高粱磷脂酶D基因家族的鉴定和表达分析

Identification and expression analysis of phospholipase D gene family in Sorghum bicolor

摘要

磷脂酶D（PLD）是植物生长和胁迫反应过程中参与膜磷脂分解代谢的关键酶。PLD编码基因在高等植物中构成了一个大的基因家族，但是仍未对高粱PLD基因家族进行深入研究。本研究中，通过全基因组分析，鉴定了15个PLD基因，并分成6个亚组，初步揭示了SbPLDs的基因结构、保守结构域、染色体定位和系统发育关系等信息。基因复制的研究表明，片段复制在高粱PLD基因家族的扩展中发挥了重要作用，SbPLDs在进化过程中经历了强烈的纯化选择。此外，转录组数据表明，受启动子区上游顺式元件调控的PLD家族基因可能在高粱的生长发育中发挥重要作用。通过real⁃time PCR分析，显示部分SbPLDs参与非生物胁迫和激素途径的潜力。亚细胞定位表明，高粱PLD蛋白在细胞质中富集，可能具有抗逆胁迫的功能。本研究为了解高粱PLD基因的特征提供了理论参考，为研究高粱PLD基因家族的进化提供了新的视角，也为阐明高粱PLD基因家族的功能提供了基础信息。

Abstract

Phospholipase D（PLD）is a key enzyme involved in membrane phospholipid catabolism during plant growth and stress response. PLD encoding genes constitute a large gene family in higher plants. However， PLD gene family has not been studied in Sorghum bicolor. Through genome⁃wide analysis， a total of 15 PLD genes were identified and divided into six subgroups. The information of gene structure， conserved domains， chromosome location and phylogenetic relationship of SbPLDs were preliminarily revealed. Gene duplication showed that segmental duplications play a significant role in expansion of PLD gene family in sorghum， and SbPLDs have experienced purifying selection during the evolution process. Furthermore， transcriptome data demonstrated that PLD family genes， regulated by the upstream cis⁃elements in promoter areas， may play important roles in growth and development of sorghum. By real⁃time PCR， some SbPLDs show the potential in participating abiotic stress and hormone pathways. Subcellular localization indicated that SbPLDs in cytoplasm may have biological functions in stress resistance. This study provides a theoretical reference for understanding the characteristics of PLD genes in sorghum， and new insights into the evolution and basic information that will assist in elucidating the functions of PLD gene family in sorghum.

Graphical abstract

关键词

高粱 / 磷脂酶D / 基因复制 / 非生物胁迫 / 亚细胞定位

Key words

Sorghum bicolor / phospholipase D / gene duplication / abiotic stress / subcellular localization

0 引 言

磷脂是细胞膜的主要成分，也是产生细胞介质的丰富来源，这些介质参与植物对非生物胁迫的响应^［1］。在大多数真核细胞中，磷脂酶是水解膜磷脂的关键酶，导致次级信使的形成。这些磷脂酶分为四大类，包括磷脂酶A1（PLA1）、磷脂酶A2（PLA2）、磷脂酶C（PLC）、磷脂酶D（PLD）^［2］。磷脂酶D（PLD）被认为是切割磷脂中磷酸二酯（磷-氧）键的主要成分，其作用底物如磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），这导致游离极性头基和磷脂酸（PA）的形成^［3］（附图S1）。PA还可以通过与蛋白质的直接相互作用发挥信号分子的功能，将调节因子募集到膜上，并影响各种生物过程^［4］。在植物中，PLDs和PA已经成为参与生长、发育和应激反应调节的关键分子^［5］。

第一个PLD基因于1994年从蓖麻中被克隆出来^［6］。迄今为止，已在拟南芥^［7］，大豆^［8］，甘蓝型油菜^［9］，鹰嘴豆^［10］，茶树^［11］，葡萄和杨树^［12］，水稻^［13］，玉米^［14］，亚洲棉^［15］及异源四倍体棉花^［16］等物种中报道了PLD基因家族的全基因组鉴定。在双子叶植物拟南芥、大豆和甘蓝型油菜中，PLD基因分为6个亚组，包括α，β，γ，δ，ε和ζ；而在单子叶植物水稻中，PLD基因家族分为α，β，δ，κ，ζ和φ^{［7~9，13］}。生物化学研究表明，不同PLD亚型具有不同的反应要求和底物选择性^［17］。所有的PLD在C⁃末端都含有两个高度保守的HxKxxxxD（HKD）结构域（附图S2），它们可以相互作用形成催化活性位点^［18］。根据N⁃末端序列和结构域的差异，植物PLD可分为C2⁃PLD、PX/PH⁃PLD和SP⁃PLD三个亚家族。在大多数真核植物中，C2⁃PLD亚家族中的成员包含约130个氨基酸的钙依赖性磷脂结合C2结构域^［19］，而PX/PH⁃PLD成员包含非钙依赖性phox同源性（PX）^［20］和pleckstrin同源性（PH）^［21］结构域。只有属于SP⁃PLD亚家族的PLDφ在少数植物（包括水稻、棉花、葡萄和杨树）的N⁃末端含有信号肽（SP）^［22］。PLD蛋白的亚细胞定位对于理解其功能非常重要。有研究表明，大部分PLD成员定位于质膜，只有少数成员定位于细胞膜上以及细胞质中^{［10，23~26］}。

脱落酸（ABA）和高渗胁迫会刺激PLD基因的转录^{［27，28］}。据报道，包括干旱、盐度和冷冻在内的高渗胁迫会激活PLD，从而导致PA的产生，来介导许多细胞功能，以避免高渗胁迫的不利影响^{［29，30］}。PLD基因在大多数高等植物中也具有不同的细胞和分子功能。例如，调控PLDα1的表达，可以正调节植物对盐和干旱胁迫的反应，因为抑制PLDα1的植物对干旱诱导的气孔关闭和盐胁迫更敏感^{［26，29，31］}。而在甘蓝型油菜和水稻中，PLDα1的过表达也导致作物失水减少和严重缺水条件下的耐受性增强^{［32，33］}。PLDα3的敲除和过表达改变了植物对盐度和水分缺乏的敏感性^［34］。PLDδ位于质膜^［24］，具有较高的抗氧化酶活性，并在抗冻性中起着至关重要的作用^［25］。在拟南芥中，PLDδ在油酸刺激下被激活，水解膜磷脂产生PA，减少H₂O₂诱导的细胞死亡^［35］。然而，在ABA介导的气孔关闭中，PLDδ位于NO和H₂O₂产生的下游来发挥信号分子的功能^［36］。尽管如此，PLDδ也被认为是维持植物细胞顶端生长时各种膜运输过程之间平衡的至关重要的调节因子^［24］。此外，PLDα和PLDδ还参与棉花局部和全身伤口信号的传导^［37］。在水稻中，PLDβ1通过激活SAPK来抑制种子萌发过程中GAmyb的表达，从而刺激ABA信号^［13］。此外，水稻PLDφ的过表达导致抽穗时间延迟，抑制或缺乏导致水稻在短日照和长日照条件下提早抽穗^［22］。总之，PLD基因作为关键酶参与不同的生物过程，如植物发育，免疫反应和非生物胁迫。

高粱是世界上最重要的经济作物之一。虽然高粱通常被认为是耐受的，但在大多数发展中国家，非生物胁迫仍然严重阻碍其产量和营养质量^［38］。在高粱中，PLD部分调节磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPCase⁃k）的合成，通过复杂的信号转导链被盐度和干旱胁迫激活^［39］。尽管高粱中关于PLD一般机制的研究已有报道，并且2009年完成了高粱的全基因组测序^［40］，但高粱中PLD基因家族（SbPLD）的全基因组鉴定和详细信息仍然缺乏。因此，在本研究中，我们对高粱中的PLD基因家族进行了全面的分析。这些结果将有助于了解PLD基因家族的基本信息，并为理解SbPLD基因在生长发育和非生物胁迫中的特殊生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

粒用高粱品种BTx623从三峡大学生物技术研究中心收集。将BTx623种子种植在营养土（腐泥土和蛭石的混合物，质量比为2∶1）中，并在自然光（28 ℃，光照时间16 h）下生长。

1.2 基因组筛选和序列获取

从JGI数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下载拟南芥、水稻和高粱的基因组、蛋白质组和GFF3文件。根据模式植物拟南芥和水稻中所有PLD成员的公开ID，通过TBtools软件提取相应的蛋白质序列，分别对高粱蛋白质数据库（高粱V3.1.1）进行BLASTP搜索^［41］。同时，来自Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/family/PF00614/hmm）的HKD结构域（PF00614）的隐马尔可夫模型（HMM）也被用于HMMER（v3.1b2）检索于高粱蛋白质数据库，获得e值< 1e-10的高粱PLD序列^［42］。通过结合这两种筛选，所有候选PLD序列被SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进一步验证。所有SbPLDs的蛋白质序列通过ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）来预测总平均亲水性（GRAVY）、分子量（Mw）和等电点（pI），并使用CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）来预测它们的亚细胞位置。

1.3 多重序列比对和结构域分析

拟南芥、水稻和高粱所有的PLD蛋白序列被在线工具MAFFT version 7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）和MUSCLE（http：//www.drive5.com/muscle/）分别以默认参数进行多序列比对分析。此外，高粱的HKD结构域使用MAFFT version 7进行比对，并通过Jalview软件显示。

1.4 系统进化树构建

采用邻近归并法（Neighbor⁃Joining，NJ）在MEGA⁃X程序中对高粱、拟南芥和水稻PLD基因推导的氨基酸序列进行系统进化树的构建。随后，分别使用MEGA⁃X的最大似然和最小进化方法来验证NJ方法的结果。

1.5 PLD基因的选择压力分析

利用TBtools获得高粱、拟南芥和水稻所有PLD基因的全基因组内和基因组间复制文件以及详细的物理位置信息。Ka/Ks>1、<1或=1分别表示阳性、阴性（纯化选择）和中性进化。所有来自拟南芥、水稻和高粱的PLD基因编码序列通过DnaSP v6（DNA Sequence Polymorphism v6.12.03）软件计算Ka与Ks的比值。

1.6 基因结构分析和染色体定位

利用TBtools分别从高粱基因组和GFF3文件中提取所有PLD基因的染色体长度和位置信息。MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）用于显示PLD基因在高粱染色体上的分布。

1.7 启动子顺式作用元件预测分析

使用Plant CARE数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析15个SbPLDs的启动子序列（起始密码子“ATG”上游2 kb）来预测顺式作用调控元件。此外，植物激素和胁迫响应元件通过Gene Structure Display Server GSDS_2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）可视化。

1.8 RNA测序数据分析

在高粱整个生长发育期间收获不同的组织样本，提取每个样本的总RNA进行高通量RNA测序（RNA⁃seq）。将测序结果使用Cufflinks软件通过每百万映射读数外显子模型的每千碱基片段数（FPKM）计算每个基因的转录本丰度。从中提取SbPLDs的转录本丰度，换算成log₂（FPKM）值，用TBtools生成热图。

1.9 高粱幼苗的培养、非生物胁迫和植物激素处理

本研究所用植物材料于26 ℃、光照16 h和黑暗8 h的温室中培养。将表面灭菌的高粱BTx623种子在湿培养皿中萌发3天。萌发后，将健康的幼苗移植到水培盒中培养9天。在第13天早上8：00，分别用20%PEG⁃8000、25 μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl在4 ℃处理BTx623幼苗（4 ℃处理时光照强度与温室相同）。对照组和实验组分别在0、1、6和12 h采集叶片样品，液氮速冻并保存于-80 ℃冰箱。两组在每个时间点收获三个生物学重复。

1.10 总RNA提取、cDNA合成和qRT⁃PCR分析

用总RNA提取试剂提取每个样品的总RNA，并用氯仿、异丙醇和75%乙醇纯化RNA。M-MLV（H-）逆转录酶用于cDNA合成。使用由Integrated DNA Technologies（https：//sg.idtdna.com/pages）设计的引物，通过qRT⁃PCR进行基因表达分析。使用高粱actin⁃1作为内参，利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行qRT⁃PCR。每个样品进行三次技术重复，并使用2^{-（△△Cq）}方法分析数据。用PASW Statistics 18软件进行方差分析（ANOVA），使用Duncan方法在0.05和0.01水平比较最小显著差异（LSD）。

1.11 亚细胞定位

将不含终止密码子的SbPLDα1⁃7和SbPLDφ的cDNA序列克隆到PLS9⁃35S⁃eGFP载体中用于亚细胞定位分析。以PLS9⁃35S⁃eGFP载体为对照，将获得的PLS9⁃35S：：SbPLDs⁃eGFP载体转化到高粱原生质体中。在26℃避光培养14小时后，使用倒置荧光显微镜拍照分析。

2 结果与分析

2.1 高粱PLD基因家族的鉴定

利用生信方法在高粱基因组中鉴定出15个PLD基因，在本研究中，我们根据它们与拟南芥和水稻同源基因的关系，将它们命名为SbPLDα1~SbPLDα7、SbPLDβ1~SbPLDβ2、SbPLDδ1~SbPLDδ2、SbPLDκ、SbPLDζ1~SbPLDζ2和SbPLDφ（表1）。15个SbPLDs的蛋白质长度从516（SbPLDφ）到1 168（SbPLDζ1）个氨基酸，开放阅读框长度从1 551（SbPLDφ）到3 507 bp（SbPLDζ1）。这些SbPLDs的预测分子量介于57.79（SbPLDφ）至133.48（SbPLDζ1）kDa之间，等电点介于5.40（SbPLDα5）至8.28（SbPLDκ）之间。由于它们的总平均亲水性值（GRAVY）均小于零，所有的SbPLDs都被预测为亲水性蛋白质。根据亚细胞定位预测，大多数SbPLDs定位在细胞质中（表1）。

2.2 SbPLDs的系统发育和保守结构域分析

为了研究高粱、拟南芥和水稻中PLD基因的系统发育关系和进化关系，15个SbPLDs、12个AtPLDs和17个OsPLDs被用来构建一个无根系统发育树（图1）。根据该进化树，所有高粱PLD蛋白被分为C2⁃PLD，PX/PH⁃PLD和SP⁃PLD三个亚家族。所有的PLDα、PLDβ、PLDδ、PLDε、PLDγ和PLDκ成员都被归为C2⁃PLD亚家族，而SP⁃PLD亚家族包含2个PLDφ成员，PX/PH⁃PLD亚家族包含6个PLDζ成员（图1）。有趣的是，PLDγ和PLDε仅在拟南芥中被检测到。所有的SbPLDs在每个亚组中都与OsPLDs有很高的相似性，这表明SbPLD基因的进化分歧可能发生在一个共同的双子叶和单子叶祖先出现之前。所有SbPLDs在C⁃末端含有两个HKD结构域，而N⁃末端的结构域却发生了改变，如SbPLDα、SbPLDβ、SbPLDδ和SbPLDκ亚型包含C2结构域，SbPLDζ亚型包含PX/PH结构域，SbPLDφ亚型含有信号肽（SP）（附图S3）。这一结果与拟南芥和水稻中的结果一致，表明SbPLDs与其他植物中的PLD基因功能相似。

2.3 SbPLDs的基因结构和染色体定位分析

基于预测的序列，确定每个SbPLD获得的cDNAs和外显子⁃内含子结构（图2A）。SbPLDs具有随机数目的外显子，例如，观察到2个外显子（SbPLDα2）、3个外显子（SbPLDα1、SbPLDα3、SbPLDα4和SbPLDα5）、4个外显子（SbPLDα6、SbPLDα7和SbPLDκ）和10个外显子（SbPLDβ1、SbPLDβ2、SbPLDδ1和SbPLDδ2）。有趣的是，2个SbPLDζ有20个外显子（SbPLDζ1和SbPLDζ2），而剩余的SbPLDφ有7个外显子（表1和图2A）。高粱中不同PLD亚型的成员显示出与其他植物（如拟南芥和水稻）相似的外显子/内含子结构。通过与拟南芥和水稻中PLD基因的比较，SbPLDs的外显子/内含子结构与OsPLDs更相似，这或许表明PLD基因在单子叶与双子叶植物之间存在差异。

为了研究基因在染色体上的分布，通过标记染色体坐标将SbPLDs定位在高粱染色体上。所有PLD基因分布在高粱10条染色体（除了6号和7号染色体）中的8条染色体上（图2B）。在1号和2号染色体上，SbPLDβ1/SbPLDβ2和SbPLDδ1/SbPLDδ2都聚集在同一条染色体上，并具有相似的外显子/内含子结构模式。PLD基因在不同的植物物种中被认为是串联或片段复制的。因此，SbPLDβs和SbPLDδs可能是串联重复对。SbPLDζ基因位于3号和9号染色体上，SbPLDκ和SbPLDφ分别位于4号和10号染色体上（图2B）。有趣的是，所有7个SbPLDα基因随机分布在高粱的7条染色体上，而在其他植物物种中存在串联的PLDα簇。例如，水稻中的PLDα3⁃PLDα4⁃PLDα5簇，鹰嘴豆中的PLDα3⁃PLDα4簇，玉米中的PLDα3⁃PLDα4簇和PLDα5⁃PLDα6簇。这表明高粱PLD基因可能具有不同的进化模式。

2.4 SbPLDs的基因复制和选择压力分析

为了评估基因复制对高粱PLD基因家族扩展的贡献，用TBtools分析了拟南芥、水稻和高粱的全基因组文件和基因结构注释文件。除了PLD基因家族外，所有的基因复制事件都被过滤掉（图3）。在高粱基因组内总共发生了4次复制事件，包括3次片段复制（SbPLDα2/SbPLDα5、SbPLDα3/SbPLDα5和SbPLDζ1/SbPLDζ2）和1次串联复制（SbPLDβ1/SbPLDβ2），涉及C2和PX/PH两个亚家族的7个基因（附表S1）。然而，在拟南芥和水稻中仅分别发生了1次和3次复制事件，并且它们都是片段复制。因此，与串联复制相比，片段复制在高粱PLD家族的扩展中起着重要作用。此外，在高粱与水稻以及高粱与拟南芥的基因组间分别发生了20次和3次复制事件（图3和附表S1）。这一结果表明高粱与水稻的亲缘关系比拟南芥更近。基于物种间的基因复制事件，我们推测PLD基因家族可能起源于一个共同的祖先。在进化过程中，PLD基因通过复制从一个物种传递到另一个物种。为了探索基因复制事件后是否有选择压力作用于SbPLDs的编码序列，我们计算了高粱中复制的PLD基因对的Ka/Ks比值（非同义替换率比同义替换率）。所得的成对比较数据显示，所有的SbPLDs的Ka/Ks比值< 1（表S1），表明复制的SbPLDs经历了强大的纯化选择压力。由于选择压力不足以改变SbPLDs的蛋白序列（即核苷酸序列中碱基发生非同义替换的概率小于同义替换的概率），所以高粱PLD基因家族在进化中是十分保守的。

2.5 SbPLDs启动子中顺式作用元件的分析

为了理解SbPLDs的潜在调控作用，利用Plant CARE对15个SbPLDs的上游序列进行顺式作用元件预测（表S2）。发现一些与非生物胁迫以及植物激素相关的顺式作用元件（图4），如防御和胁迫响应元件（TC⁃rich repeats），非生物胁迫响应元件（W box），低温响应元件（LTR），干旱诱导性元件（MBS）以及伤口响应元件（WUN⁃motif）；脱落酸响应元件（ABRE），茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif和TGACG⁃motif），水杨酸响应元件（TCA-element），乙烯响应元件（ERE），赤霉素响应元件（P⁃box、GARE⁃motif和TATC⁃box）和生长素响应元件（TGA⁃element和AuxRR⁃core）。其中，脱落酸能提高植物对干旱等不良环境条件的适应能力，而茉莉酸甲酯能够诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。因此，我们推测当高粱生长过程中面临不利的环境压力时，这些非生物胁迫响应元件以及脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件能够调控PLD基因的表达，帮助高粱抵御逆境。

2.6 SbPLDs的表达模式分析

为了进一步研究SbPLDs基因在植物生长和发育期间的潜在功能，通过我们先前的发育RNA⁃seq数据库分析了所有15个SbPLDs的表达谱（图5）。该RNA⁃seq数据分析了高粱具有代表性的10个不同组织和器官，包括种子、胚芽鞘、胚根、根、茎、叶、穗、雌蕊、雄蕊和未成熟胚。热图显示，每个SbPLD都有不同的表达模式。例如，SbPLDα5除了在雄蕊（80 d）中维持中表达，在其他所有组织中都高表达。然而，SbPLDκ在所有组织中均未检测到。此外，部分基因只在特定组织中表达，如SbPLDα7在茎（65 d）和雄蕊（80 d）中特异性高表达，而在茎（95 d）中维持中表达。SbPLDα2和SbPLDβ2有相似的表达模式，且二者分别在雄蕊（80 d）中特异性高表达和中表达。SbPLDα6在幼叶（12 d）和成熟叶（95 d）中特异性高表达，而在其他所有组织中都低表达。SbPLDα1在胚根（3 d）中特异性高表达，而在根（7 d）中维持中表达。SbPLDβ1在幼叶（12 d）和成熟叶（65~95 d）中特异性高表达，而在其他所有组织中都中表达。而SbPLDδ1在穗（80 d）和雌蕊（80 d）中特异性高表达，在其他所有组织中都中表达。SbPLDα3在成熟叶（95 d）中特异性高表达，在茎（65 d）中维持中表达，而在其他所有组织都低表达。SbPLDα4在胚根（3 d）和成熟叶（95 d）中维持中表达。有趣的是，SbPLDφ分别在幼嫩组织12 d（根和叶）和成熟组织95 d（根和叶）中维持中表达，其他所有组织都低表达。而SbPLDδ2、SbPLDζ1和SbPLDζ2在所有组织中都低表达（图5）。这些SbPLDs不同表达模式的结果表明SbPLDs在高粱不同发育阶段和组织中的潜在重要作用。

为了进一步验证SbPLD在非生物胁迫和激素处理下的表达模式，对所有15个SbPLDs进行qRT⁃PCR分析（图6）。结果显示，一些SbPLD基因在不同的处理条件下被显著诱导或抑制。例如，在干旱胁迫处理下，SbPLDα5、SbPLDδ1、SbPLDζ1、SbPLDζ2和SbPLDφ的表达量显著上调（图6A）。而在盐胁迫下，SbPLDα1、SbPLDα3、SbPLDα4和SbPLDφ的表达量显著上调，但SbPLDα6的表达量却显著下调（图6B）。此外，SbPLDα6、SbPLDα7、SbPLDβ2、SbPLDδ1和SbPLDφ的表达量在冷胁迫下显著下调（图6C）。有趣的是，在ABA处理下，SbPLDα1和SbPLDζ1的表达量显著下调，但SbPLDα4、SbPLDα5和SbPLDδ1的表达量显著上调（图6D）。这些结果表明，SbPLDs参与高粱对非生物胁迫的响应，并且部分基因在不同非生物胁迫条件下被正调控或负调控。不同的抗逆响应暗示了SbPLDs在非生物胁迫和激素信号中具有重要的调节作用。

2.7 SbPLDs的亚细胞定位分析

通过PCR获得SbPLDs的全长开放阅读框，并将它们重组进瞬时表达载体PLS9中。在高粱原生质体细胞中成功检测到8个SbPLDs的荧光信号（图7）。亚细胞定位结果表明，SbPLDα1、SbPLDα2、SbPLDα3、SbPLDα4、SbPLDα5、SbPLDα6、SbPLDα7和SbPLDφ均在细胞质中。

3 讨 论

非生物胁迫是严重降低植物产量的主要环境威胁^［43］。在田间条件下，植物容易受到干旱、寒冷、高盐以及炎热等非生物胁迫的影响^［44］。而PLD在植物对各种非生物胁迫的信号反应中发挥着关键作用。在本研究中，我们通过全基因组分析，在高粱中鉴定了15个PLD基因，并系统地研究了这些PLD基因的结构和功能。基于我们的结果，所有SbPLD基因被聚为6类（α、β、δ、κ、ζ和φ）（图1）。这些不同的亚组表明PLD家族的多样性和高度复杂性。基因结构分析显示，同一亚家族中的SbPLD基因具有相似的基因结构，这不仅在一定程度上支持了我们对亚组的分类，而且表明一个亚家族的所有成员在进化上是接近的（图1）。外显子数目的不同表明它们在长期进化过程中可能经历了更强的部分分化（图2A和表1）。然而，基因组复制事件被认为是在植物进化过程中发生的，基因家族的扩展和基因组进化机制主要依赖于基因复制事件。主要复制方式为串联复制和片段复制。我们的结果表明，片段复制可能对高粱中PLD家族的扩展做出更大的贡献（图3和附表S1）。基因表达谱的分析可以为理解其潜在的生物学功能提供重要线索。

本研究观察了高粱从营养生长到生殖生长的全过程（图5）。PLDs在高粱中的时空差异表达揭示了它在高粱的生长发育中起着重要的作用。基因启动子区域的顺式调控元件在决定基因的组织特异性和胁迫应答中具有重要作用，这可能有助于阐明PLDs的转录调控和潜在功能。在SbPLDs的启动子区域发现了几种顺式作用元件，这表明PLDs可能受光、胁迫和植物激素的调节（附表S2）。对于绝大多数SbPLDs来说，除了优先表达的基因之外，应激反应元件分布更为广泛，这解释了为什么大多数SbPLDs在正常生长条件下表现出相对低或弱的表达水平（图5）。而不利的环境刺激，如干旱、盐、寒冷和脱落酸，可能会触发大多数低表达或弱表达的SbPLDs的高水平转录，这是因为许多特定元件（MBS、W box、LTR和ABRE）位于这些基因的启动子中（图4）。因此，我们假设SbPLDs在适应不利的环境刺激中也可能具有重要的功能。为了证实这个猜想，我们对高粱幼苗进行了四种不同的处理。qPCR结果显示大多数SbPLD基因具有显著的差异表达（图6）。有趣的是，单个基因同时受到多种压力的诱导。例如，SbPLDα1在盐处理下表达上调，而在脱落酸处理下表达下调。干旱和脱落酸处理下，SbPLDα5和SbPLDδ1表达上调，而4 ℃下SbPLDδ1表达下调。在干旱和盐处理下，SbPLDφ的表达上调，在4 ℃下表达下调。SbPLDζ1在干旱刺激下表达上调，在脱落酸处理下表达下调。这些结果表明PLD参与了一个复杂的交叉调控网络，并且其成员在各种不利条件下表现出协同或拮抗调节。总之，复杂多样的转录调控和瞬时表达极大地拓宽了我们对高粱PLDs功能多样性的认识和理解。

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基金资助

农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室开放基金(2021ZTSJJ7)