惠东海龟湾水质生态学评价与微生物群落结构特征

Ecological evaluation of water quality and structural characteristics of microbial community in Huidong Turtle Bay

摘要

惠东港口海龟国家级自然保护区是中国大陆仅存的海龟繁殖栖息地，监测其水体质量及微生物群落对于保护区日常管理和维护区域生态环境具有重要意义。根据地形分布特点，设置14个采样点对该保护区水域水质进行评价，同时采用高通量测序技术对微生物群落组成（细菌、真菌、微型真核生物）进行调查。结果表明：海龟湾水质定性评价为优，营养状态为贫营养。海龟湾海域微生物种类丰富，细菌分布于14门66科96属，变形菌门（Proteobacteria）（82.2%）为优势类群，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）（6.6%）；真菌分布于3门16科22属，优势类群为子囊菌门（Ascomycota）（98.5%）；微型真核生物群落主要由节肢动物门（Arthropoda）（59.9%）和顶复亚门（Apicomplexa）（16.5%）组成。比较两对微型真核生物引物扩增效果，发现物种组成差异显著，需同时使用才能客观反应海龟湾水域微型真核生物多样性。本研究为保护研究区域海洋生态系统健康提供科学依据。

Abstract

In China， the only remained sea turtle breeding habitat lies in Huidong Port Sea Turtle National Nature Reserve. Therefore， it is a meaningful work for National Nature Reserve to monitor the change of water quality and microbial communities for the daily management and maintenance of the regional ecological environment. According to the topographic characteristics， 14 sampling points were set up to evaluate the water quality of the reserve， the microbial communities （bacteria， fungi and microeukaryotes） were also investigated by high⁃throughput sequencing technology. The results showed that the overall water quality was excellent and in a oligotrophic state. A variety of microorganisms were found， the bacterial communities distributed into 96 genera， 66 families and 14 phyla， the dominant groups were Proteobacteria （82.2%）， followed by Bacteroidetes （6.6%）. The fungal community included 22 genera， 16 families and 3 phyla， the dominant group of Ascomycota accounted for 98.5%. The micro⁃eukaryotic community was mainly composed of Arthropods （59.9%） and Apicomplexa （16.5%）. By comparing the amplification effects of two pairs of micro⁃eukaryotic primers， it was found that the species compositions were significantly different， and it was necessary to use them together to objectively reflect the diversity of micro⁃eukaryotic organisms in Turtle Bay waters. This study provides basis data for the management and protection of the marine ecosystem in this region.

Graphical abstract

关键词

惠东海龟湾 / 高通量测序 / 微生物群落 / 水质 / 生态学评价

Key words

Huidong Turtle Bay / high⁃throughput sequencing / microbial community / water quality / ecological evaluation

0 引 言

海龟是国家一级保护动物，是保持海洋生态平衡的重要物种之一，也是人们监测海洋生态环境变化的重要指示物种^［1］。我国海龟资源曾经十分丰富，繁殖地遍布广东、海南、福建东南沿海等地^［2］，由于受到人类开发等各种破坏因素影响，海龟繁殖栖息地日益萎缩，目前的惠东港口海龟国家级自然保护区是全国仅存的一处海龟洄游产卵的场所，也是中国唯一的海龟自然保护区^［3］。惠东港口海龟国家级自然保护区地貌独特，三面环山一面临海，近海水域生物饵料丰富，每年6-10月绿海龟（Chelonia mydas）长途跋涉来此产卵，海龟产卵沙滩长达1公里，被当地人称之为“海龟湾”。海龟对出生地忠诚度非常高，一旦选定便会世代在此繁衍，繁殖栖息地环境的质量变化会直接影响海龟繁衍的数量。因此，监测惠东港口海龟国家级自然保护区水体质量，开展水体微生物资源的调查对保护和恢复海龟种群具有重要意义。

微生物群落是水生生态系统的重要组成部分，是反映海洋水体生态系统状态的重要指标。水体微生物主要包括细菌、真菌、藻类、原生动物、轮虫及浮游甲壳动物等。它们在水体中分布广，易于取样检验，对外界胁迫因子能产生特殊反应^［4］。当水体受到污染后，水生生物的群落结构和个体数会发生变化，一些敏感生物会消亡，而抗性生物旺盛生长，整体群落结构单一。有学者研究了秦皇岛入海口污染对微生物多样性的影响，发现人类活动对海洋微生物有很大的影响，细菌多样性主要受总氮含量的影响，并与之呈正相关关系，如β⁃变形菌纲（Betaproteobacteria）细菌更易在受污染环境中发现^［5］。因此，应用微生物群落对水体进行污染监测是生物监测的一种重要手段。对海龟湾水体微生物群落的研究有利于了解该海域的微生物群落结构，为海龟湾评价、规范及环境科学的研究提供基本资料，也为控制海水污染、保护海龟湾的生态系统健康提供科学依据，对保护海龟产卵的生境具有重要的意义。

目前，海洋水体环境微生物多样性研究主要关注细菌^［6，7］或真菌^［8］类群，对于微型真核生物多样性的研究较少^［9］，主要借助于显微镜观察分型，存在鉴定速度慢、精确度低的缺点，导致对于海洋水体环境微型真核生物缺乏系统科学的了解。目前，高通量测序方法越来越多地应用于海洋水体微生物多样性的研究，具有通量大、准确率高、定量、节省时间等优点，不仅可以对海洋微生物有更全面的认识，而且更详细了解海洋微生物与海洋环境间的相互作用^［10］。虽然针对海洋沉积环境已有部分不同引物扩增效果的比较研究^{［11，12］}，但在水体环境中不同引物扩增微型真核生物的相关研究较少。

本研究以海龟湾近海水域为研究对象，监测水体水质，并采用高通量测序技术，对海龟湾水体微生物（细菌、真菌、微型真核生物）群落结构及多样性进行研究，为保护区日常管理和维护区域生态环境健康提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

广东惠东港口海龟国家级自然保护区，地处位于惠东县港口镇大亚湾与红海湾交界处，为半月形的海湾，三面环山，南面濒海，属南亚热带海洋性气候，雨量充沛，阳光充足，常年海水盐度在30‰以上。保护区总面积18平方公里，其中核心区4平方公里、缓冲区6平方公里、实验区8平方公里，另设外围保护带海域700多平方公里。沙质海底，水质透明，环境幽静，海域中水生动植物资源丰富，为海龟的栖息繁殖创造了良好的条件^［3］。

1.2 样品采集与保存

按照《海洋监测规范》^［13］（GB 17378⁃2007）和《海洋调查规范》^［14］（GB/T12763⁃2007）调查规范要求，并根据保护区水流和地形特点综合考虑。于2021年7月在22°32′25.38″~22°33′08.94″N，114°52′34.55″~114°54′21.15″E，设置了三个样区，包括核心区（1~8），排污口（9）、养殖区（10~14）共计14个采样点，监测海龟湾的水质，具体采样站位位置见表1。其中，排污口和养殖区属于保护区的缓冲区。使用有机玻璃采样器进行现场水样采集，每个采样点分别采集表层海水2 L，采集三份水样，按要求进行封存并于当天运回实验室进行水质分析。

微生物样本采集：在1~14号样点覆盖海域，采用浓缩样本法（浮游生物拖网）拖网3次，然后合并成1个样品用于高通量测序检测海龟湾微生物（细菌、真菌、微型真核生物）群落组成。拖网结束后，从上述的样品中取2 L海水样品在玻璃抽滤器经0.22 μm孔径的滤膜进行抽滤，滤膜置于10 mL冻存管，保存于-80 ℃冰箱，用于后续的DNA提取。

1.3 环境参数测定

样品的调查项目包括：水温、pH、溶解氧（DO）、总有机碳（TOC）、化学需氧量（COD）、无机氮（DIN）、无机磷（DIP）、重金属含量（Cr、Hg、Cu）、石油类和细菌总数。水温为现场测定数据；pH值采用pH计测定；COD采用碱性高锰酸钾法测定；TOC采用燃烧氧化法测定；DO采用碘量法测定；DIN采用次溴酸盐氧化法测定；Cu、Cr采用无火焰原子吸收分光光度法测定；Hg采用原子荧光法测定；石油类采用紫外分光光度法测定。以上的测定方法均参照《海洋监测规范第4部分：海水分析》^［13］（GB 17378.4-2007）。

细菌总数的测定参照《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测》（GB 17378.4-2007），使用ZoBell“2216E”培养基（由青岛高科园海博生物技术有限公司提供）置于25℃细菌培养箱中培养24小时，最后统计数据，计算出水样中每毫升所含的菌落总数，以此来分析各个样点的污染情况。

1.4 样品DNA提取及高通量测序

在无菌环境中，将过滤微生物细胞获得的滤膜剪切成碎片。对滤膜采用FastDNA^®Spin Kit for Soil （MP Biomedicals company），按照试剂盒的操作说明对样品进行DNA提取。提取的DNA分别用凝胶电仪成像和NanoDrop浓度测定两种方法保证样品满足测序的DNA质量要求。测序过程由上海派森诺生物信息科技公司完成，利用Illumia测序平台，根据测序方案进行测序。

引物信息^［16~19］见表2。通过细菌和真菌通用引物测序可以了解水体中原核和真菌微生物群落多样性。针对微型真核生物 18S rRNA 基因，地球微生物组计划（earth microbiome project，EMP）^［15］推荐了扩增V9区的引物对F4/R4。而F3/R3引物一般适用于所有微型真核生物，除微孢子虫以外。本项目通过这两对通用引物（F3/R3、F4/R4）同时对海龟湾水体微型真核生物群落进行研究，为海洋水体微型真核生物多样性研究的引物选择提供科学依据。

1.5 数据处理

1.5.1 水质评价方法

水质分析标准和评价方法分别采用了单因子指数法、模糊综合评价法和富营养化水平三种评价法。

单因子指数法将各检测指标单独评价，方法简单，计算简便。根据《海水水质标准》^［20］（GB3097-1997），将各指标按照不同的类别进行分类，选出最不合格的指标，作为整体的水质分类。单因子指数法计算公式：

I_i=\frac{C_i}{S_i}

式中，I_i为i项评价因子的标准指数；C_i为i项评价因子的实测浓度；S_i 为i项评价因子评价标准。海水中溶解氧标准指数Q_j 计算公式：

Q_j=\frac{C_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-C_j}{C_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-C_{\mathrm{0}}}

式中，C_j 为评价因子实测值；C₀为评价因子的评价标准值；C_max为调查期间饱和溶解氧的最大值。

模糊综合评价法：根据《海水水质标准》（GB 3097—1997）将海水水质分为4个等级，相应的评价等级集合：V=｛Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ｝（数字越小代表水质越好）。选择数据中代表性较强的 7项水质指标（DO、化学需氧量、Hg、无机氮、Cu、Cr、石油类）作为评价因子，建立评价因子集合：U = ｛X₁（DO），X₂（COD），X₃（Hg），X₄（DIN），X₅（Cu），X₆（Cr），X₇（石油类）｝。计算各样点的模糊分析的权重集 W 和各样点的隶属度矩阵［Ｒ］，建立模糊综合评价模型，评价对象所属级别，相关公式及方法参考文献^［21］。

海域富营养化状况采用富营养化指数法^［22］评价，公式如下：

E=\frac{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{D}\times \mathrm{D}\mathrm{I}\mathrm{N}\times \mathrm{D}\mathrm{I}\mathrm{P}}{\mathrm{4}\mathrm{500}}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{6}}

式中，COD、DIN、DIP的单位均为mg/L。当E值≥1时即为水体富营养化。E值越高，富营养化程度越严重，指数值小于1.00表示该因子达到第Ⅰ类海水水质标准。

1.5.2 微生物群落高通量测序数据处理

将Illumina MiSeq测序得到的原始数据，经质量控制，拼接和去除嵌合体和单列后得到高质量的数据。采用QIIME软件使用DADA2方法进行生物信息学分析，根据序列的相似度，将序列归为多个OTUs （operational taxonomic units）。采用RDP Classifier贝叶斯算法进行分类学分析，得到各个分类水平下的物种注释信息和基于物种的丰度分布情况。基于OTU计算Shannon、Chao1等α多样性指数。

2 结果与分析

2.1 水质

2.1.1 水质现状

影响水体理化性质的因素有很多，其中包括了动物、植物、微生物等生物因素和温度、气候、地貌等非生物因素，水环境理化性质的变化对微生物的类型和功能会产生或大或小的影响^［23］。水样的理化指标统计结果如表3所示。

调查结果表明，广东惠东港口海龟国家级自然保护区的各采样点水温为23.4~29.10 ℃，与当地的气温变化相符。核心区pH变动范围为7.68~7.76，排污口pH为7.82，养殖区pH变动范围为7.74~7.83，总体保护区水质偏弱碱性。核心区COD含量变动范围为0.20~0.30 mg/L，排污口COD含量为0.20 mg/L；养殖区COD含量变动范围为0.20~0.30 mg/L，根据《海水水质标准》（GB3097-1997）各样点均符合Ⅰ类海水水质标准（2 mg/L），说明保护区有机物污染较小。核心区TOC变化范围为0.40~0.60 mg/L，排污口TOC含量为0.60 mg/L，TOC变化范围为0.40~0.80 mg/L，差异不明显。各采样点DO含量较高，平均值可达9.30 mg/L。三个样区的DIN含量均为0.03 mg/L，均符合Ⅰ类海水水质标准（0.2 mg/L）。Cu介于0~0.02 μg/L，平均含量为0.01 μg/L；Cr介于0.02~0.18 μg/L，平均含量为0.01 μg/L；Hg介于0.04~0.06 μg/L，平均含量为0.05 μg/L；石油类介于0.01~0.02 mg/L，平均含量为0.01 mg/L。

2.1.2 水质保护区水质类别评价

运用单因子指数法对保护区水域进行水质评价。结果表明，14个监测点主要的水质污染指标均为Hg，64.3%的样地（1，2，4，5，6，7，8，10，15）达到第Ⅰ类海水水质标准，35.7%的样地（3，9，11，13，14）水质等级为Ⅱ类海水水质标准（表3）。

根据代表性较强的7项水质指标（DO、COD、Hg、DIN、Cu、Cr、石油类），运用模糊综合评价法对海龟湾海域进行水质评价。根据最大隶属度原则，海龟湾海域海水均为Ⅰ级水质隶属度最大，表明各站位海水水质均为Ⅰ级（表3）。因此，模糊综合评价结果显示，该海域整体水质良好。

利用富营养化指数对广东惠东港口海龟国家级自然保护区水域水资源进行富营养状态评价。由表3可知，保护区14个采样点水质富营养化指数E值均小于1，变化范围为0.001 4~0.003 3。评价结果表明保护区水质富营养状态为贫营养，水质定性评价为优。

2.2 水体微生物平板计数结果

细菌是海洋生态系统的重要组成部分，在海洋生态系统的能量流动、物质循环、元素转化、生态平衡和环境净化等方面发挥着重要作用。当水体条件发生改变时，细菌的种类、数量及种群结构也呈现相应的改变，这些变化可以用来表征海洋环境质量的变化^［24］。

海龟湾14个站位水样测定细菌总数得到的结果，如图1所示。结果显示海龟湾海域的细菌总数变化范围是1.5×10³~2.71×10⁷ cfu/mL，平均值为2.7×10⁶ cfu/mL。处于排污口的9号站位数量最多，处于核心区的5号站位数量最少。

2.3 测序结果分析

利用Illumia高通量测序平台成功使用4对引物对海龟湾海水样品进行了测序，共获得原始序列412 394条，经质量控制后共得到有效数据385 532条，经拼接和去除嵌合体和单列后共获得高质量序列331 832条。

2.4 微生物群落Alpha多样性分析

根据高通量测序结果，对样品进行Alpha多样性分析，海龟湾水体微生物多样性指数结果见表4。从表中可以看出各个特定引物测序覆盖率均在99%，表明本次高通量测序数据合理可信。观测物种数和Chao1指数用于物种总数的评价，其值越高则说明微生物丰富度越高。由表4可以看出，海龟湾细菌群落丰富度较高；均匀度指数Pielou表明各物种个体数目分配的均匀程度：真菌>微型真核生物>细菌；Shannon指数为1.05~5.71；Simpson指数为0.19~0.87，差异较大。这两项指标通常都可用来评价微生物群落多样性，两项指数共同表明，细菌多样性最高，微型真核生物次之，而真菌多样性最低。

2.5 海龟湾水体微生物群落结构

2.5.1 海龟湾水体细菌群落组成

海龟湾水样细菌种类丰富，共检出14门19纲37目66科96属。如图2（a）所示，在门级分类水平上，筛选相对丰度≥2.0%的优势门。变形菌门（Proteobacteria）占82.2%、拟杆菌门（Bacteroidetes）占6.6%、螺旋菌门（Spirochaetes）占4.5%、梭杆菌门（Fusobacteria）占3%和厚壁菌门（Firmicute）占2%。

如图2b所示，在科级分类水平上，变形菌门的假交替单胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）占据绝对优势，相对丰度达55.3%，盐单胞菌科（Halomonadaceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）和海生线状菌科（Marinifilaceae）是具数量优势的4个细菌科，相对丰度分别为9.8%、5.9%、4.5%和3.8%。

如图2c所示，在海龟湾水样中属水平微生物结构分布中，筛选出样品中相对丰度≥2.0%的优势属：变形菌门假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），占55.3%；大洋螺菌属（Oceanospirillum），占9.7%；弧菌属（Vibrio），占5%；Sphaerochaeta属占4.5%和梭形杆菌属（Fusobacterium），占2%。

2.5.2 海龟湾水体真菌群落组成

高通量测序结果表明海龟湾水体真菌主要由3门8纲14目16科和22属组成。

在门水平上，如图3（a）所示，真菌群落主要包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）3个已命名的门以及未鉴定类群，其中子囊菌门占据绝对优势，相对丰度高达98.5%。

在科水平上，如图3（b）所示，曲霉科（Aspergillaceae）在海龟湾真菌群落中占据优势地位，相对丰度高达93.7%；其次的枝孢霉科（Cladosporiaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae）和法夫酵母科（Phaffomycetaceae）相对丰度分别为0.9%、0.5%和0.2%。

在属水平上，如图3（c）所示，丰度前10的优势属包括青霉菌属（Penicillium，91.4%）、Hortaea（1.7%）、曲霉菌属（Aspergillus，1.5%）、枝孢属（Cladosporium，0.9%）、球腔菌属（Mycosphaerella，0.55%）、Cyberlindnera（0.42%）、假丝酵母属（Candida，0.22%）、孢腔菌（Biatriospora，0.18%）、Clonostachys（0.14%）、威克汉姆酵母（Wickerhamomyces，0.13%）。

2.5.3 海龟湾水体微型真核生物群落结构组成

引物F3/R3和F4/R4扩增得到的扩增子文库均包含后生动物（metazoa）、原生生物（protist）、真菌（fungi）等类群。分析在门、纲、目和科水平上海龟湾微型真核生物的物种组成（图4）。

在门水平上，如图4（a）所示，微型真核生物丰度所占比例较高的门为节肢动物（Arthropoda，70.3%）和顶复门（Apicomplexa，16.5%）。在纲水平上，如图4（b）所示，六肢幼虫纲（Hexanauplia）和类锥体纲（Conoidasida）在海龟湾微型真核生物群落中占据优势地位，占总丰度的比例分别为70.3%和16.49%。在科水平上，如图4（c）所示，微型真核生物相对丰度较高的科为宽水蚤科（Temoridae，36.8%）、纺锤水蚤科（Acartiidae，17.7%）、Lecudinidae（16.4%）和哲水蚤科（Paracalanidae，9.2%）。在属水平上，如图4（d）所示，微型真核生物主要包括宽水蚤属（Temora，33.8%）、纺锤水蚤属（Acartia，17.7%）、哲水蚤属（Parvocalanus，8.5%）、真宽水蚤属（Eurytemora，3%）。

2.6 微型真核生物多样性研究中的引物选择

2.6.1 不同引物扩增海龟湾水体微型真核生物群落结构特征

基于不同的引物，对比分析各水平微生物分类（表5）发现，F3/R3引物和F4/R4引物所获得微型真核生物类群各有优缺点。

在门分类阶元上，如图4（a）所示，以F3/R3为引物获得微型真核生物主要包括节肢动物（Arthropoda）和顶复门（Apicomplexa）为主，占总丰度的比例分别为70.3%和16.5%。以F4/R4为引物获得的微型真核生物主要为节肢动物门（Arthropoda，49.5%）和绿藻门（Chlorophyta，0.61%）。

在纲分类阶元上，如图4（b）所示，F3/R3为引物得到的微型真核生物丰度所占比例较高的纲为六肢幼虫纲（Hexanauplia）和类锥体纲（Conoidasida），分别占总丰度的70.3%和16.49%。以F4/R4为引物获得的微型真核生物主要纲为六肢幼虫纲（Hexanauplia），相对丰度为49.5%。在科分类阶元上，如图4（c）所示，基于F3/R3引物获得的微型真核生物相对丰度较高的科为宽水蚤科（Temoridae，36.8%）、纺锤水蚤科（Acartiidae，17.7%）、Lecudinidae（16.4%）和哲水蚤科（Paracalanidae，9.2%）。基于F4/R4引物获得的微型真核生物相对丰度最高的为Others，高达97.7%，说明大量未知的微型真核生物资源有待深入研究。在属分类阶元上，如图4（d）所示，基于F3/R3引物获得的微型真核生物主要包括宽水蚤属（Temora，33.8%）和纺锤水蚤属（Acartia，17.7%）。基于F4/R4引物获得的微型真核生物主要包括酵母菌（Cyberlindnera，0.4%）。

2.6.2 不同引物的扩增特异性及其多样性

后生动物类群（图5）在F3/R3扩增子文库中比例约70%，而在F4/R4扩增子文库中比例约49%。F3/R3扩增子文库与F4/R4扩增子文库均包含了节肢动物（Arthropoda）、纽形动物（Nemertea）和软体动物（Mollusca）3个类群，且节肢动物在两个文库中均占据优势地位。在F3/R3扩增子文库的比例为70.3%，在F4/R4扩增子文库的比例为49.5%。此外F4/R4扩增到了独有的2个类群：脊索动物门（Chordata）和腕足动物门（Brachiopoda），对后生动物类群的扩增中表现出了最高的多样性。原生生物类群（图5），两对引物扩增结果各异。在F3/R3扩增子文库中比例约19%，而在F4/R4扩增子文库中比例约2%。F3/R3扩增子文库与F4/R4扩增子文库均包含了横裂甲藻纲（Dinophyceae）、绿藻门（Chlorophyta）和硅藻门（Bacillariophyta）3个类群。此外F3/R3扩增到了独有的顶复门（Apicomplexa）类群，而F4/R4扩增到了独有的蓝藻门（Streptophyta）类群。真菌方面（图5），在F3/R3扩增子文库中比例约0.08%，而在F4/R4扩增子文库中比例约0.5%。F3/R3扩增子文库是子囊菌门（Ascomycota），F4/R4扩增子文库也是子囊菌门，这可能是由于两对引物对海洋水体中真菌扩增具有局限性。综上所述，在以后进行该水域微型真核生物多样性研究时，应选择F3/R3引物和F4/R4引物一起进行实验。

3 讨 论

3.1 水质分析

从pH来看，各样点的pH均比较稳定，变化范围为7.68~7.83，证实目前海龟湾水质稳定。依据国家《海水水质标准》（GB 3097-1997），pH达到国家第Ⅰ类水质标准。COD、DIN是反映海区营养成分的重要指标，也可以量化海域的污染程度^［25］。COD值常作为衡量水中有机物质含量多少的指标。COD值越大，说明水体受有机物的污染越严重。海水中氮、磷的含量，对海域富营养化起着决定性作用，海水的富营养化是发生赤潮的物质基础^［26］。研究结果显示，COD、DIN均达到国家第Ⅰ类水质标准。研究结果表明海龟湾水体溶氧整体较高，说明水体具备较强自净力，水体中的生物都能得到充足的氧气^［27］。海龟湾14个样点的水质分析综合结果表明：该水域水质处于轻度污染、水质综合营养状态为贫营养、定性评价为优，为Ⅰ、Ⅱ类水。水质在空间上有一定的差异性，但差异不大。推测主要是由于保护区海域高度的流动性，导致水体高度的混合。对保护区内海龟资源提供了一个优良的栖息繁衍地。

3.2 微生物平板计数法检测结果分析

本研究结果显示，海龟湾海域的细菌总数变化范围是1.5×10³~2.71×10⁷ cfu/mL。相关研究结果表明从珠江口到南海北部海湾的细菌总数变化范围是5.12×10⁵~1.61×10⁶ cfu/mL^［28］。总体来说，海龟湾海域的细菌总数较珠江口到南海北部海湾的细菌总数偏低。偏低的原因可能是海龟湾作为海龟的自然保护区，该海域受到的污染程度较低。

排污口的9号站位数量明显增加，有相关研究表明，当污染物（工业废水、生活污水、污水处理厂废水等）排入水体时，细菌处于一个营养状态不稳定的状态，细菌总数明显增加，且变化较大^［29］。因此，排污口的9号站位细菌总数增加的原因可能是该区域接受了岸上的排污，导致营养盐含量增加，且温度适宜，从而使得适应淡水与海水双重环境的细菌大量繁殖。

处于养殖区的11~14号站位的细菌总数相对于其他站位的细菌总数偏低。在消毒和灭菌等措施下，养殖过程中水体细菌总数数量急剧下降，养殖区生物因素除了受生物理化作用控制外，还受人为因素的影响，有时人为因素起着决定性的作用^［30］。因此，11~14号站位细菌总数偏低的原因可能是为了减少养殖生物的发病率，投放了抗生素、消毒剂等化学药剂进行杀菌消毒，使得细菌总数减少。

3.3 海龟湾水体微生物群落结构特征

3.3.1 海水中细菌群落结构特征

海洋细菌不仅在食物链的能量流动中发挥着重要作用，而且对驱动海洋多种重要生源要素的生物地球化学循环也至关重要。本研究结果表明，海龟湾水体中最具数量优势的细菌类群是变形菌门。变形菌门是海洋中广泛分布的常见优势类群，通常具有较高的丰度^［31］，这类细菌在水环境中普遍存在。相关报道指出，在水库、河流等环境中均以第一优势门存在^{［32，33］}。大多数变形菌门类群对有机基质具有很强的分解能^［34］。

本研究中变形菌门主要类群是假交替单胞菌属（55.28%）、海单胞菌属（1.97%）、弧菌属（5.06%）和海洋螺菌属（Oceano spirillum，9.69%）。假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、海单胞菌属（Marinomonas）是海洋中的特有属，并且在海洋中广泛分布，在全球海洋生态系统的碳循环发挥着重要的作用^［35］。假交替单胞菌属是海洋环境中较为常见的细菌类群，能够在海洋动植物中寄生生长，合成具有抗菌、溶菌和杀藻活性的生物分子，从而提高其与其他微生物在营养和生存环境等方面的竞争力^［36］。Marinomonas能够将二甲基巯基丙酸（dimethylsulfoniopropionate，DMSP）降解为生源硫化物二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS）进入大气中。DMSP是海洋细菌和浮游植物利用的主要碳源和硫源，在微生物的食物链中发挥极其重要的作用，在海洋与大气的硫循环中具有重要作用^{［37，38］}。

弧菌属是海洋环境中最常见的菌群之一，且部分种成为致病菌，能引起海洋生物弧菌病。许多弧菌属种类或菌株具有多种毒力因子的胞外产物和外毒素，可引起多种海洋动物出现皮肤溃疡、烂鳍、烂尾、出血等症状^［39］，其广泛存在于各类海产品中，对于海洋生物和人类健康都有着不利影响^［40］。有学者研究象山港水域细菌多样性发现，在属水平上弧菌属占比最高，为18.19%，假交替单胞菌属占比为8.60%^［41］，这可能与假交替单胞菌和弧菌之间的拮抗作用有关；样点均分布着一定数量的海单胞菌属占比1.27%~8.25%。与本研究结果相似，并且本研究同时也进一步证明弧菌属和假交替单胞菌属之间的相互抑制作用，可为海龟湾生物防治和水环境保护等提供参考。

3.3.2 海水中真菌群落结构特征

真菌作为海洋中重要的寄生类群，广泛分布于各种海洋生态系统中，是营养物质循环的重要参与者。海龟湾水体真菌的优势类群为子囊菌门，相对丰度为98.5%，担子菌门和壶菌门的相对丰度的比例非常低（不足1%）。有学者研究了海洋子囊菌，变形类群和担子菌的分类，发现子囊菌占80%，担子菌占2.3%^［42］，这与本研究真菌主要隶属于子囊菌门的比例相似。迄今为止，从海洋环境中鉴定出的绝大多数真菌都属于子囊菌门和担子菌门^［43］。子囊菌门主要分解纤维素和木质素，其生长可能依赖于更容易利用的能源，如可溶性碳水化合物，而担子菌门主要是通过产生木质素修饰酶，以降解木质素为生^［44］。

在属水平上，一些占据优势地位的真菌属于子囊菌门（青霉菌属、曲霉菌属），这些属的真菌同时也在大西洋^［45］和南海沉积物^［46］中被检测到。曲霉菌属（Aspergillus）是发酵工业及食品加工方面的重要菌种，在环境中有机物的分解中起着重要作用，广泛分布于谷物、空气、土壤及各种有机物等含糖量高的酸性环境中。Hortaea属在海南海口温泉真菌群落中也占据优势地位^［47］。

3.3.3 海水中微型真核生物群落结构特征

应用F3/R3引物对朱婆湖的水体扩增所得超微型真核浮游生物物种主要类群为顶复门（Apicomplexa）种类（约23%）^［12］，与本文结果类似。应用F4/R4引物对麦地卡湿地国家级自然保护区的水样扩增所得原生生物物种主要类群以纤毛门（Ciliophora）、丝虫门（Cercozoa）、眼虫门（Euglenozoa）为主^［48］。但这些类群在海龟湾水体都未被扩增到，这可能是由于海龟湾与麦地卡湿地国家级自然保护区的环境差异性所导致的。

此外，对扇贝养殖海区微型真核浮游生物进行DGGE分析，结果表明，该养殖海区微型真核生物包括甲藻、纤毛虫、眼虫、定鞭藻、硅藻、盘蜷虫、隐藻、领鞭毛虫、变形虫和丝足虫（Cercozoan）^［49］。这些类群与本多样性研究中的主要类群显著不同，由于DGGE技术仅能分析有限的优势微生物类群，存在高估物种丰度以及低估微生物群落大小和多样性的可能，具有较大的随机性，这说明利用高通量测序技术可以更为全面客观地研究和监测环境中微型真核浮游生物的多样性。

研究发现节肢动物为底栖动物群落中的重要类群，并在水质为清洁⁃轻污染情况下为优势类群^［50］，说明海龟湾的水质属于清洁⁃轻污染状态。有研究发现，富营养型湖泊中的微生物优势类群常以绿藻和蓝藻为主^{［51，52］}。本研究发现两个文库中的绿藻和蓝藻的平均丰度分别约为1%和0.006%，因此进一步证实海龟湾属于贫营养型。

4 结 论

综上所述，惠东港口海龟国家级自然保护区总体水质状况良好，各个样点水质综合评价都为Ⅰ、Ⅱ类水，处于贫营养状态，虽然有轻度的Hg污染，排污口区和养殖区水质也都达标，水质评价结果说明保护区日常管理措施到位，兼顾了保护区内各方利益。本研究通过高通量测序技术研究保护区内水域微生物群落多样性，相比传统的显微镜观察分型技术，鉴定到的微生物种类更多，保护区内种类丰富的微生物，为保护区内栖息繁衍的各种水生生物提供了丰富的饵料，对维持海洋生物种群结构的稳定提供了饵料基础，对保护和恢复海龟种群具有重要意义。

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基金资助

自然资源事务管理⁃生态林业建设专项资金(2021-445986)

岭南师范学院红树林研究院开放课题资助(YBXM09)

海南省高等学校科学研究项目(Hnky2019-27)