基于非靶代谢组学的多花黄精沙藏种子萌发过程差异代谢物分析

Analysis of differential metabolites during germination process of Polygonatum cyrtonema Hua seeds in sand storage based on untargeted metabolomics

摘要

低温沙藏处理可以有效解除多花黄精种子休眠，为此本实验利用非靶向气相色谱⁃质谱法（GC⁃MS）技术鉴定并分析了沙藏后的多花黄精种子不同萌发时期的代谢产物及其变化规律。共鉴定出初级代谢产物116种，对多花黄精种子萌发0 d vs.7 d，7 d vs.14 d，14 d vs.21 d，21 d vs.28 d和28 d vs.35 d等比较组进行成对比较筛选，分别筛选鉴定出各比较组中发生显著变化的差异代谢物（VIP>1.0，P<0.05）17，27，9，7和1种。多花黄精种子萌发初期的0 d、7 d和14 d，种子内的二糖（海藻糖，麦芽糖，蔗糖等）以及TCA循环中苹果酸，琥珀酸，柠檬酸等含量显著增加，而在14 d后整体呈现下降趋势。γ⁃氨基丁酸等氨基酸含量在萌发0 d时最高。HCA分析表明，大部分的代谢物含量在沙藏的多花黄精种子萌发7 d时上升，14 d后下降，表明在14 d前后初级代谢产物被快速消耗。KEGG分析表明，种子萌发过程中TCA循环，精氨酸与脯氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢等多条代谢通路表现活跃。在萌发初期，氨基酸、糖类和有机酸类物质含量三者间显著相关。本研究结果为进一步开展黄精种子人工繁育提供了理论依据。

Abstract

Low temperature sand storage can effectively relieve the dormancy of seeds of Polygonatum cyrtonema Hua. In this study， non⁃targeted gas chromatography⁃mass spectrometry （GC⁃MS） was used to identify and analyze the metabolites of seeds of P. cyrtonema at different germination stages after sand storage. And a total of 116 primary metabolites were identified. Pairwise comparative screening was performed on the comparison groups of P.cyrtonema seed germination 0 d vs.7 d，7 d vs.14 d，14 d vs.21 d，21 d vs.28 d and 28 d vs.35 d， and 17， 27， 9， 7 and 1 differential metabolites （VIP>1.0， P<0.05） with significant indigenous changes were screened and identified. The contents of disaccharides （trehalose， maltose， sucrose， etc.） and malic acid， succinic acid， citric acid in TCA cycle of P.cyrtonema seed increased significantly during 0 d， 7 d and 14 d of germination， but decreased after 14 d. The content of amino acids such as γ⁃aminobutyric acid was the highest at 0 d of germination. HCA analysis showed that most of the metabolite content increased at 7 d after germination of P.cyrtonema seeds and decreased after 14 d， indicating that primary metabolites were rapidly consumed around 14 d. KEGG analysis showed that TCA cycle， arginine and proline metabolism， starch and sucrose metabolism and other metabolic pathways were active during seed germination. At the beginning of germination， the contents of amino acids， carbohydrates and organic acids were significantly correlated. The results of this study provide a theoretical basis for further artificial breeding of seeds of P.cyrtonema.

Graphical abstract

关键词

多花黄精 / 种子 / 萌发 / 沙藏 / 代谢组学

Key words

Polygonatum cyrtonema Hua / seed / germination / sand storage / metabolomics

0 引 言

黄精（Polygonatum sibiricum Red.）是百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）植物，其根茎常被用作药物或食物，用于治疗肺、肾和脾脏疾病和预防衰老^［1］，同时在美容和化学等领域也有广泛的应用^［2］。多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）是《中国药典》收录的三种药用黄精之一，主要活性成分为黄精多糖^［3］，其传统的繁殖方式主要为根茎繁殖和种子繁殖。目前多花黄精繁殖主要依赖于根茎，但长期无性繁殖导致种质退化，从而导致病虫害相关问题。种子繁殖因其数量多，在实际生产中易于操作，可有效降低生产成本，解决上述问题^［4］。但在自然环境下多花黄精种子存在萌发时间长、萌发率低且出苗不整齐等问题^［5］。有研究表明黄精种子的休眠属于综合休眠^{［6， 7］}，可防止种子在不利的物理条件下发芽。在许多野生物种中，种子在成熟时处于休眠状态，即使在最佳条件下也不会发芽。发芽是一个复杂的过程，受内源性和环境因素的影响^［8］。解除种子休眠的方法有很多，包括化学、生物和物理方法。层积处理通常用于打破种子休眠^［9］，如低温层积可以打破杏种子在自然条件下休眠的现象^［10］。赤霉素也可以打破猕猴桃种子休眠^［11］。此外，一氧化氮、乙烯和赤霉酸之间的相互作用调节苋菜种子休眠的释放^［12］。前人研究表明，通过低温沙藏处理可以有效解除多花黄精种子休眠，促进种子萌发^［13］。但是，在沙藏处理后，多花黄精种子萌发过程中的相关生理变化知之甚少。在黄精种子萌发过程中，有报道显示植物激素和α⁃淀粉酶活性受到不同的调节^［14］。黄精种子萌发时，植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）含量降低并维持在较低水平，生长素（3⁃indoleacetic acid， IAA）、赤霉素（gibberellins， GA₃）和反式玉米素（trans⁃zeatin， TZR）含量呈上升⁃下降⁃上升趋势^［15］。研究表明，黄精种子中含有类黄酮、酯类和有机酸等多种物质^［16］，但对于多花黄精中初生代谢的物质变化了解较少。在绿豆发芽过程中黄酮物质有所增加，在糙小米发芽后酯类物质含量明显降低^［17］，而一定浓度的有机酸可促进珊瑚樱种子萌发，表明这些初生代谢物质对植物种子萌发具有重要作用，但需要在多花黄精中进一步探讨分析。

目前，代谢组学已成为分析各种代谢产物的重要研究手段^{［18，19］}，被广泛应用于不同植物的器官和组织上，包括根、叶、花和果实^［20~23］。基于GC⁃MS 技术的代谢组学可分析出不同化学类型的代谢物，包括糖和糖苷、有机酸、氨基酸和脂肪酸^［24~27］等。如有研究基于代谢组学对红杆与绿杆型多花黄精化学成分进行比较研究^［28］，或是有学者利用GC⁃MS技术分析黄精种子油脂的脂肪酸成分等^［29］。本研究拟采用GC⁃MS技术对沙藏处理后多花黄精种子萌发过程中的代谢物进行检测，结合代谢组学分析糖和糖苷、有机酸、氨基酸和脂肪酸等初生代谢物质的变化规律，以期为多花黄精种子的人工繁育技术提供理论基础和应用参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

多花黄精种子采收于青阳县天地之精黄精种业有限公司黄精基地。

1.2 试验方法

1.2.1 多花黄精种子萌发

多花黄精果实经焖种、揉搓漂洗阴干后，于4 ℃下沙藏处理60 d取出。为促进种子萌发，将沙藏后的种子经GA₃预处理24 h，再置于穴苗盘中26 ℃温室萌发。分别收集萌发0、7、14、21、28和35 d的多花黄精种子，用液氮冷冻并储存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 多花黄精种子样品的提取

取100 mg鲜样于研钵中，经液氮研磨后将样品转移至10 mL离心管中，加入1.4 mL甲醇（-20 ℃预冷、色谱级）涡旋震荡1 min。加入60 μL邻苯二酚（0.2 mg/L）作为内标，在40 ℃，120 W条件下超声提取30 min。将样品4 000 r/min离心20 min后吸取上清，加入750 μL的氯仿和1.4 mL的超纯水（4 ℃预冷），再次涡旋震荡1 min，于4 000 r/min条件下离心20 min。取上层甲醇/水混合液1 mL于新的1.5 mL离心管中，用氮气气吹干样品。

1.2.3 GC⁃MS样品的衍生化处理

将氮气吹干的样品中加入60 μL盐酸羟胺吡啶溶液，涡旋30 s，在烘箱中37 ℃温浴2 h。随后加入60 μL衍生化试剂（99% BSTFA+1% TMCS），密封后于37 ℃下反应1.5 h。12 000 r/min离心10 min，取上清于内插管中待检测，每组样品6次生物学重复。

1.2.4 代谢产物测定方法

将样品以液体形式注入Agilent 7890B GC⁃MS（gas chromatography⁃mass spectrometry）系统（美国安捷伦公司）。气相色谱条件为：DB⁃5石英毛细管柱30 m×250 μm×0.25 μm；分流进样，进样量为1 μL，分流比为10∶1；进样口温度：280 ℃；离子源温度250 ℃；接口温度：250 ℃；升温程序：初始温度为40 ℃，保持5 min，以10℃/min速度升至300 ℃，保持5 min。载气为氦气，流速1 mL/min。质谱条件为：电喷雾电离（ESI）源，电子能量70 eV；四极杆扫描范围m/z 35⁃780。

1.2.5 数据处理

利用R软件对样品谱图进行滤噪、峰匹配、基线校准、面积归一化等初步处理。经Microsoft Excel 2019软件初步处理后导入SPSS 19.0 软件中，对各组分进行HCA聚类分析。采用SIMCA⁃P14.1进行多元统计学分析，通过MeV4.9进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 基于GC⁃MS技术的多花黄精沙藏种子萌发过程的成分分析

对多花黄精种子萌发过程的代谢物进行GC⁃MS检测，代谢图谱显示保留时间具有重现性和稳定性，证明了代谢组分分析的可靠性和有效性。种子萌发期间代谢产物的表达较为活跃，经检测分析后共分离鉴定出116种代谢物，包括22种氨基酸，20种糖类和20种糖苷类化合物，22种有机酸，12种醇和酯类化合物，9种含氮化合物，4种脂肪酸，7种其他化合物。

通过正交偏最小二乘法⁃判别分析（OPLS⁃DA）来筛选多花黄精种子萌发过程中发生显著变化的差异代谢物。对多花黄精种子萌发0 d vs.7 d，7 d vs.14 d，14 d vs.21 d，21 d vs.28 d和28 d vs.35 d等时间点进行成对比较，结果显示（表1~5），R²Y分别为0.982、0.944、0.956、0.983和0.98，Q²Y分别为0.766、0.859、0.899、0.708和0.89（图1A~图1E），两者的值均大于0.7，表明OPLS⁃DA模型具有稳定性和可靠性。筛选各比较组中发生显著变化的差异代谢物（VIP>1.0，P<0.05），分别筛选鉴定出17，27，9，7和1种差异代谢物。

2.2 多花黄精沙藏种子萌发过程代谢物的分析

多花黄精种子萌发过程动态观察发现，播种14 d时白色胚部组织突破种皮，21 d时形成肉眼可见的膨大部位，即小球茎。之后小球茎的胚根继续伸长，到28 d时，与主根垂直的地方长出胚芽。35 d时，侧根大量出现，种子形态长时间没有明显变化，进入上胚轴休眠（图2）。

利用HCA分析了多花黄精种子萌发过程代谢物的动态变化，如图3所示，种子萌发过程中的代谢物可以分为三个聚类。0 d时，主要含有聚类Ⅰ的成分，包括2种有机酸（琥珀酸和2，4，6⁃三羟基苯甲酸），3种氨基酸（甘氨酸，4⁃氨基丁酸，β⁃丙氨酸）以及1种糖和糖苷类化合物，在种子萌发过程中这些代谢物的含量总体呈现逐渐下降的趋势。萌发7 d时，主要是聚类Ⅱ的成分，包括9种氨基酸（脯氨酸，丙氨酸，谷氨酸等），10种有机酸（柠檬酸，莽草酸，甘油酸等），7种糖和糖苷类化合物（麦芽糖，海藻糖，赤藓糖等），4种醇类化合物（肌醇，甘油，鲨肌醇等），1种脂肪酸以及4种含氮化合物和四种其他类代谢物。萌发14 d时，大部分代谢物含量降低，主要是聚类Ⅲ的成分，12种糖和糖苷类化合物（蔗糖，纤维二糖，果糖等），10种氨基酸（色氨酸，L⁃赖氨酸，酪氨酸等），11种有机酸（苹果酸，乳酸，烟酸等），9种醇和酯类化合物，5种含氮化合物、3种脂肪酸（亚油酸，硬脂酸，棕榈酸）和4种其他类化合物。萌发21 d时，聚类Ⅰ和聚类Ⅱ的成分较少，而聚类Ⅲ的含量较高。28 d时，主要是聚类Ⅰ和聚类Ⅲ的成分，其代谢物含量较低。35 d时，聚类Ⅲ的成分较多。

2.3 多花黄精沙藏种子萌发期代谢谱的初步构建

通过对差异代谢物的KEGG通路分析，从0 d vs.7 d，7 d vs.14 d，14 d vs.21 d，21 d vs.28 d和28 d vs.35 d的差异代谢物中分别富集到32、32、4和9条通路（P<0.05）（表6）。显著富集的代谢通路有柠檬酸循环（TCA循环），精氨酸与脯氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢等。

研究发现多花黄精种子萌发0 d vs.7 d和7 d vs.14 d这两个比较组的代谢物发生显著变化，对这两个比较组的差异代谢物进行代谢谱的构建。多花黄精种子萌发0~7 d的过程中，淀粉和蔗糖代谢、精氨酸与脯氨酸代谢以及TCA循环等途径的大部分差异代谢物均显著升高，如淀粉和蔗糖代谢中的蔗糖（2.02倍），精氨酸与脯氨酸代谢中的脯氨酸（1.38倍）以及柠檬酸循环中的苹果酸（1.30倍）、柠檬酸盐（1.70倍）等。而肌醇（0.14倍），色氨酸（0.59倍），琥珀酸（0.46倍）的含量均显著降低（图4A）。多花黄精种子萌发7~14 d的过程中，这三个途径的大部分代谢物仍然显著升高。如蔗糖（1.27倍），脯氨酸（1.38倍），苹果酸（1.30倍）等，而肌醇（0.90倍）的含量显著降低（图4B）。

2.4 多花黄精沙藏种子萌发过程中差异代谢物的相关性分析

本研究对多花黄精萌发过程中发生显著相关（|r|≥0.8，P<0.001）的代谢物间代谢网络变化情况进行了分析。如图5所示，共有250对代谢物呈显著相关，且均呈正相关。主要存在于氨基酸类、有机酸、糖类及糖苷类之间，占总的相关性的48%，如脯氨酸与天冬氨酸（r=0.87，P=5.41E-12），麦芽糖（r=0.963，P=5.45E-21），肌醇（r=0.843，P=1.08E-10），磷酸（r=0.914，P=6.89E-15）。谷氨酰胺与赖氨酸（r=0.836，P=2.24E-10）。此外苹果酸与丝氨酸（r=0.82，P=9.79E-10），蔗糖（r=0.819，P=9.91E-10）。琥珀酸与甘氨酸（r=0.928，P=4.05E-16），γ⁃氨基丁酸（r=0.875，P=3.12E-12），β⁃丙氨酸（r=0.91，P=1.52E-14），2⁃O⁃甘油⁃α⁃D⁃吡喃半乳糖（r=0.894，P=2.08E-13）。

3 讨 论

未沙藏的多花黄精种子极难萌发^［30］，本研究利用GC⁃MS 技术结合多元统计学分析方法对沙藏后的多花黄精种子萌发过程中的五个时间点（0 d、7 d、14 d、21 d和35 d）进行代谢组学分析，结果表明多花黄精种子萌发初期大部分代谢物含量增加，发芽后显著降低。其中糖类、氨基酸类和有机酸类物质变化最为明显。

糖作为种子内重要的碳源来源为种子萌发提供条件^［31］。本研究中，种子萌发初期的0~14 d内，种子内的二糖（海藻糖，麦芽糖，蔗糖等）含量显著增加，而在14 d后整体呈现下降趋势。这些二糖是可溶性糖，被认为可以被快速利用以促进种子萌发^［32］。糖的水解促进能量代谢，能量的产生可能与种子内细胞生长包括原形成层环扩张和胚根有关^［33］。种子萌发14 d后，其二糖的含量呈下降趋势，种子内的糖酵解途径和柠檬酸循环代谢加速。有研究表明，瓜儿豆种子萌发期间，蔗糖含量有所降低^［34］。而华重楼（Paris polyphylla var. chinensis）种子可溶性糖含量在萌发前期先升高后迅速下降，萌发后期缓慢降低^［35］，这些均表明可溶性糖作为供能物质可能通过大量消耗以促进多花黄精种子萌发。

氨基酸和有机酸类物质在萌发初期含量增加，后期含量降低。在种子萌发初期，由于蛋白质分解强烈，致使氨基酸的含量增加^［36］。氨基酸参与新蛋白合成或为呼吸氧化提供碳架，在种子萌发后期，氨基酸含量呈现不断下降趋势^［37］。因此，多花黄精种子在14 d后氨基酸含量显著降低，如γ⁃氨基丁酸与种子能量的产生有关^［38］，在多花黄精种子萌发过程中，γ⁃氨基丁酸的含量萌发0 d时最高，其他阶段含量开始降低。本研究发现，大部分有机酸富集到TCA循环及其代谢通路中。TCA循环中苹果酸，琥珀酸，柠檬酸等含量在多花黄精种子萌发0~14 d内显著升高，而在14 d后显著降低。有研究表明，有机酸在黄精种子萌发过程中显著减少^［14］。黄精种子萌发后期，种子形成初生根茎后，进入上胚轴休眠^［39］，这可能是大多数代谢物在28 d后含量降低的原因。

相关性分析发现，氨基酸，糖类和有机酸相关代谢物在种子萌发过程中显著正相关，暗示这些代谢物可能共同参与了种子的萌发过程。研究表明，在种子萌发过程中氨基酸代谢是必不可少的，它们必须与种子内碳水化合物和糖类化合物的变化保持一致才能驱动细胞代谢进而促进种子萌发^［40］。因此，在多花黄精种子萌发过程中，糖类物质与氨基酸、有机酸类物质变化趋势相同。沙藏后多花黄精种子如何启动氨基酸，糖类和有机酸等基础代谢，有待于后续转录组学、基因组学等综合分析，为提高多花黄精种子萌发提供更多依据。

4 结 论

基于气相色谱和质谱联用的方法，对多花黄精沙藏种子不同萌发时期的代谢产物进行鉴定，对各时期的差异代谢物进行比较分析，共鉴定到96个代谢物，主要为氨基酸、糖类和有机酸类物质。大部分的代谢物含量在多花黄精种子萌发7 d时上升，14 d后下降。多花黄精种子萌发初期的0~14 d内，种子内的二糖（海藻糖，麦芽糖，蔗糖等）以及TCA循环中苹果酸，琥珀酸，柠檬酸等含量显著增加，而在14 d后整体呈现下降趋势。γ⁃氨基丁酸等氨基酸含量在萌发0 d时最高，其他阶段含量降低。多花黄精种子萌发过程主要受TCA循环，精氨酸与脯氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢等多条代谢通路影响。在萌发初期，氨基酸、糖类和有机酸类物质的含量在种子萌发时的确发生变化，但三者之间的相关性，本研究根据计算得出氨基酸、糖类和有机酸类物质的含量具有显著相关关系（图5），这些初生代谢物质为多花黄精种子萌发发挥了关键作用。本研究利用非靶代谢组学研究了多花黄精沙藏种子萌发过程的代谢物含量差异，完成了不同萌发阶段的差异代谢物筛选及代谢通路鉴别，这可以为人工繁育高效优质黄精品种和加速黄精药材生长提供一定的理论参考，进而推动黄精资源的开发与利用。

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基金资助

安徽省特色农业产业技术体系(22542001)

2021年安徽省研究生科研项目(YJS20210201)

校企产业合作化项目(21342009)