GC⁃MS分析香椿子石油醚提取物成分及其体外抗肿瘤活性

GC⁃MS analysis of Toona sinensis seed petroleum ether extract and its antitumor activity in vitro

摘要

采用气相色谱⁃质谱法（GC⁃MS）及MTT法（MTT assay）对香椿〔Toona sinensis （A. Juss.） Roem.〕的果实香椿子的石油醚提取物组成成分和体外抗肿瘤活性进行研究。气相色谱⁃质谱法分析结果表明，从香椿子石油醚提取物的甲酯化与非甲酯化样品中共检测出108种成分，这些成分类型以萜类、烃类以及有机酸为主，从甲酯化样品中检测鉴定了67种，非甲酯化样品中检测鉴定了65种，24种为两个样品中的共有成分。在这些成分中，γ⁃谷甾醇、豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮、亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯等成分的相对含量均在8.0%以上。提取物对HepG2、THP⁃1、Hela、MCF⁃7均显示出一定的抑制作用，其中，对THP⁃1细胞在最大考察浓度的抑制率为（60.64±1.37）%。

Abstract

Gas chromatography⁃mass spectrometry and MTT method were used to study the composition and in vitro antitumor activity of Toona sinensis seed petroleum ether extract. We detected 108 components in the methylated and non⁃methylated samples of Toona sinensis seed petroleum ether extract，which were mainly terpenes，hydrocarbons and organic acids. We identified 67 components in the methylated samples and 65 in the non⁃methylated samples， and 24 in the two types of samples. Among these components， the relative contents of γ⁃sitosterol， stigmaster⁃4⁃en⁃3⁃one， methyl linoleate， and methyl palmitate were all above 8.0%. We further performed antitumor activity assay of the above extracts， which showed a certain inhibitory effect on HepG2， THP⁃1， Hela， and MCF⁃7， and the inhibitory rate on THP⁃1 cells at the maximum concentration investigated was 60.64%±1.37%.

Graphical abstract

关键词

香椿子 / 石油醚提取物 / 气相色谱⁃质谱法 / 抗肿瘤活性 / MTT法

Key words

Toona sinensis seed / petroleum ether extract / gas chromatography⁃mass spectrometry / antitumor activity / MTT assay

0 引 言

香椿〔Toona sinensis （A. Juss.） Roem.〕为楝科（Meliaceae）香椿属（Toona Roem.）植物，又名椿、春阳树、春甜树、椿芽、毛椿等，其幼芽嫩叶芳香可口，供蔬食^［1］。分布于我国华北、华东、中部、南部和西南部各省区，生于山地杂木林或疏林中，各地也有广泛栽培^［1］。树皮、根皮、果实均可入药，树皮根皮具有清热燥湿、涩肠、止血、止带、杀虫的功效，主治泄泻、痢疾、肠风便血、崩漏、带下、蛔虫病、丝虫病、疮癣等。果实又名香椿子，具有祛风、散寒、止痛的功效，主治外感风寒、风湿痹痛、胃痛、疝气痛、痢疾等，为贵州水族、苗族、布依族用药^［2］。现代研究表明，香椿子含有黄酮^［3］、多糖^［4］、多酚^［5］、香豆素和甾体^［6］、挥发油^［7］等类型的化学成分，具有抗菌^［8］、抗氧化^［9］、抗凝血^［10］、抗炎^［5］、抑制α⁃淀粉酶^［11］等多种生物活性。此外，香椿子石油醚提取物对大鼠糖尿病肾病还具有一定的保护作用^［12］。目前，对香椿子的研究多为提取物的各种生物活性评价，但对这些提取物所含有的化学成分研究则很少，导致香椿子在具有相应药理作用的同时并不清楚其发挥药效的物质基础。恶性肿瘤现在是严重危害人类健康的第二号杀手，本文采用溶剂提取法制备香椿子的脂溶性成分提取物（即石油醚提取物），利用气相色谱⁃质谱联用技术（GC⁃MS）分析香椿子石油醚提取物中的成分，并结合体外抗肿瘤活性测试，为进一步挖掘香椿子脂溶性成分在抗肿瘤方面的药用价值提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：HP6890/5975C GC/MS联用仪（美国安捷伦公司）、N⁃1100V⁃W/WD旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）、DZF⁃1真空干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）、FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、AL204⁃IC电子天平（梅特勒⁃托利多仪器有限公司）。

试剂：石油醚（60~90 ℃，批号051005）、二氯甲烷（批号201912027）、氢氧化钠（批号109138）、三氟化硼（批号206804）、正庚烷（批号2055638）（阿拉丁试剂公司）；气质联用分析数据由贵州省中科院天然产物化学重点实验室分析测试与品质评价中心检测提供。

材料：干燥香椿果（采于贵州省六盘水市，经遵义医药高等专科学校梁光平老师鉴定为楝科植物香椿的果实，样本存放于遵义医药高等专科学校药学系）；人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP⁃1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF⁃7（武汉云克隆科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物的制备

取香椿子粗粉20 g，加入100 mL石油醚（60~90 ℃），回流提取3.5 h，过滤，药渣继续加入100 mL石油醚回流提取1.5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩，干燥得黄色流浸膏状提取物。

1.2.2 气质联用供试液的制备

①甲酯化样品（检测脂肪酸）：取香椿子石油醚提取物40 mg，放入密闭瓶中，加入2 mL 2%氢氧化钠甲醇溶液，80 ℃恒温反应30 min，加入1.75 mL15%三氟化硼甲醇溶液，继续恒温反应2 min。停止加热，取出密闭瓶，加水少量，迅速冷却至室温。准确加入2 mL正庚烷，振摇2 min，再加入氯化钠至饱和，静置分层，取上层溶液到进样瓶，备用^［6］。

②非甲酯化样品（检测挥发性成分）：取香椿子石油醚提取物12 mg，加入二氯甲烷2 mL溶解，微孔滤膜过滤，滤液备用。

1.3 气相色谱条件

色谱柱为HP⁃5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温80 ℃，保持2 min，以每分钟5 ℃升温至310 ℃，保持16 min，运行时间64 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压19.23 psi，载气流量1.0 mL/min；分流比10∶1；溶剂延迟时间6 min。

1.4 质谱条件

离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 682 V；接口温度280 ℃；质量范围29~500 amu^［13］。

1.5 体外抗肿瘤细胞活性测定

在女性恶性肿瘤患者中，宫颈癌、乳腺癌是较为常见的恶性肿瘤。此外，肝癌、白血病对人类健康的危害较为严重。因此，我们选择人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP⁃1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF⁃7作为受试细胞株，按文献［14］的MTT法评价香椿子石油醚提取物在20、40、80、160、240、320 μg/mL浓度下对选取细胞株的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 香椿子石油醚提取物的GC⁃MS分析

根据气质联用技术的分析，对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist14标准质谱图，采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量，从香椿子石油醚提取物的甲酯化与非甲酯化样品共检测出108种成分。从香椿子石油醚提取物的非甲酯化样品中鉴定出65种成分，包括21种烃类及其含氧衍生物、37种萜类成分、5种甾体、1种有机酸、1种苯醌，占总出峰的80.22%。其中γ⁃谷甾醇（18.23%）、豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮（10.02%）、三十醛（4.70%）、正二十九烷（4.38%）等成分的相对含量在4.0%以上。从香椿子石油醚提取物的甲酯化样品中鉴定出67种成分，包括25种烃类及其含氧衍生物、23种有机酸类成分、15种萜类及其衍生物、1种甾体、3种芳香族化合物，占总出峰的83.26 %。其中亚油酸甲酯（9.10%）、棕榈酸甲酯（8.05%）、γ⁃谷甾醇（7.87%）、三十烷酸甲酯（3.80%）、油酸甲酯（3.14%）等成分的相对含量在3.0%以上。

此外，对比甲酯化样品与非甲酯化样品的鉴定结果，有24种共有成分，包括16种烃类及其含氧衍生物、7种萜类成分和1种甾体化合物，香椿子石油醚提取物的GC⁃MS总离子图见图1，各组分的鉴定结果见表1。

2.2 香椿子挥发油对肿瘤细胞生长的抑制作用

香椿子石油醚提取物对4种肿瘤细胞的抑制作用见表2。如表2所示，香椿子石油醚提取物对HepG2、THP⁃1、Hela、MCF⁃7等4种肿瘤细胞株的抑制作用虽然随浓度的升高呈递增趋势，但该提取物对所测四种细胞株的抑制作用均不显著。其中，提取物对THP⁃1细胞在320 μg/mL浓度下的抑制作用最突出，其抑制率为（60.64±1.37）%。表明香椿子石油醚提取物在测试浓度范围内，对HepG2、THP⁃1、Hela、MCF⁃7等肿瘤细胞只是具有一定的抑制作用。

3 讨 论

本研究以香椿子（即香椿果实）为研究对象，采用GC⁃MS技术对香椿子石油醚提取物甲酯化与非甲酯化样品中的成分进行分析。由于采用的检测条件在送检机构前期已经在多个同类样品分析中进行了方法学考察验证，因此沿用了现有色谱条件对香椿子石油醚提取物进行分析，没有额外开展方法学考察。与此同时，在检测前已进行了溶剂的背景扣除，但得到的总离子流图基线仍然不稳，其可能原因是检测试样为植物石油醚提取物中含有的脂肪酸等脂溶性成分较多，在监测分析时产生的碎片离子非常多，从而产生干扰。为此，后期将进一步选择GC⁃MS/MS或GC⁃MS/NCI等分析技术进一步表征验证。

从目前的GC⁃MS分析结果可知，香椿子石油醚提取物非甲酯化样品中分析出的主要成分是挥发性成分，在鉴定出的65种成分中，以烃类、萜类成分为主。从甲酯化样品中分析出的主要成分是非挥发性成分，在鉴定出的67种成分中，以有机酸、烃类成分为主。对比甲酯化与非甲酯化样品的成分种类信息可知，非甲酯化样品中独有的成分有41种，甲酯化样品中独有的成分为43种，两个样品的共有成分仅24种，成分种类存在较大的差异，但两个样品的成分种类均来源于香椿子的石油醚提取物，通过提取物的甲酯化与非甲酯化样品检测，能更加系统全面地体现香椿子石油醚提取物中所含有的化学成分，即从香椿子石油醚提取物中鉴定出108种成分。

香椿子石油醚提取物体外抗肿瘤活性测试发现，它在测试浓度范围内对HepG2、THP⁃1、Hela、MCF⁃7细胞具有一定的抑制作用，但在最大测试浓度下对THP⁃1细胞的抑制率也只有60%左右，对其他细胞的抑制率低于40%，说明香椿子石油醚提取物的抗肿瘤作用不够显著。在细胞活性测试中，我们根据长期活性测试积累的经验，如继续增大测试浓度，香椿子石油醚提取物对所选细胞株可能具有更高的抑制率，但此时获得的抑制率并不具有实用的药用价值，且当测试浓度达到320 μg/mL时，香椿子石油醚提取物对THP⁃1、Hela细胞抑制率的增加已经不够显著，所以在研究中我们将最大受试浓度设置为320 μg/mL。同时，细胞活性没有设置阳性对照的主要原因在于本研究开展活性测试的物质为药材提取物，而阳性对照一般为具有明确结构的单一化学成分，在二者所得结果的代表性不足。

根据香椿子石油醚提取物GC⁃MS分析结果以及文献的报道，相对含量较高的豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮及其豆甾烷类似物对MCF⁃7、HL⁃60等肿瘤细胞有抑制作用^［15~17］。该报道与本研究结果存在较大的差异，究其原因可能是提取物中除豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮以外的其他成分（如正三十醛、正二十九烷等多种烃类成分）降低了豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮对四种肿瘤细胞的抑制强度，也可能是提取物对所选四种细胞株的作用不敏感。而豆甾⁃4⁃烯⁃3⁃酮等豆甾烷类化合物对香椿子石油醚提取物具有一定抗肿瘤作用的贡献度，还需进一步通过药理实验进行验证，并且通过谱效关系分析才能得到更可靠的研究结果，这也是本研究目前的不足之处。

此外，由于香椿子石油醚提取物对所选肿瘤细胞的抑制作用不显著，为进一步挖掘香椿子提取物更显著的生物活性，结合提取物中检测到亚油酸甲酯、油酸甲酯、亚麻酸甲酯等众多相对含量较高且具有不饱和结构的成分。而这些具有不饱和结构的化学成分往往可参与DPPH介导的自由基反应，发挥抗氧化作用^［18］。为此，后期可进一步探究香椿子抗氧化作用的实际情况，充实香椿子脂溶性提取物生物活性方面的研究内容。

综上所述，本研究选取的香椿子石油醚提取物的成分主要以萜类、烃类以及有机酸为主，体外抗肿瘤细胞活性也显示出一定的抑制作用。由于香椿子属于药食两用的植物，目前对该植物化学成分的研究也相对较少，其蕴含的药用价值值得进一步研究。

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基金资助

遵义市科技局合HZ字（2019）213号