P75^NTR在绒山羊毛囊生长周期中的表达

Expression of P75^NTR in the growth cycle of cashmere goat follicles

摘要

实验旨在研究绒山羊（Capra hircus）毛囊生长相关基因的表达规律，为绒山羊分子育种提供参考。本实验采用RT⁃PCR、组织免疫荧光、Western blot等方法，研究神经营养素受体P75^NTR在辽宁绒山羊皮肤组织中的表达和分布情况。结果表明：在毛囊生长周期的三个时期，均监测到P75^NTR mRNA及蛋白的存在，P75^NTR的荧光信号在退行期要强于其他两个时期，且在退行期毛囊外根鞘细胞中检测到P75^NTR的高表达。以上结果表明，P75^NTR mRNA及蛋白的表达与毛囊生长周期变化有一定的相关性，P75^NTR受体在绒山羊的毛囊周期性变化中发挥着重要的功能。

Abstract

The purpose of this experiment is to study the expression of genes related to cashmere goat follicle growth and provide reference for molecular breeding of cashmere goats（Capra hircus）. The expression and distribution of neurotrophin receptor P75^NTR in Liaoning cashmere goat skin were studied by RT⁃PCR and tissue immunofluorescence. The results showed that P75^NTR mRNA and protein were detected at all three stages of hair follicle growth cycle， and the fluorescence signal of P75^NTR was stronger in the degenerative stage than in the other two stages， and the high expression of P75^NTR was detected in the outer root sheath cells of hair follicle in the degenerative stage. The above results show that the expression of P75^NTR mRNA and protein has a certain correlation with the hair follicle growth cycle， and P75^NTR receptor plays an important role in the hair follicle cycle of cashmere goats.

Graphical abstract

关键词

绒山羊 / 神经营养素受体P75^NTR / 毛囊生长周期

Key words

cashmere goat / neurotrophin receptor P75^NTR / hair follicle growth cycle

0 引 言

绒山羊（Capra hircus）皮肤中的毛囊无论在胚胎期还是生后期均具有自我更新和周期性生长的特点，均经历生长期（anagen）、退行期（catagen）和休止期（telogen）三个时期^［1，2］，是一个复杂的生理生化过程。许多因素会影响这一周期，从而影响毛囊的生长^［3，4］。因此，寻找能够影响次级毛囊生长发育的调控因子和相关基因对阐明毛囊生长周期的调控机制、改善绒毛品质、提高羊绒产量具有重要意义。

P75^NTR是神经营养素家族（neurotrophin family，NTFs）的受体之一，属于膜蛋白的肿瘤坏死因子受体超家族，它与神经生长因子（nerve growth factor， NGF）、脑源性神经营养因子（brain⁃derived neurotrophic factor， BDNF）、神经营养蛋白4/5（neurotrophin⁃4/5， NT⁃4/5）、神经营养蛋白⁃3（neurotrophin⁃3， NT⁃3）等神经营养因子以较低亲和力结合^［5，6］。近年来的研究发现，NGF除了在神经系统发挥作用之外，在一些非神经系统仍具有许多生长调节功能^［7］。在大鼠中，NGF及其受体表达于毛囊发育的周期中，且NGF的水平也可影响大鼠和小鼠的毛囊形态^［8，9］。但由于物种间存在显著差异，导致毛囊发育机制也会存在一定的差异。因此，确定NGF是否对绒山羊的毛囊周期性发育具有调控作用，首要解决的问题是检测NGF及其受体能否在不同发育时期的绒山羊皮肤毛囊中表达。有前期研究发现NGF及其受体TrkA（tyrosine kinase receptor A）的mRNA存在于绒山羊毛囊生长周期各阶段的皮肤组织中，且生长期高表达，说明NGF及其受体与毛囊生长周期变化有一定的相关性^［10］。毛囊的周期性转换会导致细胞的分化与凋亡，那么P75^NTR作为一种凋亡受体，是否也会存在于毛囊的生长周期中呢？如果存在，其功能又有哪些均未见报道。

综上，本实验采用RT⁃PCR，组织免疫荧光、Western blot等方法检测了被称为死亡受体的P75^NTR在辽宁绒山羊毛囊生长周期中的表达及定位，为深入研究影响绒山羊毛囊生长发育的因素及作用机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集

实验所用辽宁绒山羊，全部来自辽宁省绒山羊育种中心。皮肤组织分三个时期（生长期、退行期、静止期）采集1周岁辽宁绒山羊，于羊体右侧肩胛骨后沿背中线与腹中线的上1/3处剪去绒和毛，对裸露皮肤进行消毒处理，经消毒后取大小1 cm²左右的体侧皮肤置于去RNA酶离心管中，立即置于液氮中冷冻保存备用。同时，将上述皮肤组织切成约1 cm×1 cm×0.2 cm的块状，用OCT包埋剂将皮肤组织固定形状后，同样置于液氮中冷冻保存备用。

1.2 RNA提取及cDNA合成

将皮肤组织在液氮中研磨成粉末状加入含有1 mL Trizol裂解液的无RNase离心管中，室温放置5 min。其余步骤参照Trizol说明书提取总RNA，利用NanoDrop 2000（Thermo Scientific）测定总RNA的纯度与浓度，立即进行cDNA的合成。根据测定的RNA浓度调整使用RNA的体积，使各组织样品反转录体系的RNA量相同。反转录试剂购自大连宝生物TaKaRa公司。反转录反应体系（25 μL）：总RNA 2 μg，10 mmol/L Oligo（dT）18引物1 μL，10 mmol/L dNTP 1.25 μL，RNase inhibitor 25 U，M⁃MLV 200 U，5×反应缓冲液5.0 μL，焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水补至25.0 μL；反转录条件：恒温金属浴70 ℃变性5 min，42 ℃反转录60 min，即得cDNA，-80 ℃保存备用。

1.3 RT⁃PCR反应

PCR 总反应体系为25μL：cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，引物各0.5 μL，rTaq 0.2单位。反应条件为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，57 °C退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶检测。引物见表1.

1.4 实时荧光定量PCR

按SYBRPremix Ex Taq（Perfect Real Time）要求进行实时PCR反应，反应体系20 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，57 ℃退火20 s，共45个循环，熔解曲线分析有助于区分特异性和非特异性扩增。扩增曲线及熔解曲线由计算机自动绘制。每1份标本均检测3次，计算每份标本P75^NTR/GAPDH比值，取3次平均值比较P75^NTR 基因表达水平。

1.5 Western blot检测

用细胞裂解液及1 mmol/L的苯甲磺酰基氟化物提取皮肤组织总蛋白。采用8%的SDS⁃PAGE电泳。电泳结束后，将胶轻轻取下，放入转膜液中平衡10 min。裁取与胶相同大小的一块PVDF膜，和膜板。先将膜在甲醇中浸泡5 min，再浸入转膜液中平衡5 min，同时将滤纸也放在转膜液中平衡。然后由下至上按膜板、PVDF膜、凝胶、膜板的次序在电转夹中固定好，每层尽可能排尽气泡。然后将转膜夹放入转膜仪中，200 V转膜20 min。转膜结束后，将膜在TBST中漂洗一次，然后用5%脱脂奶粉常温封闭至少2 h。然后加入用封闭液稀释好的一抗，4 ℃过夜（一抗按1∶200稀释）；结束后，用TBST洗膜3次后，加入用TBST稀释好的二抗室温孵育1 h（二抗按1∶1 000稀释）。TBST漂洗3次后，用ECL显色。

1.6 免疫荧光检测

利用冰冻切片机（Leica CM3050S）将从液氮中取出的已被OCT包埋过的皮肤组织切成8 µm厚度的薄片，贴合到赖氨酸包被过的载玻片上，常规方法HE染色后备用。取出切片，室温放置15 min，用PBS冲洗5 min×3次；滴加10%正常山羊血清37 ℃封闭30 min；滤纸吸去多余液体，加入兔抗anti⁃P75（1∶400；Santa），放入湿盒中，4 ℃冰箱中孵育过夜；PBS冲洗5 min×3次；避光条件下加入羊抗兔IgG⁃FITC（1∶100；武汉博士德），37 ℃孵育30 min；避光条件下PBS冲洗5 min×5次；避光条件下滴加防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

1.7 统计分析

采用SPSS20.0统计软件包对数据进行分析，用“平均数±标准差”表示，采用单因子方差分析（One⁃way ANOVA）。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 P75^NTR mRNA目的基因片段的扩增

电泳图显示清晰完整的28S和18S两条带，5S条带较暗，分光光度计Nanodrop 2000测定结果显示总RNA的OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值为1.9~2.0，符合RT⁃PCR要求。用RT⁃PCR方法检测到内参基因GAPDH（211 bp）、P75^NTR （280 bp）的特异性条带，说明P75^NTR 的mRNA表达于绒山羊毛囊生长周期皮肤组织中，并可能参与毛囊的生长发育过程。

2.2 P75^NTR mRNA在毛囊生长各时期的定量结果

为了比较不同阶段皮肤组织中P75^NTR mRNA的表达水平，利用荧光定量PCR对三个时期皮肤组织中的P75^NTR mRNA进行定量分析。结果显示，退行期中P75^NTR mRNA的表达水平显著高于休止期和生长期，休止期也显著高于生长期（P<0.05）。

2.3 目的蛋白的检测

为了检测P75^NTR的蛋白是否参与毛囊循环周期，我们对P75^NTR的蛋白表达进行了Western印迹分析。结果表明：P75^NTR存在于整个毛囊循环周期中（图1）。作为阳性对照，在退行期中检测到P75^NTR蛋白高表达，并且显著强于休止期或生长期（P<0.05）。正常的山羊血清代替一抗的阴性对照中，检测不到信号。

2.4 P75^NTR在毛囊生长周期中的免疫荧光定位

为了进一步证实毛囊中P75^NTR的存在，利用免疫荧光证实了它们在毛囊生长周期中蛋白质的定位（图2）。结果表明，在PF和SF的毛囊生长周期（休止期，生长期，退行期）的所有阶段都检测到P75^NTR。同时，退行期中，在外根鞘（outer root sheath，ORS）和内根鞘（inner root sheath， IRS）细胞中检测到P75^NTR的高表达。表达信号在生长期最弱，退行期最强。此外，在每个生长阶段的表皮中均观察到P75^NTR免疫反应性，信号强度与ORS中的一致。在阴性对照中没有可见的染色，其中一抗用磷酸盐缓冲盐水（PBS）代替。

3 讨 论

毛囊的发育是一系列的信号分子作用于不同的细胞上，相互调控，使得细胞不断增殖（休止⁃生长）、分化（休止⁃生长）、凋亡（生长⁃退行）的过程。近年来的研究已经发现了一些影响毛囊周期性转换的重要分子，但作用机制仍不十分清楚。课题组前期研究首次证实NGF及其高亲和力受体TrkA的mRNA和蛋白存在于绒山羊毛囊生长周期的所有阶段，且在休止期至生长期转换过程中，对毛囊细胞的增殖及分化具有正向的调控作用^［11］。

经典的理论认为P75^NTR和TrkA是NGF的两个受体。细胞膜上存在TrkA时，NGF与其结合，TrkA介导的促细胞存活与增殖的通路被激活（PI3K⁃Akt、TRAF6⁃NF⁃κB；Ras⁃MAPK），则对细胞具有增殖的作用，当NGF与p75NTR结合则具有促进神经细胞、肌细胞、SCs和淋巴细胞等的凋亡作用^{［12，13］}。但是，有研究表明，当细胞膜上存在TrkA和P75^NTR两种受体时，有时细胞的凋亡信号还是会启动，抑制上面提到的NGF诱导的促生长信号的传递，原因就是神经生长因子前体（nerve growth factor precursor， proNGF）和Sortilin（NGF的第三受体）启动细胞内凋亡信号的结果^［14］。NGF虽然在体内含量很低，但是对靶细胞的生长发育有密切关系，机体首先分泌合成proNGF，然后由蛋白酶分解为成熟的NGF。NGF和proNGF通过结合高亲和力酪氨酸激酶受体（TrkA）和低亲和力受体（P75^NTR）来调控细胞的生死。毛囊生长期至退行期的转换是一个毛囊细胞不断凋亡的过程，p75NTR是否存在，如果存在，其在三个时期是否有量的变化，这关系到NGF和proNGF之间的比例变化以及调控细胞生死的机制。

本实验利用免疫荧光法证实了P75^NTR在毛囊生长周期中蛋白质的定位，发现P75NTR的荧光信号在退行期要强于其他两个时期，且在退行期的毛囊细胞中检测到P75^NTR的高表达。利用RT⁃PCR及Western blot法检测到P75^NTR的mRNA及蛋白也存在于毛囊生长周期的所有阶段。其中，退行期中mRNA的表达水平显著高于生长期和休止期；退行期和休止期绒山羊皮肤中P75^NTRmRNA蛋白水平显著高于生长期，这与我们前期研究中受体TrkA在三个时期中的表达正好相反。研究结果提示我们：在绒山羊皮肤组织中有NGF及其受体（TrkA、P75^NTR）转录事件的发生，NGF及其受体参与毛囊的生长周期变化过程，且NGF对毛囊细胞增殖、分化与凋亡的调控依赖于与其受体的结合。

有学者发现，虽然NGF可以与细胞膜表面的TrkA或P75^NTR结合发挥作用，但是当细胞膜上有Sortilin受体存在时，proNGF则以强亲和力与P75^NTR、Sortilin两个受体在细胞膜上形成三聚体，诱导细胞的凋亡^［15］。当缺乏Sortilin时，会刺激细胞外蛋白酶分解proNGF为NGF，从而启动TrkA介导的促进细胞生长的信号通路。因此，Sortilin决定着proNGF与NGF谁在与受体结合的竞争中占优势，并决定proNGF与TrkA结合还是与P75^NTR结合。因此，Sortilin是proNGF诱导细胞凋亡信号启动的关键。

课题组前期研究发现，在绒山羊毛囊发育生长期的细胞核中检测到了proNGF的免疫阳性，信号较强，结合本实验我们证实了p75NTR在毛囊生长周期中蛋白质的定位，发现P75NTR的荧光信号在退行期要强于其他两个时期，且在退行期的毛囊细胞中检测到P75^NTR的高表达。此结果提示我们，proNGF/NGF/P75/sortilin有可能在绒山羊毛囊周期转换过程中发挥重要作用，其如何作用尚需要进一步研究。

参考文献

[1] Ji S, Zhlt Z, Sltn X, et al. Functional hair follicle regeneration: an updated review [J].Signal Transduct Target Ther, 2021, 6(1):66.

[2] Yuan C, Wang X L, Geng R Q, et al. Discovery of cashmere goat (Capra hircus) microRNAs in skin and hair follicles by Solexa sequencing [J]. BMC Genomics, 2013, 14: 511.

[3] Stenn K S, Paus R. Controls of hair follicle cycling [J]. Physiol Rev, 2001, 81(1): 449⁃494.

[4] Liu B, Gao F Q, Guo J, et al. A microarray⁃based analysis reveals that a short photoperiod promotes hair growth in the Arbas cashmere goat [J]. PLoS One, 2016, 11(1): e0147124.

[5] eftiFranz H. Neurotcophic factors [M]. Berlin Heidel⁃berg : Springer⁃Verlag, 1999.

[6] Harry G J, Lefebvre d'Hellencourt C, McPherson C A, et al. Tumor necrosis factor p55 and p75 receptors are involved in chemical⁃induced apoptosis of dentate granule neurons [J]. J Neurochem, 2008, 106(1): 281⁃298.

[7] Botchkarev V A, Botchkareva N V, Peters E M J, et al. Epithelial growth control by neurotrophins: leads and lessons from the hair follicle [J]. Prog Brain Res, 2004, 146: 493⁃513.

[8] Botchkareva N V, Botchkarev V A, Albers K M, et al. Distinct roles for nerve growth factor and brain⁃derived neurotrophic factor in controlling the rate of hair follicle morphogenesis [J]. J Invest Dermatol, 2000, 114(2): 314⁃320.

[9] Peters E M J, Hendrix S, Gölz G, et al. Nerve growth factor and its precursor differentially regulate hair cycle progression in mice [J]. J Histochem Cytochem, 2006, 54(3): 275⁃288.

[10] Ma W, Yang H X, Sun L M, et al. Expression of nerve growth factor in skin tissues and its effect on the proliferation of outer root sheath cells in cashmere goats [J]. Livest Sci, 2016, 191: 29⁃36.

[11] Wang C Q, Liu Y H, Wei M. Nerve growth factor regulates the proliferation of cashmere goat outer root sheath cells through the activation of cAMP⁃binding protein [J]. Small Ruminant Research, 2019, 178:30⁃36.

[12] Li C M, Watanabe G, Gen W, et al. Expression of nerve growth factor (NGF), and its receptors TrkA and p75 in the reproductive organs of the adult male rats [J]. Zoolog Sci. 2005, 22(8): 933⁃7.

[13] Davis⁃López de Carrizosa M A, Morado⁃Díaz C J, Morcuende S, et al. Nerve growth factor regulates the firing patterns and synaptic composition of motoneurons [J]. J Neurosci, 2010, 30(24): 8308⁃8319.

[14] Kalb R.The protean actions of neurotrophins and their receptors on the life and death of neurons [J]. Trends in Neurosciences, 2005, 28(1):5⁃11.

[15] Nykjaer A, Lee R, Kenneth K T, et al. Sortilin is essential for proNGF induced neuronal cell death [J]. Nature, 2004(427): 843⁃848.

基金资助

辽宁省教育厅青年科技人才育苗项目(JYTQN2020016)

辽宁省自然科学基金计划项目(2022-MS-387)

国家级大学生创新训练项目(201910160004)