基上，分别考察了碳源、氮源、无机盐离子对灵菌红素产量的影响，具体条件如下：

碳源：在每瓶100 mL种子培养基中，分别添加0.2 g蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉和0.2 mL甘油；

氮源：在每瓶100 mL种子培养基中，分别添加0.2 g蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾以及酵母粉；

无机盐：在每瓶100 mL种子培养基中，分别添加0.2 g KCl，NaCl，MgSO₄，CaCl₂，K₂HPO₄；

通过单因素试验在获得最佳碳源、氮源和无机盐的基础上，为进一步优化其最适添加量，分别设置了以下浓度梯度：2、5、10、15、20 g/L。培养基单因素优化实验，培养条件为：28 ℃、220 r/min培养，发酵24 h后取样后分别测定600 nm，535 nm处的吸光值以及发酵液pH。

2 结果与讨论

2.1 产红色色素菌株的分离与鉴定

2.1.1 产红色色素菌株的菌株形态

从近岸海水中经过筛选分离得到1株产红色色素菌株。将该产红色色素菌株在海生菌固体培养基上划线后形成红色蔓延形状，并最终将培养基染成红色（图2a）；该菌生长迅速，12 h左右就会生产红色单菌落，表面粘稠湿润，易挑取，有特殊气味；在显微镜下菌体呈短杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽胞（图2b）。

2.1.2 产红色色素菌株的16S rRNA分析

经PCR扩增、测序后得到约1 500 bp的16S rRNA基因。BLAST同源性检索结果表明，该16S rRNA基因与粘质沙雷氏菌PPM4的16S rRNA基因（JQ308604.1）具有最高的同源性（相似度99.93%）。将该菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已知的12个近源菌株进行多序列比对后，利用最大似然法（Maximum likelihood， ML）构建系统发育树（图3）。系统进化关系进一步表明，该菌株与粘质沙雷氏菌PPM4的进化关系最密切，故将其归类为粘质沙雷氏菌SOCE 001株（S. marcescens SOC E001）。并将该菌株16S rRNA基因序列提交到NCBI GenBank （Accession No：OP107019）。

2.2 紫外波长扫描分析

发酵培养基经甲醇浸提、分离纯化后得到红色色素（pH约为3），紫外⁃可见光（300~600 nm）吸收图谱分析表明，该红色色素在535 nm处有明显吸收峰（图4）。该色素紫外⁃可见光吸收图谱与文献中已报道的灵菌红素紫外吸收图谱一致，灵菌红素OD_{535 nm}值与灵菌红素浓度呈良好的线性关系，因此本研究采取检测上清液OD_{535 nm}值的方法来优化测定灵菌红素的产量 ^{［2， 20］}。

2.3 液质联用分析

灵菌红素为胞内脂溶性色素，使用超声破碎细胞处理，并使用甲醇为溶剂萃取灵菌红素常用于灵菌红素的抽提 ^［3，5］。本研究纯化后的灵菌红素经高效液相色谱串联质谱检测后发现，纯化的灵菌红素样品共出现9个色谱峰（图5），保留时间（retention time，RT）分别为RT1=1.08 min，RT2=1.23 min，RT3=1.42 min，RT4=1.59 min，RT5=1.91 min，RT6=2.76 min，RT7=3.14 min，RT8=3.49 min，RT9=3.66 min。峰面积所占比例分别为RTl≈0.082 2%，RT2≈8.626 4%，RT3≈8.518 2%，RT4≈57.180 7%，RT5≈19.380 2%，RT6≈3.541 2%，RT7≈0.653 8%，RT8≈1.203 1%，RT9≈0.814 1%。可知RT4为样品主峰，样品纯度约为57.18%。在ES+图谱中有m/z约为324.215 1［M+H］（图6），据此判断该色素的相对分子质量为323.48。通过LC/MS还可以得到离子碎片m/z≈252.115 5、m/z≈253.121 7、m/z≈309.188 9、m/z≈326和m/z≈354等，与报道的灵菌红素碎片数据基本一致^{［1，8，21，22］}。综上所述，HPLC/MS的结果均与灵菌红素数据一致，由此判定该红色素含有灵菌红素。

2.4 菌株的发酵特性

按照方法描述的ZMB培养基进行菌株培养，每隔2 h取样测定OD_{600 nm}，绘制得到粘质沙雷氏菌SOCE 001的发酵生长曲线（图7）。微生物种群的生长时期对其代谢活动具有重要的影响，一般选择处于对数生长期的微生物种子液进行发酵培养。从图7可以看出，0~6 h为SOCE 001的对数期，6~14 h为其稳定期，14 h后该菌株进入衰亡期。因此，该菌种适应性强，本实验采用培养4 h后处于对数期的种子液进行发酵培养，有利于缩短菌株的延滞期、提高菌种中后期活性及代谢产物产量。

2.5 粘质沙雷氏菌SOCE 001培养条件优化

粘质沙雷氏菌有较宽的生长温度范围，在4~37 ℃均能生长，发酵温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素有重要影响^［23］。由图8a可以看出，在20~28 ℃的范围内，菌株SOCE 001菌体生物量和灵菌红素随着温度的升高而增加，在28 ℃时生物量和灵菌红素产量达到最高。但当温度超过28 ℃后，菌体生物量和灵菌红素的产量随着温度的升高而减少，在37 ℃时只有少量红色色素产生。因此，菌株SOCE 001发酵产灵菌红素的最佳温度为28 ℃。这与已报道的粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素最佳温度相符合^{［7，8，14，15，18］}。粘质沙雷氏菌产灵菌红素的温度一般在4~28 ℃，与本研究结果相一致。虽然粘质沙雷氏菌能在37 ℃下快速生长，但在此高温度下基本不产灵菌红素^{［7，8，13］}。有研究表明，粘质沙雷氏菌在37 ℃时，灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶（PigF）、氧化还酶（PigN）和灵菌红素一些前体物质代谢的相关蛋白的表达水平都低于28 ℃时，可能与高温（37 ℃）抑制了灵菌红素合成相关酶的表达有关^［8，13］。

溶氧也是影响粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的重要因素。粘质沙雷氏菌虽然是兼性厌氧菌，但却只能在好氧培养时才能产生灵菌红素^{［11，24，25］}。由图8b可知，在摇床转速达到200 r/min之前，生物量和灵菌红素的产量随着摇床转速的增加而升高。当转速超过200 r/min时，生物量和灵菌红素的产量增长速度降低。灵菌红素产量和生物量在220 r/min时达到最大。当转速大于220 r/min时，生物量和灵菌红素的产量随着摇床转速的降低而略有降低。这可能与发酵过程中培养基中的溶解氧浓度相关，转速过低，发酵液溶氧不足，菌体生长缓慢，延长了发酵周期，也不利于灵菌红素的合成。因此，菌株SOCE 001发酵产灵菌红素的适宜摇床转速为220 r/min。灵菌红素合成与稳定期ATP的生产率呈线性关系，在高密度时，ATP迅速积累并且产生代谢产物灵菌红素 ^{［16，25］}。

灵菌红素的产量还受培养基pH的影响，大多数粘质沙雷氏菌可在pH值4~10的范围内生长 ^［25］。由图8c可知，在pH小于7时，生物量和灵菌红素的产量随着培养基pH的升高而增加；当pH大于7时，生物量和灵菌红素的产量随pH的升高而降低；灵菌红素产量和生物量均在pH 7时达到最大。这与之前报道的粘质沙雷氏菌相符合 ^{［17，25］}，pH 7时菌体生长速度最快，灵菌红素产量比其他pH条件下的产量高出32.1%^［26］。过于偏酸性或者偏碱性环境都会引起微生物表面电荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的吸收和离子化合物渗入细胞。另外，随着发酵的进行，粘质沙雷氏菌产生了较多的酸性物质，过于偏酸性的环境，不利于灵菌红素的积累，因此只有在最适pH值条件下才能大量合成灵菌红素^［27］。

2.6 发酵培养基最佳碳源、氮源和无机盐的筛选与浓度优化

不同种类和浓度的碳源、氮源和无机盐，对粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素也具有重要影响。碳源对灵菌红素的影响可以从3个方面进行考量，分别是菌体生物量、灵菌红素产量和对发酵液pH值影响^{［14，18，26］}。从图9a中可以看出，在微生物生长和灵菌红素产量方面，以果糖为碳源时，OD_{600 nm}值和OD_{535 nm}值最高，分别为2.35和1.03。有研究表明，葡萄糖会对灵菌红素产生一定的阻遏^{［18，22］}，而且以葡萄糖和淀粉为碳源时，发酵液pH呈碱性，此时灵菌红素的性质不稳定，故不能作为碳源进行使用。蔗糖、果糖和甘油为碳源时发酵液pH为中性，灵菌红素在中性或弱酸性环境下较稳定（图9b）。但以甘油为碳源时，灵菌红素的产量显著低于蔗糖和果糖作为碳源时的产量（图9a）。因此，综合考虑选择果糖作为该菌株发酵产灵菌红素的最佳碳源。

菌体的生长量、发酵液pH 和灵菌红素的产量均受果糖浓度的影响，因此需要进一步对果糖添加量进行优化。结果表明，灵菌红素的产量随着果糖的添加量增加而增高，并在添加量终浓度为5 g/L时达到最大，之后产量开始下降（图9c）。当蔗糖添加量过高时，不仅碳源未能被完全利用造成浪费，而且会导致发酵液pH过酸（图9d），不利于灵菌红素的性质稳定。因此，当蔗糖添加量终浓度为5 g/L时，最有利于菌株SOCE 001产灵菌红素。

不同种类的微生物生长代谢所需要的氮源种类和浓度有所不同。氮源包括有机氮源和无机氮源，有机氮源成分复杂，无机氮源成分单一^{［14，18］}。由图10a可以看出，不同无机和有机氮源对菌体生物量和灵菌红素产量具有明显的影响。添加KNO₃和蛋白胨为氮源时，菌株SOCE 001都能很好地生长。所有氮源添加后，发酵液pH均大于8（图10b），此时灵菌红素的性质不稳定，发酵液颜色偏浅粉色，导致灵红菌素含量偏低。特别是以牛肉膏和酵母膏作为为氮源添加时，灵菌红素的产量都很低（图10a），发酵液离心后上清几乎没有颜色。但所有氮源中，以蛋白胨为氮源时，菌体生物量和灵菌红素的产量最高。因此选择蛋白胨作为下一步实验优化的因素之一。

确定了蛋白胨作为最优的氮源后，还需要确定蛋白胨添加量对菌株SOCE 001发酵生产灵菌红素的影响。随着蛋白胨添加量的增加，生物量有一个明显的增加趋势（图10c），发酵液的pH有一个明显的下降趋势（图10d），这有利于灵菌红素的稳定，但是蛋白胨对灵菌红素产量的影响出现下降趋势。尤其是以蛋白胨添加量大于15 g/L时，灵菌红素的产量急剧下降，发酵液离心后上清成淡粉色。当蛋白胨添加量为2 g/L时，灵菌红素产量最高（图10c）。培养基中的碳/氮比是影响灵菌红素的合成的重要因素之一。当培养基的碳源不足，添加过多的氮源，可能有利于菌体生长，但是没有足够的前体物质刺激灵菌红素生成。只有在培养基中添加适量的碳氮源时，才有助于菌体的生长和灵菌红素的合成^{［25； 28］}。

不同无机盐对粘质沙雷氏菌生产灵菌红素有着不同影响。从无机盐单因素发酵结果（图11a）中可以看出，MgSO₄和CaCl₂可以促进微生物生长，且产生较高的灵菌红素。其他三种无机盐对菌体生长和灵菌红素的积累影响不明显。研究发现Ca²⁺和Mg²⁺均可显著提高菌株SOCE 001的灵菌红素产量，Na⁺和K⁺的作用对菌株发酵产灵菌红素的影响不大，这与之前研究报道一致^{［14；18］}。其原因可能是钙离子和镁离子不仅可以作为信号分子，同时可能与提高质膜的通透性有关，促进了发酵产物的释放，减少了细胞的负担，从而有利于色素的积累。如图11b所示，当添加Na⁺和K⁺时，发酵液pH为碱性，不利于发酵产物灵菌红素的稳定。故不能作为无机盐进行添加。添加MgSO₄或CaCl₂时，发酵液pH呈中性，此时灵菌红素的性质稳定。添加MgSO₄时，菌体生物量和灵菌红素的产量最高。故此选择MgSO₄作为下一步实验优化的因素之一。

不同浓度的MgSO₄添加量对灵菌红素产量的影响显示，低浓度的MgSO₄可促进灵菌红素的合成，当添加量超过10 g/L后，灵菌红素产量开始大幅下降（图11c），发酵液的pH 明显增加（图11d），这不利于灵菌红素的稳定。

2.7 正交条件优化

在单因素试验的基础上，通过L9（3³）正交试验分别对发酵条件和发酵培养基进行进一步的优化。试验因素水平设计及结果如表1和表2所示。对发酵条件从极差R分析，各因子对灵菌红素合成的效果由大到小依次为A>C>B；对发酵培养基组分从极差R分析，各因子对灵菌红素合成的效果由大到小依次为D>F>E。综合极差分析和灵菌红素产生量等分析结果，确定最佳发酵条件为：培养温度28 ℃、振荡培养转速220 r/min、培养基pH 7。最佳培养基组合为：果糖添加量2 g/L、蛋白胨添加量10 g/L，MgSO₄添加量2 g/L。根据正交试验结果，菌株SOCE 001按照最终优化好的培养基和发酵条件，发酵24 h后，灵菌红素产量可达到最大值2.468 g/L。菌株SOCE 001是一株具有生产应用潜力的灵菌红素高产菌株，其摇瓶发酵条件与文献报道一致，该粘质沙雷氏菌的实验结果可以为灵菌红素进一步放大发酵生产研究提供一定的参考。

3 结 论

本研究从海水环境中分离得到了一株产红色素的微生物，通过显微镜观察与16S rRNA基因序列比对和系统发育分析，证明该菌株与粘质沙雷氏菌具有较高的相似性（>99%），并将其归类为S. marcescens SOCE 001。本研究筛选出的粘质沙雷氏菌可以产生脂溶性次级代谢物，该代谢物在pH 3的甲醇溶液中呈红色，在535 nm波长处具有最大吸收峰；HPLC⁃MS图谱主要离子峰为324.215 1和325.214 2。据已有报道灵菌红素结构特征，推测该红色素为灵菌红素。通过单因素以及正交优化法对发酵条件和发酵培养基组分进行优化，确定本菌株产灵菌红素的最佳发酵条件为：温度28 ℃、振荡培养转速220 r/min、培养基pH 7。发酵培养基配方为最佳培养基组合为：果糖添加量2 g/L、蛋白胨添加量10 g/L，MgSO₄添加量2 g/L。在简单优化摇瓶发酵条件后，该菌株仅需培养24 h，灵菌红素产量提高到2.468 g/L。该菌株不仅发酵时间短、产量大，其所产灵菌红素单一，易于提取和纯化。此外，该菌株分离自海洋环境，可使用海生培养基进行发酵，从而降低发酵过程中环境微生物污染，对规模化、集约化快速生产灵菌红素具有重要的指导意义。

灵菌红素具有多种生理活性，其良好的应用前景使得它的合成和提取工艺成为目前的研究热点。在利用粘质沙雷氏菌发酵生产灵菌红素时，发酵生产用的菌种来源、发酵培养基的营养条件以及培养基中含有的不同碳氮比和金属离子等因素对最终灵菌红素的产量都十分重要。因此，首先筛选高产、稳产的工程菌进行灵红菌素的生产，提供合适的营养和发酵条件。最后，发酵过程中应时刻监测环境条件的变化以及灵菌红素的合成情况，并不断优化，以期为灵菌红素的工业发酵生产提供重要依据。

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基金资助

国家自然科学基金(91851210)

广东省基础与应用基础研究基金(2021B1515120080)

近海海洋环境科学国家重点实验室（厦门大学）访问学者与开放课题基金(MELRS2210)

前沿海洋技术三维一体环境监测实验教学示范中心(SJZLGC202111)