香港斗鱼海南种群的分子鉴定和亲缘关系分析

Molecular identification and phylogenetic analysis of the Hainan population of Macropodushongkongensis

摘要

香港斗鱼（Macropodus hongkongensis）是一种斗鱼科（Belontiidae）斗鱼属（Macropodus）的淡水鱼，记录于香港、广东等地，分布稀少。本研究通过线粒体COI、Cytb及16S rRNA基因对海南万泉河水系发现的疑似香港斗鱼进行分子鉴定和亲缘关系分析。基于3种基因的比对鉴定显示，该斗鱼和香港斗鱼广东鹤山种群的亲缘关系最近，海南万泉河水系发现的斗鱼为香港斗鱼海南种群。本文中几种斗鱼的种间遗传距离在0.136~0.238，大于香港斗鱼海南种群种内遗传距离（0.000~0.006（COI））的10倍，与10倍理论一致，满足物种的有效鉴定。香港斗鱼不同地理种群之间遗传差异明显，海南种群和广东鹤山种群之间的种内遗传距离为0.036。NJ进化树也显示，香港斗鱼海南种群和香港斗鱼广东种群聚为一支，接着与红鳍斗鱼（M.erythropteru）聚为一支，再与叉尾斗鱼（M.opercularis）聚为一支，最后与圆尾斗鱼（M.chinensis）聚为一支。本文为海南岛香港斗鱼种群的首次研究报道，有关结果将为我国香港斗鱼的演化和保护研究提供重要参考。

Abstract

Macropodus hongkongensis is a freshwater fish which belongs to the genus Macropodus，family Belontiida. This species sparsely distributed in Hong Kong and Guangdong province. COI， Cytb and 16S rRNA genes were employed to identify and analyse the phylogenetic relationship of the individuals found in Wanquan River， Hainan. Sequence alignment of the three genes indicated that the species were highly similar with M.hongkongensis from Heshan， Guangdong， and the samples from Wanquan River belonged to a new geographical population of M.hongkongensis. Genetic distances within Macropodus species（0.136-0.238） are 10 times greater than the individuals within Hainan population （0.000⁃0.006） based on COI， which is consistent with the 10⁃fold theory and meets the needs of species valid identification. Genetic distance of populations in Hainan and Guangdong is 0.036， indicating that different geographical populations of M.hongkongensis have significant genetic differences. NJ trees also showed M. hongkongensis Hainan and Guangdong populations are clustered together， then grouped into one branch with M.erythropteru and further grouped with M.opercularis， finally grouped with M.chinensis. It is the first academic report about the M.hongkongensis Hainan population， and the results can provide the reference for the research of evolution and conservation of M.hongkongensis.

Graphical abstract

关键词

香港斗鱼 / 海南种群 / 分子鉴定：亲缘关系

Key words

Macropodus hongkongensis / Hainan geographical population / molecular identification / phylogenetic relationship

0 引 言

斗鱼属（Macropodus）鱼类隶属于鲈形目（Perciformes）攀鲈亚目（Anabantoidei）斗鱼科（Belontiidae）斗鱼亚科（Macropodinae），目前主要包括香港斗鱼（M.hongkongensis）、叉尾斗鱼（M.opercularis）、圆尾斗鱼（M.chinensis）、红鳍斗鱼（M.erythropteru）、越南斗鱼（M.spechti）^［1］。香港斗鱼是一种小型淡水鱼类，Dudgeon和Bosco Chan于1996年首次在香港发现并记录，2001年在香港大埔区收集了香港斗鱼的标本^［2］，2005年香港斗鱼在广东和福建被发现，2007年有学者提到广东省梅州、汕尾、揭阳三市均有香港斗鱼的出现^［3］。目前关于香港斗鱼的研究报道较少，有专家学者讨论了香港斗鱼的濒危现状及保护建议^［4］，有研究基于Cytb基因分析了香港斗鱼普宁和深圳两个种群间的亲缘关系^［5］，2019年有研究者首次发表了广东鹤山香港斗鱼的线粒体基因组信息^［6］。

近年来随着DNA条形码技术的快速发展，线粒体基因片段已被广泛地应用于鱼类分子鉴定，使鱼类种质资源的鉴定和亲缘关系分析变得更为快速、准确^［7~12］。COI、Cytb及16S rRNA是常见的用于鱼类物种鉴定的有效分子标记^［13~15］，其中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（COI）进化速率适中，可用于不同物种间的分类关系研究；线粒体细胞色素b基因（Cytb）因相对高的种间差异和较低的种内差异，也常用于鉴定亲缘关系比较近的物种；16S rRNA基因进化速率较为保守，常用于种以上不同科、属阶元间的系统进化研究^［16~18］。海南岛丰富的热带雨林资源造就了多样的淡水生态系统，为淡水鱼类的生活和繁殖提供了适宜的环境，使海南岛内的淡水鱼类具有极高的物种多样性^［19~22］。海南的疑似香港斗鱼最早出现在国内观赏鱼市场，被爱好者称作“海南黑叉尾斗鱼”，简称“海南黑叉”。2020年3月海南省海洋与渔业科学院淡水渔业研究所在万泉河水系采集到疑似香港斗鱼的活体标本。目前该种在海南岛已知的分布区仅限于万泉河水系，分布生境为山间灌丛的细小溪流，生存空间狭窄，野外数量极其稀少，其分布对生境依赖性较强，易受人为活动干扰等环境因素的影响。本研究基于COI、Cytb及16S rRNA基因对海南岛发现的这些疑似香港斗鱼进行了分子鉴定和亲缘关系分析。本研究就所查文献，未见海南岛正式发现香港斗鱼的学术报道。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

样品采集地点为海南万泉河水系，采集的样品保存于95%酒精中，4 ℃保存。从鱼鳍组织中提取核酸，DNA的提取采用天根海洋动物基因组试剂盒，提取后的DNA放于-20 ℃备用。

1.2 基因的扩增与测序

COI基因扩增正向引物COIF1：5'⁃TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG⁃3'，反向引物COIR1：5'⁃CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA⁃3'，是鱼类分子鉴定通用引物^{［23，24］}。COI基因的PCR反应总体系为50 μL，其中Takara公司Premix Taq 25 µL，10 µmol/L的上下游引物各2 µL，DNA模板50 ng，无菌ddH₂O补足50 µL。扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

Cytb基因扩增正向引物L14724⁃Cytb⁃F：5'⁃GACTTGAAAAACCACCGTTG⁃3'；反向引物H15915⁃Cytb⁃R：5'⁃CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC⁃3'，扩增反应体系与COI基因相同，扩增条件为94 ℃预变性3 min， 1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

16S rRNA基因扩增正向引物16SarF：5'⁃CGCCTGTTTATCAAAAACAT⁃3'；反向引物16SarR：5'⁃CCGGTCTGAACTCAGATCACGT⁃3'，扩增反应体系和COI基因反应体系相同；扩增条件为94 ℃变性3 min，1个循环；94 ℃预变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物4 ℃保存，反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送青岛华大基因公司测序。

1.3 序列分析

经过双向测序获得的原始数据通过Contigexpress软件校正拼接后，导出的序列分别与NCBI（National Center for Biotechnology Information）和BOLD（The Barcode of Life Data System）数据库中已收录的COI、Cytb、16S rRNA基因序列进行比对；利用MEGA 7.0软件计算序列间的遗传距离，构建邻接系统树（neighbor⁃joining tree）。系统树各分支的置信度由Bootstrap 1000次循环检验。

2 结果与分析

2.1 香港斗鱼海南种群的形态学特征

香港斗鱼的发现历史和命名经过错纵复杂，最初命名为黑歧尾斗鱼（Macropodus concolor），认为与越南斗鱼（Macropodus spechti）是同一品种。2002年重新命名为香港斗鱼（Macropodus hongkongensis），成为一个新种^{［1， 3］}。香港斗鱼属独居、昼行性、杂食性的淡水鱼类，喜欢水流环境，栖息于池塘、溪流等生境中，以捕食浮游动物和藻类为食，适宜温度为15~25 ℃，pH为6.0~8.0，一般在春夏吐泡营巢产卵，雄鱼守巢^［25］。

香港斗鱼体延长，尾鳍叉型，口端位，上下颌具细齿，无须，侧线退化。体表底色浅灰绿至灰色，体侧无横纹，鳃盖近后缘中央具一黑斑。背鳍、臀鳍、尾鳍膜具朱红色短斑，部分边缘浅蓝绿色^［26］。海南种群在实验室养殖缸中性成熟于11月，水温25 ℃时筑巢产卵，可一年多次繁殖，雄鱼间隔约15~20天后与成熟雌鱼交配产卵。本文中基于5尾形态样本的数据统计，香港斗鱼海南种群的背鳍硬棘13~14枚，软条7~8枚；臀鳍硬棘19~20枚，软条14枚；胸鳍条11~12；腹鳍硬棘1枚，软条5枚；纵列鳞30~31（不含尾鳍上的鳞片）；横列鳞11~12（不含臀鳍上的鳞片），2006年有研究学者提到香港斗鱼的主要鉴定特征是背鳍硬棘13~14；臀鳍硬棘17~19；椎骨29~30，体长最大约60 mm^［4］，这与香港斗鱼海南种群的5尾形态样本统计结果一致。香港斗鱼海南种群鱼类照片见图1。香港斗鱼本土鱼类参考香港水族馆展示的斗鱼照片见图2。图中香港斗鱼鳃盖斑点皆清晰可见，体表底色浅灰，海南种群的臀鳍、尾鳍膜朱红色比较明显，此外海南种群雌鱼的尾针较长，雌鱼在性成熟交配期间体侧隐具12~13条纵纹，交配完成后纵纹消失。目前其他地理种群香港斗鱼的形态学资料较少。此外香港斗鱼和红鳍斗鱼在形态上也有一定的相似性，不易区分。红鳍斗鱼发现初主要分布于越南中部广平省，其栖息环境为植被错杂的山间溪流。香港斗鱼和红鳍斗鱼相比，前者鳃盖有明显的黑色斑点，而后者是灰白色斑点；前者背鳍膜边缘呈灰色，而红鳍斗鱼为红色^{［27，28］}。斗鱼属的分类一直存在疑问，确定香港斗鱼的分类地位对其保育非常重要，分子生物学方法可以弥补传统形态学鉴定的不足，可用于鱼类辅助鉴定，应用广泛。

2.2 香港斗鱼海南种群COI基因序列分析和鉴定

通过对海南岛万泉河水系采集的疑似香港斗鱼COI基因进行PCR扩增，我们获得了5条616 bp长的COI基因序列，全序列共616个碱基，平均碱基组成比例为26.0% A，23.4% C，17.2% G，33.4% T。利用NCBI数据库中的Blast和BOLD数据库中的鉴定功能对海南万泉河水系采集的疑似香港斗鱼COI基因序列进行比对，发现该斗鱼和数据库中已发表的香港斗鱼（M.hongkongensis）广东鹤山种群相似度最高，基因序列号MN128300.1^［6］。序列鉴定中，BOLD数据库中未公布的香港斗鱼COI序列与该斗鱼的相似度依次是98%、98%、97.55%、95.26%、95.93%。通过MEGA.7.0计算种内遗传距离，香港斗鱼海南种群的种内遗传距离在0.000~0.006。在GenBank中下载斗鱼属叉尾斗鱼（M.opercularis）、圆尾斗鱼（M.chinensis）、香港斗鱼（M.hongkongensis）、红鳍斗鱼（M.erythropteru）的COI基因序列（表1），通过MEGA.7.0计算不同斗鱼种间遗传距离，结果显示不同斗鱼种间遗传距离在0.136~0.238，计算结果见表2。上述结果显示斗鱼属种间遗传距离大于香港斗鱼海南种群种内遗传距离（0.000~0.006）的10倍，与10倍理论一致，即种间遗传距离显著大于种内遗传距离，且这种差异达到约10倍以上时，COI基因可对物种进行有效的鉴定^{［29，30］}，说明该斗鱼为独立的一种。香港斗鱼海南种群和广东鹤山种群之间的遗传距离为0.036，遗传差异明显，这与基于Cytb基因的研究结果一致，香港斗鱼不同地理种群之间存在明显的遗传差异^［5］。此外香港斗鱼和圆尾斗鱼之间的遗传距离最大为0.200，和叉尾斗鱼之间的遗传距离在0.123~0.136，和红鳍斗鱼之间的遗传距离为在0.139~0.153。

2.3 香港斗鱼海南种群Cytb基因序列分析和鉴定

通过对万泉河水系采集的香港斗鱼Cytb基因进行PCR扩增，获得了3条1 151 bp长的Cytb基因序列，全序列共1 151个碱基，平均碱基组成比例为26.6% A，26.5% C，13.4% G，33.5% T。NCBI数据库中Cytb基因的比对结果与COI基因的一致，亲缘关系最近的是已发表的香港斗鱼广东鹤山种群，基于Cytb的香港斗鱼海南种群种内遗传距离在0.000~0.009。在GenBank中下载几种斗鱼的Cytb基因序列，序列号见表1，几种斗鱼之间的遗传距离在0.156~0.242，其中香港斗鱼海南种群和红鳍斗鱼之间的遗传距离为0.179，和叉尾斗鱼之间的遗传距离在0.156~0.178，和圆尾斗鱼之间的遗传距离在0.197~0.204，计算结果见表3。

2.4 香港斗鱼海南种群16S rRNA基因序列分析和鉴定

通过对万泉河水系采集的香港斗鱼16S rRNA基因进行PCR扩增，我们获得了5条519 bp长的16S基因序列，全序列共519个碱基，平均碱基组成比例为30.3% A，24.1% C，22.5% G，23.1% T。NCBI数据库中16S rRNA的比对结果与COI和Cytb基因的鉴定结果一致，相似度最高的是已发表的香港斗鱼广东鹤山种群，基于16S rRNA的海南岛香港斗鱼种内遗传距离0.000~0.002。在GenBank中下载几种斗鱼的16S rRNA基因序列，几种斗鱼的种间遗传距离在0.030~0.062，其中香港斗鱼海南种群与红鳍斗鱼之间的遗传距离为0.036，与叉尾斗鱼之间的遗传距离在0.030~0.0.042，与圆尾斗鱼之间的遗传距离最大，为0.043。计算结果见表4。

2.5 香港斗鱼海南种群亲缘关系分析

基于COI、Cytb及16S rRNA基因构建的斗鱼属系统进化树（NJ邻接法）分别见图3、4和图5。三种基因的进化树均显示香港斗鱼海南种群和香港斗鱼广东鹤山种群聚为一支，不同的是COI和Cytb的进化树中香港斗鱼海南种群和广东鹤山种群聚为一支后与红鳍斗鱼聚为一支，再与叉尾斗鱼聚为一支，最后与圆尾斗鱼聚为一支，这与Freyhof等的研究结果一致^［1，28］；而基于16S rRNA的进化树中香港斗鱼海南种群和广东种群聚为一枝后与叉尾斗鱼聚为一支，再与红鳍斗鱼聚为一支，最后与圆尾斗鱼聚为一支。三个进化树中黑色标注为本研究中香港斗鱼海南种群。邻接系统树（neighbor⁃joining tree）各分支的置信度由Bootstrap 1000次循环检验，进化树所用物种名称和GenBank序列号见表1。

3 讨 论

3.1 香港斗鱼海南种群的分子鉴定和亲缘关系

本研究通过COI、Cytb及16S rRNA基因序列的比对和分析，对海南岛万泉河水系采集的5尾疑似香港斗鱼进行分子鉴定和亲缘关系分析。三种序列在NCBI数据库和BOLD数据库中的鉴定结果均表明万泉河水系的斗鱼与已发表的香港斗鱼广东鹤山种群之间的亲缘关系最近，但是相似度均未达到99%以上，可能与香港斗鱼不同种群间存在明显的遗传差异有关^［5］。5尾香港斗鱼种内遗传距离在0.000~0.006，斗鱼属种间遗传距离在0.136~0.238，种间距离大于种内距离的10倍，与10倍理论一致^{［29，30］}，符合物种的有效鉴定，表明万泉河水系发现的斗鱼是香港斗鱼的海南种群。就所查文献和资料，本文为香港斗鱼在海南岛的首次报道。进化树中香港斗鱼和红鳍斗鱼（M.erythropterus）之间的亲缘关系最近，和叉尾斗鱼之间的亲缘关系较远，圆尾斗鱼都处于斗鱼属的外缘，这与基于Cytb基因的斗鱼属亲缘关系分析结果一致。香港斗鱼分布在偏僻地区，各栖息地之间有明显的地理隔离，本研究中香港斗鱼海南种群的种内遗传距离极小，而海南种群和广东鹤山不同地理种群间的遗传距离较大0.036（COI）、0.047（Cytb）、0.016（16S rRNA），再次表明香港斗鱼不同地理种群间遗传差异非常明显。基于香港斗鱼相对密闭的栖息环境以及不同地理种群间明显的遗传差异，可能使香港斗鱼不同种群间存在细微的表型差异。本文中香港斗鱼海南种群研究的样本量有限，未深入研究香港斗鱼的遗传分化和多样性。

3.2 不同基因在物种鉴定和亲缘关系分析中的比较

本研究的结果表明，一方面COI、Cytb及16S rRNA基因对香港斗鱼的种质鉴定结果一致，3种序列比对结果和进化树分析均显示，万泉河水系发现的斗鱼和香港斗鱼广东鹤山种群亲缘关系最近。另一方面基于3种基因的斗鱼属亲缘关系不同，COI和Cytb 进化树的聚类顺序是香港斗鱼、红鳍斗鱼、叉尾斗鱼和圆尾斗鱼，而16S rRNA的聚类顺序是香港斗鱼、叉尾斗鱼、红鳍斗鱼和圆尾斗鱼。此外COI和Cytb基因的斗鱼属种间遗传距离（0.036~0.238（COI）、0.047~0.242（Cytb））整体大于16S rRNA（0.016~0.062（16S rRNA））。本文中COI和Cytb比16S rRNA更适合用于斗鱼属种间亲缘关系分析，这可能与16S rRNA基因常用于种以上不同科、属之间的系统进化研究，而COI基因在种内和同属种间的趋异性均要高于16S rRNA基因有关^［16~18］。

因样本量和可参考的数据有限，本文的研究存在不足，深入的探讨很有必要。本研究为香港斗鱼不同种群的鉴定提供参考，为香港斗鱼海南种群的后续保育和研究提供依据，具有重要意义。

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基金资助

海南省科技专项资助(ZDYF2021XDNY299)