一个蚕豆病遗传家系G6PD基因突变及X染色体失活偏移检测

Detection of G6PD gene mutation and skewed X chromosome inactivation in a genetic family with favism

摘要

对一蚕豆病遗传家系的G6PD基因突变进行分析，检测突变后G6PD酶活变化，并对先证者家系进行X染色体失活（XCI）偏移模式检测，从而预测G6PD突变女性携带者患蚕豆病的风险。取家系成员的外周血样，并提取基因组DNA，用聚合酶链式反应（PCR）和DNA测序法进行序列分析，确定先证者突变位点和突变类型及家庭成员遗传情况，若先证者的母亲和姐姐为G6PD突变携带者，则对先证者母亲和姐姐进行X染色体偏移检测以及酶活检测分析，以评估携带者患蚕豆病的风险，同时对研究对象进行随访。结果患者X染色体上G6PD基因发生点突变c.1376G>T；酶活性检测结果显示该突变使G6PD酶活性下降大约25%，导致蚕豆病发生。该家系的两位女性携带者X染色体失活偏移<80%，未来发生蚕豆病的可能性低。

Abstract

To analyze the mutation of the G6PD gene in a genetic family with favism， and detect the change of G6PD enzyme activity and the skewed X⁃chromosome inactivation （XCI） mode of the proband family， to predict the risk of favism in females carriers with G6PD mutation， peripheral blood samples of family members were collected and genomic DNA was extracted. PCR and DNA sequencing methods were used for sequence analysis to determine the mutation sites and mutation types of probands and the genetic status of family members. If the mother and sister were heterozygotes of G6PD mutation， skewed X⁃chromosome inactivation detection and enzyme activity analysis were performed for them to assess the risk of favism in the carriers， and the study subjects were followed up. As a result， the point mutation of G6PD gene on patient X chromosome c.1376G>T； the results of enzyme activity test showed that the mutation reduced the activity of G6PD by about 25%， leading to the occurrence of favism. The X chromosome inactivation deviation of the two female carriers in this family is less than 80%， so the possibility of favism in the future is low.

Graphical abstract

关键词

蚕豆病 / G6PD突变 / 酶活性 / X染色体失活偏移

Key words

favism / G6PD mutation / enzymatic activity / skewed X⁃chromosome inactivation

0 引 言

葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase， G6PD）缺乏症是一种由管家基因G6PD的有害突变引起的X连锁隐性（或X连锁不完全显性）遗传病，全球估计有5亿人受累，G6PD突变分布具有典型的种族及地域差异^［1］。G6PD是磷酸戊糖途径的关键酶，用于产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）以维持细胞内适当的还原环境，在红细胞中尤为重要^［2］。因此G6PD的功能障碍可导致红细胞处理氧化应激的能力下降。这种功能障碍是由多种突变引起的，其中最常见的是单核苷酸替换，其次是多个突变、缺失和内含子突变。目前根据G6PD的生化和物理化学特性，已有400多个基因突变位点在G6PD缺乏症中被描述^［3］。

G6PD基因位于X染色体长臂2区8带（Xq28），位于凝血因子VⅢ基因及红绿色盲基因编码区之间。全长18.5 kb，由13个外显子（12个编码外显子）及12个内含子构成，共编码515个氨基酸。5'端非编码区由1号外显子及部分2号外显子组成，启动子位于2号外显子，启动区域富含GC序列^［4］。

由于G6PD缺乏症一般是X连锁隐性遗传病，男性发病显著高于女性，男性可能是正常的半合子或者缺陷的半合子，而女性可能是正常纯合子、缺陷的纯合子或者杂合子。女性杂合子是表达野生型细胞和表达缺失突变细胞的嵌合体^［5］。但是杂合子女性由于X染色体失活机制，亦有可能出现轻微症状^［6］。

研究导致G6PD缺乏症的突变的特征，让我们对这种疾病有一个完整的认识，有助于及时发现和治疗并可为该病的产前诊断提供必要的信息。

1 材料与方法

1.1 研究对象

突变家系基本信息：本研究样本来自湖北省随州市中心医院，抽取该家系每位成员2 mL外周血（EDTA⁃K₂抗凝管）。具体信息见图1。

1.2 设计G6PD外显子引物

本研究根据SnapGene软件设计了8对引物，覆盖了G6PD基因的UTR、外显子及邻近侧翼内含子序列。并由武汉百翼生物公司合成并鉴定引物序列。引物序列如表1所示：

1.3 先证者外显子扩增

使用先证者外周血提取基因组DNA（提取试剂盒为北京艾德莱生物科技有限公司的产品）。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4 突变危害性预测分析

用PolyPhen⁃2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http：//provean.jcvi.org/）、MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org/）和Align GVGD（http：//agvgd.hci.utah.edu/）对有意义的突变位点进行突变危害性预测。PolyPhen⁃2基于蛋白质三维结构的原理，PROVEAN基于查询序列与通过BLAST（生物大分子序列对比搜索工具）收集的紧密相关序列的相似性的变化所引起的变化。MutationTaster基于氨基酸序列同源性的原理，Align GVGD基于氨基酸的生物学特性和蛋白质序列同源性的原理^［7］。

1.5 G6PD突变的功能验证

使用SalI/NotI构建表达pHAGE⁃G6PD WT/MUT的表达载体，转染HEK293T细胞（此细胞转染效率高易于培养）后进行G6PD活性检测、QPCR、western blot实验进而验证G6PD基因的功能和作用方式（HEK293T细胞系及pHAGE质粒载体由武汉百翼生物有限公司保存）。用SnapGene软件进行引物设计和预测。G6PD活性检测、QPCR实验结果应用Graphpad Prism8软件进行单因素方差统计学分析。pHAGE⁃G6PD WT/MUT的表达载体构建引物序列如表2所示。

1.6 X染色体失活偏移检测

本研究采用检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒（武汉百翼生物有限公司保存由南方医科大学发明专利号：CN 201010506300的试剂盒）进行X染色体失活偏移的检测，所用引物见表3。

1.7 毛细管电泳

将AR⁃F（人类雄激素受体基因⁃F）引物进行FAM标记后扩增父亲基因组、母亲和女儿酶切前后的基因组样本，根据父亲和母亲的峰图判断母亲和女儿失活的X染色体，并计算失活比例，预测母亲和女儿是否存在患病风险。

根据以下公式计算X染色体失活比例

失活率（%）=\frac{d_{\mathrm{1}}/u_{\mathrm{1}}}{d_{\mathrm{1}}/u_{\mathrm{1}}+d_{\mathrm{2}}/u_{\mathrm{2}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

其中：d_l和d₂分别代表消化样本PCR产物2条带峰值大小，u_l和u₂则分别代表未消化样本PCR产物2条带峰值大小。

2 结果与分析

2.1 先证者外显子PCR扩增结果

以基因组DNA为模板，表1序列为引物进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图2所示。

将图2中的先证者G6PD基因的扩增片段进行测序，将测序结果与标准序列进行对比，发现在exon10⁃exon12区间上存在3个突变，其中2个为非致病突变，另一个c.1376G>T为已知的热点致病突变（表4）。

2.2 家系内突变检测

以家系内其他成员的基因组DNA为模板扩增EXON10⁃12片段，测序。扩增结果如图3所示，扩增结果良好。

将家系成员exon10⁃12片段序列与先证者的序列进行比对，如图4显示，父亲不携带c.1376G>T突变，母亲和女儿均携带c.1376G>T突变；该家系内女儿和儿子从母亲遗传了携带c.1376G>T突变的X染色体。

2.3 G6PD基因c1376G生物信息学分析

PolyPhen⁃2和Mutation Taster分数和预测值在0~1之间，值越大越影响影响蛋白质功能；Provean分数等于或者低于-2.5认为有害的；如果（GV=O）和（GD>0），该位置是100%保守的，该位置的任何突变都被预测为有害^［8］。根据以上生物信息学解释，c.1376G>T，p.Arg459Leu突变很可能对蛋白质功能产生有害作用（表5）。

2.4 G6PD突变的功能验证

G6PD⁃Phage⁃WT/MUT采用SalI/NotI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示，pHAGE载体（6 384 bp）和WT/MUT片段（1 545 bp）两条带均符合预期大小（图5A）；对构建好的G6PD⁃Phage⁃WT/MUT表达载体进行测序，显示突变位点c.1376G>T构建成功（图5B）。酶活性结果显示c.1376G>T突变使HEK293T细胞G6PD酶活性下降大约25%（图5C）。QPCR和WB结果显示，c.1376G>T突变几乎不影响HEK293T细胞的mRNA水平和蛋白水平（图5D和E）。

2.5 X染色体失活分析

2.5.1 X染色体多态性检测

对照MIC基因，说明酶切完全（图6A）。AR和RP2片段扩增良好。将母亲和女儿的AR基因扩增片段进行测序，表明母亲和女儿的AR扩增片段存在多态性（图6B），说明可以继续进行后续毛细管电泳检测。

2.5.2 毛细管电泳结果和X染色体失活分析

毛细管电泳结果中的等位基因的大小表示亲本来源，峰下面积表示等位基因的扩增程度。甲基化阻止Hpall的酶切。因此，在女性中，只有未甲基化的X染色体扩增被消化掉，从而不会产生任何PCR产物；甲基化的X染色体将被Hpall酶扩增，不会被消化掉，因此会产生扩增产物。基于此原理，由图7及表6可知，先证者姐姐的G6PD基因为杂合子，等位基因253.0 bp来自于父亲，258.4 bp来自于母亲。经过Hpall酶切后，说明母源X染色体失活率为44.76%，父源染色体失活率为55.24%，为完全随机失活。母亲的G6PD基因为杂合子，经过Hpall酶切后，在244.4 bp上有部分消化，消化掉73.52%，说明此处的X染色体处于失活状态，失活率为73.52%，258.4 bp处的X染色体失活率为26.48%，说明母亲为X染色体轻度失活偏移^［9，10］。

本检测中女儿的X染色体失活率未达到80%，视作无X染色体失活偏移，为完全随机失活，未来发生蚕豆病的概率小，母亲的X染色体失活率为73.52%，为轻度失活偏移，但仍具有正常功能的X染色体，所以无患病表现。

3 讨 论

G6PD缺乏症作为全球发病率最高的遗传病之一，每年数以万计的患者因此丧命，该病的发病形势十分严峻，积极预防该病的发生具有重要意义。

G6PD基因的表达主要受该基因的突变类型、外显子剪接沉默子、转录因子及表观遗传学等方面的调控^［11］。受基因调控与环境等因素的影响，G6PD缺乏症患者的临床表现差异极大，许多患者可终身不发病，或仅有轻微症状，但仍有部分患者可因特定的食物、药物、感染、机体病理状态等诱发急性溶血^［12］。症状严重程度及治疗有效性与酶功能缺乏程度、氧化剂种类及数量、暴露时间、暴露人群等因素有关^［13］。

据报道大多数G6PD突变的女性杂合子的酶活性主要与G6PD基因的突变类型有关，然而研究发现即便是同种突变的女性杂合子也表现出不同的酶活性^［14~16］，这表明根据G6PD突变并不能完全解释G6PD缺乏杂合子的临床异质性，对于雌性杂合子来说，DNA甲基化和X染色体失活（XCI）可能是酶活性变化的主要因素^{［17，18］}。另有研究同时检测G6PD启动子内特定CpG岛（富含GC序列）的高甲基化与野生型等位基因的优先XCI，以71名G6PD缺陷型女性杂合子和68名非缺陷型为对照进行统计学分析，结果表明在具有相同G6PD突变的女性杂合子中，G6PD启动子内特定的CpG岛的高甲基化降低了酶活性；野生型等位基因的优先XCI也会降低G6PD活性^［19］。

通过基因检测与筛查，我们明确了患者的发病病因，弄清了该家系中的遗传图谱，并构建突变与野生载体对突变功能进行了验证。先证者男童的G6PD基因含有三个突变位点中对蛋白质序列改变的为c.1376G>T，使459位氨基酸由精氨酸突变为亮氨酸。该突变为G6PD⁃Canton热点突变，是中国人群最常见的突变类型之一，其变异位于二聚体an螺旋上，Leu459侧链参与两个独立二聚体的接触，形成的产物比野生型稳定性高2倍，这种突变被归类于严重溶血突变体^{［20，21］}。本研究成功构建载体后显示携带c.1376G>T的MUT的酶活性比WT下降， 在mRNA和蛋白水平几乎不改变，说明此位点改变影响酶活性从而导致患者发病。母亲与姐姐均为携带者，在生育前建议进行基因检测。同时，两名女性携带者的X染色体没有发生失活偏倚，符合了随机失活的概率，在未来的生活中大概率不会出现蚕豆病症状。这符合G6PD缺乏症X连锁不完全显性遗传的特点。

本研究通过对一家系进行基因突变的鉴定及验证，推测了G6PD基因的结构和功能之间可能存在的关系，基因突变与疾病发生的具体遗传机制需要在更多的家系中或者在G6PD突变的动物模型中进一步验证。

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基金资助

湖北省卫健委科研面上项目(WJ2019M099)