基于高通量和传统培养法分析白首乌根际真菌多样性

Analysis of fungal diversity in the rhizosphere of Cynanchum bungei Decne based on high⁃throughput and traditional culture methods

摘要

探讨白首乌根际土壤真菌群落组成结构与分布规律，为优选根际促生菌、提高仿野生种植技术提供科学理论依据。综合Illumina MiSeq高通量测序技术和传统分离培养技术，分析测定3个产地2个根茎深度的白首乌根际土壤真菌群落的丰富度和多样性，分离鉴定可培养根际真菌的种类。6个样品共得到真菌1 589个OTUs，分属于11门35纲84目142科237属，子囊菌门（Ascomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）是样品共同的优势菌门；6个样品通过传统培养法共分离得到103个形态型，分为3门8纲10目12科16属37种，优势菌属为木霉属（Trichoderma）和镶刀菌属（Fusarium）。综合比较，高通量测序技术可以得到更全面的菌落数据，传统分离培养技术可以纯化出适应性强的菌株；不同产地和根茎深度样品间土壤真菌群落存在显著差异性。

Abstract

The composition， structure and distribution of rhizosphere fungal community of Cynanchum bungei Decne were discussed so as to provide a scientific theoretical basis for optimizing rhizosphere growth promoting fungi and improving imitating wild planting technology. By integrating Illumina MiSeq High⁃throughput sequencing technology and traditional isolation and culture technology， the richness and diversity of fungal communities in the rhizosphere soil of Cynanchum bungei Decne at two rhizome depths from three habitats were analyzed and determined， and the cultivable rhizosphere fungi were isolated and identified. A total of 1589 OTUs were obtained from 6 samples， belonging to 11 phyla， 35 classes， 84 orders， 142 families and 237 genera. Ascomycota and Mortierellomycota are the common dominant phyla of the samples. A total of 103 morphotypes were isolated from 6 samples by traditional culture method， which were divided into 3 phyla， 8 classes， 10 orders， 12 families， 16 genera and 37 species. The dominant genera are Trichoderma and Fusarium. By comprehensive comparison， high⁃throughput sequencing technology can obtain more comprehensive colony data， and traditional isolation and culture technology can purify strains with strong adaptability. There were significant differences in soil fungal communities among samples from different producing areas and rhizome depths.

Graphical abstract

关键词

白首乌 / 根际真菌 / 高通量 / 传统培养

Key words

Cynanchum bungei Decne / rhizosphere fungus / high throughput / traditional cultivation

0 引 言

白首乌（Cynanchum bungei Decne）隶属于萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum），因其善于增补人体精血，增强免疫力而延缓衰老^［1］，在民间被称为“白人参”。白首乌有效成分为苯乙酮类、C₂₁甾体皂苷类、萜类和生物碱类^［2］等，块根入药具有补肾益肝、生发黑发、养血益精、润肠通便的功效。随着对白首乌的深入研究和探讨，其药材市场也在不断扩大^［3］。但其为多年生植物，生长周期长，野生品种的开花率和结果率均较低，人工栽培技术尚不足^［4］，因此越来越多的伪品被拿来充当正品白首乌使用。为解决这一问题，关于白首乌的仿野生种植技术正在兴起。

土壤微生物是一类包括真菌、细菌和放线菌等的庞大群体^［5］，对土壤养分的循环和植物的生长都有显著的影响^［6］。根际土是植物⁃土壤⁃微生物进行联系的微生态系统^［7］。根际微生物的多样性和分布规律对植物的生长有重要作用，植物根系的分泌物也会影响根际微生物的种类和分布，两者之间交叉互存共同促进微生态系统的循环和演变^［8］。有研究发现大部分根际微生物具有提高土壤再利用率和促进植物生长发育的作用，对植物可能产生的病虫害有很好的防治效果，能增强植物对外界环境的抗逆性和抗病性^［9~11］。目前，关于白首乌根际土壤微生物多样性的研究尚未有报道。因此，探究土壤微生物群落的多样性，对白首乌的人工栽培以及仿野生种植都有一定的理论指导意义。

高通量测序技术具有准确率高、测序时间快、价格低等优势^［12］，已成为微生物多样性研究中的新型实验方式；而传统分离培养法则可以较为系统地分离纯化出植株根际中对环境适应性强、竞争力大且丰度高的菌种^［13］。本研究综合这两种技术手段，以不同产地的白首乌根际土为研究对象，对真菌群落的组成结构和分布规律进行研究分析，以期为更好地创造仿野生种植条件，培育品质优良的白首乌提供科学且有效的理论指导。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

样品于2021年8月11日至13日采集。采集地点为：济南市莱芜区莲花山（LW）、济南市历下区大坝头（LX）、济南市长清区五峰山（CQ）。采集地的白首乌均为野生品种，且由山东中医药大学徐凌川教授鉴定为正品原植物。选取生长旺盛的植株，用铁铲挖至植物根部，用灭菌的刷子和不锈钢勺收集附着于根上0~4 mm范围内的土，每个样地采集地下深度10 cm 和20 cm的根际土，分别编号为LW10，LW20，LX10，LX20，CQ10，CQ20，-20 ℃冰箱保存，用于后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1 土壤DNA提取

取1 g样品于离心管中，加1xPBS溶液震荡混匀，10 000 r/min离心3 min，弃上层液。用OMEGA试剂盒（E.Z.N.A™ Mag⁃Bind Soil DNA Kit）提取土壤根际微生物的总DNA，对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。以总DNA为模板，对ITS1⁃ITS2区域进行扩增，PCR反应引物为：ITS1F：5'⁃CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA⁃3'；ITS2：5'⁃GCTGCGTTCTTCATCGATGC⁃3'。反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min；反应体系为：2xTrans Taq Fidelity（HiFi） PCRSuperMix 15 μL，Primer（10 μmol/L）各1 μL，基因组DNA 1~3 μL，补充双蒸水至30 μL。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，合格产物送往上海生工生物股份有限公司，通过Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。

1.2.2 生物信息学统计

将高通量结果得到的序列根据重叠关系进行过滤与拼接^［14］，基于对97%相似水平下的OTU聚类和分类学信息，对多个群落的结构和组成进行Alpha多样性分析、菌群差异分析、功能预测分析等一系列深入的统计学和可视化分析^［15］。最终将优化的序列根据数据库中的参考序列在门、纲、科、属的水平上进行鉴定，比较分析其群落组成、丰度以及多样性。

1.2.3 根际真菌纯化培养

无菌环境下筛去土壤中的石块和细小杂质物，称取2 g根际土放置到灭菌的锥形瓶中，加入20 mL无菌PDA溶液，于摇床中180 r/min震荡混匀48 h，采用梯度稀释法将土样稀释成6个不同梯度，离心取上清液适量均匀涂抹到固体PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中；定期观察菌落的菌丝生长情况，挑取颜色、形状、大小均不同的尖端菌丝于新的培养基中，不断纯化培养至菌丝形态单一^［16］。将形态一致的菌株拍照后转移至灭菌的PDA固体试管斜面培养基上，稀甘油封存至于-80 ℃冰箱中保存以备用。

1.2.4 可培养真菌的分子鉴定

将形态一致的菌株进行合并，使用E.Z.N.A.真菌试剂盒提取菌株的DNA，对基因组中的rDNA⁃ITS区域进行扩增，PCR反应引物为：ITS4：5'⁃TCCTTCCGTTAATTGATATCG⁃3'；ITS5：5'⁃GAAAGTAATCTGCTACACACG⁃3'，反应体系和程序参考1.2.1。扩增合格产物送上海生工生物股份有限公司进行测序。将测序所得的序列进行载体区域切除，合格序列利用Seq Man软件进行校对拼接，登录相关测序网站（NCBI数据库）进行Blast比对，根据生药学特征和鉴定结果确定真菌菌株的种类。

2 结果与分析

2.1 根际真菌高通量测序结果和多样性指数

对所有的序列以97%相似水平下的一致性进行OTUs聚类分析^［17］，共得到1 589个OTU，6个样品之间共同拥有12个OTU（图1）。6个样品的白首乌根际土壤真菌微生物测序数据结果（表1）显示，样品CQ20的Chao和Ace指数最大，说明该样品中根际土壤微生物丰富度最高。样品LX20的Shannon指数最大且Simpson指数最小，说明该样品中根际土壤微生物多样性最高。样品LX20的Shannoneven指数最大，说明该样品中微生物在群落分布的均匀度最高。6个样品的Coverage指数均为1，说明本次测序结果基本能代表白首乌样品中根际微生物存在的真实情况。从样品稀释性曲线（图2）可以看出，随着测序数量的增多，Alpha多样性指数值变化越来越缓慢，当达到足够的数量之后，曲线趋向于平缓，因此本次测序的深度基本能够覆盖样品根际土壤中的全部真菌微生物。

2.2 根际真菌高通量测序菌群结构与分布规律

通过高通量测序结果得到的纲、目、科、属、种的分类水平数据见表2，可以看出6个样品的白首乌真菌微生物的组成和结构存在很大差异。说明产地因素和地下根际深度因素在不同分类水平上影响白首乌根际土壤微生物的多样性和丰富度。

通过比较不同分类水平上根际土壤真菌组成（图3）发现，在门水平上，优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）。样品LW10和LX10的优势菌门为被孢霉门，相对丰度分别为58.68%和45.59%；样品LW20、LX20、CQ10、CQ20的优势菌门均为子囊菌门，相对丰度分别为86.84%、53.52%、67.04%和65.80%。在属水平上，优势菌属为古根菌属（Archaeorhizomyces）、Zopfiella、珠头霉属（Oedocephalum）、小被孢霉属（Mortierella）、冠孢革菌属（Lindtneria）。样品LW10和LX10的优势属均为小被孢霉属，相对丰度为32.73%和27.93%；样品LW20的优势属为古根菌属，相对丰度为77.85%；样品LX20的优势属为冠孢革菌属，相对丰度为23.51%；样品CQ10的优势属为Zopfiella，相对丰度为29.42%；样品CQ20的优势属为珠头霉属，相对丰度为21.75%。

2.3 可培养根际真菌鉴定

根据根际微生物的分离培养，将形态一致的根际真菌进行组合纯化^［18］，通过对基因组ITS4和ITS5的特定长度进行测序，从6个样品中共得到1 015株真菌，可分为103个形态型。将测序得到的不同菌株ITS基因在GenBank数据库中进行查阅比对，进行分子鉴定与系统学分析（表3）。最终得到的根际土壤真菌属于3门8纲10目12科16属37种。

白首乌的根际土均采于野生植株的根部，不同产地的土壤性质存在一定的差别，因此不同样品的可培养真菌群落具有一定的差异性^［19］。研究表明产地的地理位置和环境条件会影响植物的根际土壤微生物多样性^［20］。103个根际土壤真菌形态型中，34株属于莱芜地区白首乌的根际土壤，32株属于历下地区，37株属于长清地区。在属的分类水平上，白首乌可培养根际真菌多样性与产地因素的相关性表明（如图4），莱芜地区的根际土壤真菌划分为14个属，优势属为木霉属（Trichoderma）和枝孢属（Cladosporium），分别占该地区总菌的26.47%和14.71%；历下地区的根际土壤真菌划分为16个属，优势属为木霉属和青霉属（Penicillium），分别占该地区总菌的21.88%和15.63%；长清地区的根际土壤真菌划分为13个属，优势属为镶刀菌属（Fusarium）和曲霉属（Aspergillus），分别占该地区总菌的18.92%和13.51%。其中林氏孔菌属（Lindtneria）只在历下地区的根际土中培养得到。

白首乌在生长过程中，主根向地下延伸时会出现两个横向膨大块根，这是白首乌具有药用价值的最主要部位^［21］。研究报道^［22］，地下深度会影响根际微生物的多样性和分布规律。103株不同形态的根际土壤真菌中，54株属于地下10 cm处，49株属于地下20 cm处。在属的分类水平上，白首乌可培养根际真菌多样性与地下根茎深度的相关性表明（图5），两种深度的土壤根际真菌优势属均为木霉属和镶刀菌属；地下10 cm的土壤根际真菌划分为16个属，优势属木霉属和镶刀菌属分别占18.52%和11.11%；地下20 cm的土壤根际真菌划分为15个属，优势属木霉属和镶刀菌属分别占18.37%和12.24%；林氏孔菌属只在地下10 cm的根际土中培养得到。由结果数据说明，地下根际土壤深度虽然对可培养真菌群落的优势属无差异性影响，但是对根际真菌群落的组成有一定的影响。

3 讨论与结论

产地因素对白首乌根际土壤微生物群落的结构和多样性存在差异性，莱芜和历下地区的优势菌门为被孢霉门，长清地区的优势菌门为子囊菌门，莱芜和历下产地的土壤真菌群落较为接近，表明白首乌根际土壤真菌群落多样性受产地因素影响显著。不同产地的真菌优势群落存在差异性，这可能与植株的生境有关，土壤理化性质的改变和生态因子的变化会导致部分微生物的生长繁殖受到限制^［23］，影响群落的丰富度、多样性和均匀度，同时微生物菌种适应环境变化的能力强弱也会影响群落多样性^［24］。地下深度对白首乌根际土壤微生物群落的组成和多样性有影响，但在优势菌群上无明显差异，根际真菌群落的优势门、纲分别为子囊菌门、粪壳菌纲（Sordariomycetes）。土壤微生物优势菌群在不同地下深度具有一定的相似性，这可能与相同植株在生长过程中适应微生物协同互助的关联性有关^［25］，这类真菌微生物具有分布广泛、适应环境强的特点^［26］，易于直接或间接地影响药用植物的生长发育和品质形成。土层深度的土壤碳源和有机质等理化因子存在一定差异，微生物对不同碳源的利用能力存在差异^［27］，也会使得不同深度的土壤微生物群落多样性存在一定的差异。综合两个变量来研究白首乌根际土壤，发现子囊菌门和被孢霉门是各种条件下均存在的优势菌群。

白首乌根际土壤微生物资源丰富，可培养根际真菌具有多样性。产地因素对泰山白首乌根际真菌群落的分布和组成影响显著，且历下地区的群落丰度高于莱芜和长清地区；地下根茎深度对白首乌可培养真菌的优势菌群无影响，但是对群落的组成有一定的影响。在属的水平上，丰度高的可培养真菌群落为木霉属和镶刀菌属；在种的水平上，样本的优势菌种主要为绿木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）、腐皮镰孢菌（F.solani）和尖刀镰孢菌（F.osysporum），另外也分离纯化得到黑曲霉（A.niger）、枝细枝孢菌（C.ramotenellum）和糠生赤壳菌（B.pityrodes）等多种菌株，这些菌种都可在植物生长过程中发挥不同的生理活性作用^［28］。

在种的水平上，高通量测序得到的菌种是传统培养分离鉴定得到的菌种数目的17倍；在属水平上，传统分离培养仅仅得到了16个属，这与高通量测序得到的丰度>1的菌属只重合6种，即古根菌属、尾柄孢壳属（Cercophora）、赤霉菌属（Gibberella）、珠头霉属、小被孢霉属、冠孢革菌属。结果表明，高通量测序能得到根际土中的大部分菌群，且在基因水平上给予充分的证明，而传统分离培养法很难得到对生长环境要求严苛以及自身竞争力差的根际真菌，且能得到菌群多为丰度较高的已知菌群。高通量测序可以在未分类群落里发现新品种，传统培养法可以得到具有强生存竞争力的菌株，综合两种方法，共同探讨白首乌根际菌群的分布规律，进一步筛选具有强生物活性的有益菌。

被孢霉门和子囊菌门是白首乌根际土壤中的优势菌群，古根菌属、尾柄孢壳属、赤霉菌属、珠头霉属、小被孢霉属和冠孢革菌属是高通量和可培养共同存在优势菌群，这为进一步研究白首乌根际促生菌和生物菌肥提供了理论基础。总之，加强对药用植物根际微生物多样性的研究，深入挖掘根际土壤菌群与植物生长的关联性，进一步探究根际微生物与药材药效成分含量的相关性，能够为更好地创造仿野生种植条件、培育品质优良的白首乌提供科学且有效的理论指导。

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基金资助

山东省科技攻关项目(2019GSF275)

山东省教育厅科研项目(J08LH10)