阴香叶精油化学成分及抗菌活性

Chemical composition and antifungal activity of essential oil of Cinnamomum burmannii leaves

摘要

研究阴香叶精油的化学成分及体外抗真菌活性，以期为开发绿色、安全、高效的抑菌剂提供参考。水蒸气蒸馏法提取阴香叶精油，气相色谱⁃质谱法（GC⁃MS）分析精油成分；熏蒸法研究阴香叶精油抗黄曲霉菌和黑曲霉菌的活性；超高效液相色谱⁃串联质谱（UPLC⁃MS/MS）分析精油对黄曲霉毒素B₁（AFB₁）和赭曲霉毒素A（OTA）的抑制作用。从阴香叶精油中鉴定出38种化学成分，主要成分有龙脑、桉油精、α⁃水芹烯、p⁃伞花烃、α⁃萜品醇、乙酸龙脑酯等。阴香叶精油用量为40 μL时，对黄曲霉菌丝体的抑制率为92.59%，对AFB₁的抑制率为47.05%；精油用量为20 μL时，黑曲霉菌丝体的抑制率为67.18%，对OTA的抑制率为100%。阴香叶精油的化学成分丰富，具有显著抑制黄曲霉菌，黑曲霉菌及毒素产生的作用，具有开发为抑菌剂的应用价值。

Abstract

To investigate the constituents and antifungal activity of essential oil of Cinnamomum burmannii leaves， and to provide reference for the development of green， safe and efficient bacteriostatic agents， the essential oil was extracted by steam distillation method and analyzed by gas chromatography⁃mass spectrometry （GC⁃MS）. The headspace volatile assay was used to evaluate the anti⁃fungal （Aspergillus flavus， Aspergillus niger） properties of essential oil. Ultrahigh⁃performance liquid chromatography⁃triple quadrupole tandem mass spectrometry （UPLC⁃MS/MS） was used to analyze the inhibitory effect of essential oil on aflatoxin B₁ （AFB₁） and ochratoxin A （OTA）. Totally， 38 compounds were identified， and maily including borneol， eucalyptol， α⁃phellandrene， p⁃cymene， α⁃terpineol， bornyl acetate. When the dosage of essential oil of C. burmannii leaves was 40 μL， the inhibition rates of the mycelium of Aspergillus flavus and AFB₁ were 92.59% and 47.05%， respectively. When the volume of essential oil was 20 μL， the inhibition rates on the mycelium of Aspergillus niger and OTA were 67.18% and 100%. The essential oil of C. burmannii leaves has a certain inhibitory effect on the growth of Aspergillus flavus， Aspergillus niger and the production of mycotoxins. The essential oil of C. burmannii leaves has the application value of developing as bacteriostatic agent.

Graphical abstract

关键词

阴香 / 精油 / 气相色谱⁃质谱 / 黄曲霉菌 / 黑曲霉菌 / 真菌毒素

Key words

Cinnamomum burmannii / essential oil / gas chromatography⁃mass spectrometry （GC⁃MS） / Aspergillus flavus / Aspergillus niger / mycotoxin

0 引 言

阴香（Cinnamomum burmannii）为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）多年生常绿乔木，主要分布在我国的中南部和东南部地区，包括广东、广西、福建、云南、海南、贵州、福建等省份^［1］。阴香的皮、根、叶均可入药，其皮能温中、散寒、祛风湿，可治食少、腹胀、水泻、脘腹疼痛、风湿、疮肿、跌打扭伤等病症^［2］，并且还能作为香料食用^［3］；叶能治风湿骨痛、寒湿泻痢、腹痛等病症^［4］。阴香叶含有丰富的挥发性成分，具有抗氧化^［5］、防蛀^［6］、抗菌^{［4，7，8］}等活性。

食品、谷物、果蔬、中药材等在种植、采收、加工、储藏过程中因温度、湿度等条件的影响，极易被黄曲霉菌、黑曲霉菌等真菌污染而出现发霉变质的现象。真菌侵染不仅造成农产品营养物质的损失，还影响其质量和产量，造成巨大的资源浪费和经济损失，而真菌产生的真菌毒素严重威胁人类、动物的健康和生命安全^［9］。真菌毒素是由真菌产生的有毒次生代谢产物，其中以黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮等比较常见^［10］。真菌毒素一般具有致畸、致癌、致突变作用，还具有肝脏毒性、肾毒性、细胞毒性等^［11］。人工合成的杀菌剂残留严重，降解周期长、并具有致癌、致畸等问题^［9］。因此，寻找新型真菌和真菌毒素合成抑制剂显得尤为重要。植物精油具有挥发性好、安全无残留等优点。肉桂、山苍子等精油具有显著抑制黄曲霉菌和黄曲霉毒素的作用^{［12，13］}。阴香叶精油具有抗菌特性，但在抗黄曲霉、黑曲霉及真菌毒素产生的研究方面还未见报道。本研究采用GC⁃MS分析了海南产阴香叶精油的成分，并考察了精油对黄曲霉菌、黑曲霉菌生长和黄曲霉毒素B₁（AFB₁）和赭曲霉毒素A（OTA）的累积抑制作用，以其为开发绿色、安全、高效的抑菌剂提供参考。

1 材料、仪器与试剂

① 阴香叶采自中国医学科学院药用植物研究所海南分所南药园，经吴明松助理研究员鉴定为阴香的新鲜叶片。黄曲霉（Aspergillus flavus）CGMCC 3.4410和黑曲霉（Aspergillus niger）ITEM⁃5222购买于中国微生物菌种保藏管理中心（北京）。黄曲霉毒素B₁（AFB₁），黄曲霉毒素B₁内标（［¹³C₁₇］⁃AFB₁），赭曲霉毒素A（OTA），赭曲霉毒素A内标（［¹³C₂₀］⁃OTA）购自新加坡PriboLab公司。乙酸乙酯，甲醇，乙腈，甲酸（色谱纯，Fisher公司）。无水硫酸钠（分析纯，西陇化工股份有限公司）。PDA培养基（北京索莱宝科技有限公司）。

② 仪器。Agilent 7890A气相色谱仪，5975C四极杆质谱仪，7683B自动进样器（美国安捷伦公司）；Waters TQD三重四极杆串联质谱仪（美国Waters 公司）；Mili⁃Q纯水仪（美国，Millipore公司）；XS105DU十万分之一电子天平（上海托利多有限公司）；高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；恒温培养箱（上海一恒科学仪器公司）；光学显微镜（Ⅸ51， Olympus， Tokyo， Japan）。

2 方 法

2.1 阴香叶精油制备

取新鲜的阴香叶剪碎，加入10倍量的纯水，浸泡1 h，水蒸气蒸馏提取6 h，冷却至室温，收集精油，加入适量无水硫酸钠除水。取挥发油10 μL 溶解于1.5 mL的乙酸乙酯中，混匀，过0.22 μm滤膜，备用。

2.2 GC⁃MS条件

Agilent DB⁃5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；升温程序：起始温度50 ℃，以3 ℃/min升温至145 ℃，以5 ℃/min升温至250 ℃；进样口温度240 ℃，分流比10∶1，进样量1.0 μL；载气为氦气，流速为1.0 mL/min。EI离子源温度为230 ℃，传输线温度250 ℃，电离电压70 eV，质量扫描范围 m/z 40~550，溶剂延迟3 min。

2.3 UPLC⁃MS/MS条件

AFB₁和OTA的检测参考课题组相关研究的真菌毒素UPLC⁃MS/MS检测方法^［14］。Waters ACQUITY BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm； Waters Corp.），柱温40 °C。流动相为甲醇（含0.1%甲酸，A）和水（2 mmol/L甲酸铵，B），流速为0.3 mL/min，洗脱程序为0~1 min， 25%A； 2~4 min， 25%~45%A； 4~6 min： 45%~60%A； 6~14 min： 60%~95%A； 14~19 min， 95%A； 19~20 min， 95~25%A。进样量：2.0 μL。电喷雾子离子源正离子模式（ESI⁺），毛细管电压为3.5 kV，离子源温度为150 °C，脱溶剂温度为350 °C，脱溶剂气流速为500 L/h， 锥孔反吹气流速为50 L/h， 多反应监测模式采集（MRM）。AFB₁和OTA的定量离子对分别为：313.2>241.1，404.2>105.1。

2.4 黄曲霉菌的复苏和孢子悬浮液的配制

用酒精棉球擦拭黄曲霉和黑曲霉冻干粉菌种管外壁，点燃酒精灯，将菌种管封口一端置外焰处烧灼，用无菌滴管吸取适量灭菌水（121 ℃，30 min）滴在菌种管封口使其迅速冷却而炸裂。加入1 mL灭菌水于菌种管内，充分溶解后，将全部菌液接种至PDA培养基的无菌培养皿中，上盖后，移入恒温培养箱，在温度28 ℃，相对湿度90%条件下，培养7 d。黄曲霉菌和黑曲霉菌培养7 d后，打开上盖，在黄曲霉菌和黑曲霉菌孢子的培养基表面缓缓加入2 mL无菌水（0.1%吐温80），用灭菌的接种环按顺时针轻轻将孢子刮入灭菌水中，完毕后将孢子悬液母液倒入15 mL灭菌离心管中（内置无菌玻璃球），手摇充分震荡，无菌脱脂棉过滤，得孢子悬浮液。取10 μL母液用无菌水稀释100倍后用血细胞计数板和倒置显微镜观察计数，最后将母液分装稀释，调节浓度为10⁶ 孢子/mL，制得后期实验所用的黄曲霉菌和黑曲霉菌的孢子悬浮液。

2.5 阴香叶精油抗菌实验

准确量取15 mL已高温灭菌的PDA培养基置于无菌的培养皿中，待培养基冷却凝固后，将2 μL黄曲霉菌和黑曲霉菌孢子悬浮液（10⁶ 孢子/mL）接种于培养基中央，将无菌滤纸片粘贴在培养皿上盖，取适量的阴香叶精油滴在无菌纸上，待吸收后，将培养皿盖上盖，对照组使用无菌水，培养皿用封口膜封口，放置于恒温（28 ℃）培养箱中培养（黄曲霉菌培养9 d，黑曲霉菌培养7 d），每个实验平行3次。每天测量菌落的直径，采用十字交叉法测定2次，结果取平均值。菌丝抑制率（%）=（d_c -d_t ）/d_c ×100%，其中，d_c 和d_t 分别为对照组和处理组的菌落直径的平均值。

2.6 毒素检测样品制备方法

待培养结束后，将培养皿中的所有内容物溶解于50 mL的乙腈⁃水（84∶16，V/V）溶液中，均质10 min，超声提取30 min，过滤，滤液4 ℃离心15 min （13 000 rmp/min）， 取上清液过0.22 μm的滤膜，UPLC⁃MS/MS检测AFB₁和OTA的含量。产毒抑制率：Y（%）=（a-b）/a×100%，其中，a为对照组中真菌毒素的含量，b为处理组中真菌毒素含量。

3 结果与分析

3.1 阴香叶精油GC⁃MS分析

利用GC⁃MS对阴香叶精油的挥发性成分进行分析，获得总离子流图（图1），经NIST数据图匹配并参考有关文献对检出成分进行定性，峰面积归一化法计算各化合物的相对百分含量（见表1）。由图1和表1可知，从阴香叶挥发油中共鉴定出38种成分，其中含量相对较高（相对含量>0.1%）的有25种，主要有龙脑（borneol，26.783%）、桉油精（eucalyptol，19.434%）、α⁃水芹烯（α⁃phellandrene，8.401%）、p⁃伞花烃（p⁃cymene，6.785%）、α⁃萜品醇（α⁃terpineol，5.915%）、乙酸龙脑酯（bornyl acetate，4.104%）等化合物，这几种成分的相对含量占总成分的71.422%。

目前已有少量的文献，采用GC⁃MS分析了不同提取方法的阴香叶精油的成分。有学者采用超临界CO₂提取云南阴香叶挥发油，鉴定了33种化合物，主要成分为龙脑（47.23%），α⁃萜品醇（2.12%），乙酸龙脑酯（5.42%），香豆素（coumarin，13.20%），桉油烯醇（spathulenol，3.17%），石竹烯氧化物（caryophyllene oxide，2.88%）等^［15］。采用水蒸气蒸馏法提取广东不同地区阴香叶精油，主要成分为：龙脑（15.95%~88.77%），桉油精（13.38%~35.35%），石竹烯（caryophyllene，13.3%~25.14%），桉油烯醇（12.36%~23.85%），氧化石竹烯（caryophyllene oxide，17.87%~20.46%），β⁃毕澄茄烯（β⁃cadinene，17.16%~19.54%），反式橙花叔醇（trans⁃nerolidol，15.95%~18.33%），α⁃水芹烯（15.45%~24.53%）^［16］。采用水蒸气蒸馏法提取广西阴香叶精油，鉴定了61个化合物，主要成分为石竹烯（21.71%）、桉油精（18.22%）、愈创醇（guaiol，7.52%）、α⁃萜品醇（7.06%）、β⁃蒎烯（β⁃pinene，3.57%）、γ⁃桉叶醇（γ⁃eudesmol，3.33%）、异愈创木醇（bulnesol，3.16%）、橙花叔醇（nerolidol，3.16%）、榄香醇（elemol，2.67%）、α⁃石竹烯（α⁃caryophyllene，2.22%）等化合物^［5］。有学者采用固相微萃取（SPME）结合GC⁃MS分析了阴香叶精油的成分，鉴定了39种化合物，其中主要成分为龙脑（19.68%），桉油精（10.49%），乙酸双环［2.2.1］庚⁃2⁃2基酯，（aceticacid，1，7，7⁃trimethyl⁃bicyclo［2.2.1］hept⁃2⁃ylester，9.65%），α⁃蒎烯（α⁃pinene，7.36%），D⁃柠檬烯（D⁃limonene，6.45%），石竹烯（5.80%）等^［17］。综上所述，阴香叶精油的成分主要是龙脑，桉油精，α⁃萜品醇等成分，不同的提取方法对精油成分的相对含量有影响。此外，阴香为多年生乔木植物，分布较广，不同地区的气候差异也可能是成分差异的另一个主要原因。相关研究表明，阴香叶提取物具有抑菌、抗氧化的活性，故本实验选择阴香叶精油开展抗黄曲霉和黑曲霉的作用研究。

3.2 阴香叶精油抑制黄曲霉菌和黑曲霉菌作用

实验中通过熏蒸法，评价了阴香叶精油对黄曲霉菌和黑曲霉菌的抑制作用，为了便于抑菌效果的比较，将空白对照组菌落直径为（7.5±0.2） cm的天数为最终的培养天数，故黄曲霉菌的培养天数为9 d，黑曲霉菌的培养天数为7 d。不同阴香叶精油处理的黄曲霉菌和黑曲霉菌在规定的培养天数下菌落图见图2。阴香叶精油对黄曲霉和黑曲霉菌丝体的抑制作用见图3。由图可知，随着精油量的增加，黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长受到了不同程度的抑制，其菌丝的生长与精油的浓度剂量呈现依赖性。精油量大于20 μL时，对黄曲霉菌的抑制作用显著增强；精油量大于40 μL（45 μL）时，在结束培养时未观察到任何黄曲霉菌丝体的生长。精油量为5，10，20，30，40 μL，黄曲霉菌丝体的抑制率分别为10.05%，18.91%，60.31%，73.15%，92.59%。由图3b可知，阴香叶精油对黑曲霉有更强的抑制作用，精油量大于30 μL（35 μL）时，在结束培养时未观察到任何黑曲霉菌丝体的生长；精油量为5，10，20，30 μL，黑曲霉菌丝体的抑制率分别为：15.90%，34.74%，67.18%，81.92%。结果表明阴香叶精油能够显著抑制黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长。

3.3 阴香叶精油对AFB₁和OTA的抑制作用

实验中为了考察阴香叶精油对黄曲霉、黑曲霉中主要真菌毒素AFB₁和OTA合成的抑制作用，待不同处理的黄曲霉和黑曲霉菌的菌落直径长至（7.5±0.2）cm时，按照“2.6毒素检测样品制备方法”制备样品溶液，UPLC⁃MS/MS进行检测。由图4可知，不同阴香叶精油处理的黄曲霉和黑曲霉菌落直径长至（7.5±0.2） cm的天数差异明显。空白组和不同量阴香叶精油处理后AFB₁和OTA的含量，结果见图5。由图可知，阴香叶可以显著抑制AFB₁的合成，不同处理间AFB₁的含量达到显著水平（P<0.05）。精油对AFB₁的抑制作用呈现剂量依赖性，随着浓度的增加，AFB₁的含量显著降低，不同处理的AFB₁合成抑制率也呈上升趋势，精油量为40 μL时，抑制为47.05%。阴香叶精油对黑曲霉菌中OTA的合成有显著的抑制作用，不同处理间OTA的含量达到极显著水平（P<0.01）。精油量为5 μL，10 μL时，毒素的抑制率分别为81.18%和95.17%，20 μL时已检测不到OTA，可以完全抑制OTA的合成（抑制率100%）。上述结果表明阴香叶精油对黄曲霉和黑曲霉中AFB₁和OTA毒素的合成有较强的抑制作用。

目前，植物精油抗菌作用研究已成为研究的热点。国内外的学者也通过实验证明了植物精油对黄曲霉、黑曲霉的生长及黄曲霉毒素、赭曲霉毒素的产生有一定的抑制作用。本文通过对阴香精油成分的分析表明，其主要成分包括龙脑、桉油精、α⁃水芹烯、p⁃伞花烃、α⁃terpineol、乙酸龙脑酯等成分。龙脑作用后黑曲霉结构遭到严重破坏，致使真菌溶解死亡，发挥抗菌作用^［18］。桉油精也有显著抗黄曲霉和黑曲霉的作用^［19~21］，主要通过与可溶性细胞外蛋白形成复合物，促进细胞氧化损伤，破坏电子传递链，导致细胞动态平衡的紊乱发挥抗菌和毒素合成。此外，α⁃terpineol、乙酸龙脑酯等成分也有抗黄曲霉和黑曲霉的活性^［22］。因此，阴香叶精油中发挥抗黄曲霉，黑曲霉及真菌毒素的主要成分可能是龙脑、桉油精、α⁃terpineol、乙酸龙脑酯等成分。植物精油成分复杂，各成分存在协同抗菌作用的现象，但作用机制仍不清楚^［23］。阴香叶中主要成分的抗菌活性，各成分间的相互作用及抑菌，抑制毒素合成的机理将是未来研究的内容。

4 结 论

本研究采用GC⁃MS对水蒸气蒸馏法提取的阴香叶的精油进行分析，主要成分是龙脑、桉油精、α⁃水芹烯、p⁃伞花烃、α⁃terpineol、乙酸龙脑酯等化合物。阴香叶精油可以有效抑制黄曲霉、黑曲霉菌的生长及真菌毒素的产生。阴香叶精油作为防腐剂，抗菌剂应用在谷物、果蔬、中药材等领域有一定的应用价值。

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基金资助

海南省自然科学基金人才项目(2019RC342)

海南省重点研发项目(ZDYF2020183)

国家自然科学基金(82074130)