柯萨奇病毒A组10型感染RD细胞的转录组学分析

Transcriptomics analysis of RD cells infected with coxsackievirus A10

摘要

探讨柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10， CV⁃A10）感染人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）细胞的基因表达谱变化，为深入理解CV⁃A10致病机制提供重要基础数据。本研究将CV⁃A10以感染复数（MOI）为0.1的剂量感染RD细胞12 h后提取总RNA，通过RNA⁃Seq技术获取RD细胞中的全部转录本信息，基于生物信息学的方法对差异表达基因进行GO（gene ontology， GO）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）分析。结果显示，共筛选到2 610个差异表达基因，其中表达上调的基因有1 582个，表达下调的基因有1 028个。随机选取8个差异表达基因，经RT⁃qPCR验证后发现，其变化趋势与转录组数据一致。GO和KEGG富集分析结果显示，差异表达基因主要聚焦于细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫反应等过程。结果表明，CV⁃A10感染可能会引起RD细胞发生自噬。

Abstract

To explore the changes of gene expression profile in human rhabdomyosarcoma （RD） cells infected with coxsackievirus A10 （CV⁃A10）， and to provide important basic data for further understanding the pathogenesis of CV⁃A10， RD cells were infected with CV⁃A10 at a multiplicity of infection （MOI） of 0.1 for 12 h， and total RNA was extracted. All transcriptional information of infected RD cells was obtained though RNA⁃Seq technology. Based on bioinformatics methods， differentially expressed genes were analyzed using GO （gene ontology） and KEGG （Kyoto encyclopedia of genes and genomes）. The results showed that a total of 2 610 differentially expressed genes were screened， of which 1 582 were up⁃regulated and 1 028 were down⁃regulated. 8 differentially expressed genes were randomly selected and verified by RT⁃qPCR， and the variation trend was consistent with the transcriptome data. The enrichment analysis results of GO and KEGG showed that the differentially expressed genes mainly focused on intracellular signal transduction， mRNA processing， antiviral immune response， and other processes. This study suggests that CV⁃A10 infection may cause autophagy in RD cells.

Graphical abstract

关键词

柯萨奇病毒A组10型 / 人横纹肌肉瘤细胞 / 转录组学

Key words

coxsackievirus A10 / human rhabdomyosarcoma cell / transcriptomics

0 引 言

柯萨奇病毒A组10型（CV⁃A10）是无包膜的单股正链RNA病毒，与肠道病毒71型（Enterovirus 71， EV⁃A71）、柯萨奇病毒A组16型（CV⁃A16）和柯萨奇病毒A组6型（CV⁃A6）同为婴幼儿手足口病的主要致病原^［1］。手足口病（Hand⁃foot⁃and⁃mouth disease， HFMD）的临床症状一般较为温和，多为自限性感染，主要表现为发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹等^［2］。值得注意的是，CV⁃A10和CV⁃A6感染后除了出现手足口病的一般表现外，还会引起不同程度的脱甲症状^［3］，少数患者还会发展成严重并发症，例如病毒性脑膜炎^［4］、脑炎^［5］等。与CV⁃A6和CV⁃A16相比，CV⁃A10和EV⁃A71更容易导致严重的循环系统和神经系统相关疾病^［6］，一些重症患者由于病情发展迅速可能导致死亡^［7］。尽管已经成功获批上市的EV⁃A71疫苗可以有效预防EV⁃A71引起的手足口病，但它对其他型别的肠道病毒并没有交叉保护作用^［8］。目前针对CV⁃A10的研究大多集中于流行病学，对其致病机制方面的认识还相当有限，及时开展CV⁃A10致病机制方面的研究将有利于开发针对CV⁃A10的抗病毒药物和疫苗。

病毒是严格的细胞内寄生生物，通常病毒要成功感染宿主细胞，需要劫持宿主细胞的亚细胞组分，利用宿主细胞的生物大分子合成机器，在宿主细胞实现成功的增殖，必须逃逸宿主细胞的抗病毒天然免疫和克服宿主细胞的抗病毒应激等反应，因而病毒与宿主细胞的相互作用精密有序且十分复杂^［9］。采用单一的病毒学、生物化学、细胞生物学等技术与方法很难窥探病毒与宿主细胞的相互作用的生物学效应及其分子机制。转录组测序（RNA⁃Seq）技术可以从总体上获得细胞在病毒感染前后的所有基因表达信息，对研究病毒与宿主细胞的相互作用是十分高效的技术手段^［10］。尽管过去有研究组涉及EV⁃A71和CV⁃A16感染宿主细胞的转录组学研究^［11］，但尚未有CV⁃A10感染细胞的RNA⁃Seq相关研究。因此，本研究利用实验室前期从手足口病患者分离鉴定的CV⁃A10病毒分离株，通过RNA⁃Seq技术对CV⁃A10感染后的RD细胞进行转录组测序，期望从RNA水平来理解CV⁃A10的致病机制。

1 材料与方法

1.1 病毒株和细胞株

CV⁃A10病毒分离株P148（GenBank登录号：MK645898.1）于2012年从广东省中山市临床手足口病患者粪便中分离得到，经鉴定为C基因型。根据Reed⁃Muench法计算出CV⁃A10滴度约为10^7.41TCID₅₀/mL。RD细胞为本实验室保存。

1.2 病毒感染和测序样品准备

将RD细胞均匀接种于60 mm培养皿中，置于37 ℃， 5% CO₂培养箱，待细胞生长到90%汇合度后，将CV⁃A10以MOI=0.1的剂量感染RD细胞，孵育2 h后，把含10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco）更换为含2%胎牛血清的DMEM维持液，12 h后收集细胞样品。将未感染的RD细胞设为阴性对照组，CV⁃A10感染组和对照组（MOCK）分别设置3个独立重复。

1.3 文库构建与测序

提取样品总RNA进行质检，把质检合格的RNA样品进行mRNA富集并随机打断，反转录成双链cDNA，经过末端修复、加A尾并连接测序接头后进行PCR扩增，随后纯化PCR产物，完成文库构建。文库质检合格后在Illumina NovaSeq 6000测序仪上进行上机测序。

1.4 RNA⁃seq数据分析

对原始数据进行过滤后获得Clean reads，使用HISAT2软件将Clean reads与参考基因组进行比对。通过DESeq2软件进行差异基因分析，差异基因筛选标准为P≤0.05。最后用cluster Profiler软件对筛选得到的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，以Q≤0.05作为富集显著性的判定标准。

1.5 RT⁃qPCR验证差异表达基因

随机选取8个差异表达基因，以GAPDH为内参基因，对转录组测序结果进行验证。使用Primer 6.0软件设计引物，引物序列和参数见表1，由擎科生物（武汉）合成。分别从感染组和对照组提取总RNA并反转录为cDNA。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix （Vazyme）配置反应体系，然后在荧光定量PCR仪上进行上机检测（反应程序：Stage 1：95 ℃ 30 s；Stage 2：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；Stage3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s）。最后通过2^⁃ΔΔCt法计算出目的基因在mRNA水平上的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取和质量评估

本研究使用Trizol法提取总RNA后，通过Nanodrop进行初步定量和纯度测定，然后通过Agilent 5400 bioanalyzer检测RNA的完整性。表2显示，RNA纯度、完整性以及总量同时达标，可以作为合格样品用于构建文库。

2.2 原始数据统计

测序结果如表3所示，本研究的6个样品的清洁序列占比均在90%以上，Q20比值在97.15%~98.34%，Q30比值在92.34%~95.02%，说明测序获得的序列质量较高。

2.3 参考基因组比对

将所有样品的Clean reads比对到参考基因组，从表4统计的比对信息可以看出，Clean reads中，成功比对到参考基因组的reads比例在93.90%~95.78%；比对到参考基因组唯一位置的reads比例在91.56%~93.40%；成功比对至外显子区域的reads比例在90.78%~92.24%，以上数据显示比对率均在90%以上，说明测序质量较好且基因注释比较完善，可以用于后续生物信息学分析。

2.4 差异表达基因的筛选和分析

把P≤0.05作为差异表达基因的筛选标准，建立以log₂（Fold Change）为横坐标，以-log₁₀P为纵坐标的火山图（图1）。由火山图可知相比，于MOCK组，CV⁃A10感染组共有2 610个差异表达基因，其中表达上调的基因有1 582个，表达下调的基因有1 028个。表5和表6分别列出了感染组上调和下调最显著的基因各10条。

2.5 GO富集分析

GO数据库涵盖了细胞组分、分子功能和生物学过程三个方面，对差异表达基因进行GO功能富集分析结果显示，差异表达基因主要参与了细胞周期、细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫等生物学过程；与蛋白质结合、受体结合等功能相关；同时定位于核糖体、细胞核、微管等细胞组分（图2）。

2.6 KEGG通路分析

富集分析结果如图3所示，差异表达基因富集到mTOR信号通路（mTOR signaling pathway）、Notch信号通路（Notch signaling pathway ）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway ）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）等重要信号通路，以上信号通路与细胞信号传导、宿主细胞抗病毒免疫反应、病毒免疫逃逸等过程密切相关，提示CV⁃A10感染引起RD细胞发生强烈的抗病毒应激反应。

2.7 RT⁃qPCR验证分析

为了验证转录组数据的准确性，本研究选取GAPDH作为内参基因，并随机挑选5个上调基因（FTH1、NDUFA1、COX6A1、RPL26、LSM7）和3个下调基因（RPS2P46、EEF1A1P5、RPS23）进行RT⁃qPCR。如图4所示，RT⁃qPCR的结果与转录组测序获得的差异表达基因的表达量变化趋势一致，说明本次转录组测序获得的数据是可信的。

3 讨 论

近年来，CV⁃A10在手足口病肠道病毒病原谱中的占比呈逐渐上升的趋势，已经引起人们广泛的关注^［12］。我国近年流行的CV⁃A10主要基因型为C基因型。以往针对CV⁃A10的研究多集中在流行病学和临床诊断等方面^［13］，与同为手足口病主要病原体的EV⁃A71和CV⁃A16相比，我们对CV⁃A10转录水平上的认识还十分有限。本研究通过RNA⁃Seq技术，对CV⁃A10感染RD细胞12 h后的基因表达谱进行分析，发现了2 610个差异表达基因，进一步对差异表达基因进行GO和KEGG分析，结果显示差异表达基因主要在308条信号通路中富集，富集程度比较显著的关键通路大多与信号转导、抗病毒免疫、细胞周期、细胞凋亡、自噬等过程相关，如mTOR信号通路、IL⁃17信号通路、Wnt信号通路等。随后，我们以GAPDH作为内参基因，对随机挑选的8个差异表达基因进行RT⁃qPCR验证，结果显示差异表达基因的变化趋势与RNA⁃Seq结果一致，因此，我们认为本研究获得的转录组数据是可信的。

自噬可以帮助机体在生理或病理状态下努力维持稳态，主要是通过降解损伤或衰老的细胞器来满足细胞本身的代谢需要和实现部分细胞器的更新。特别是在饥饿、缺乏生长因子或病原体感染等刺激下，自噬水平会明显上调，程凯等^［14］通过RNA⁃Seq技术研究EV⁃A71感染RD细胞的基因表达谱发现，在EV⁃A71感染RD细胞3 h的差异表达基因大多与自噬和凋亡相关，感染9 h后检测到自噬蛋白Atg5和mTOR伴侣蛋白Rictor的表达水平都有上升，进一步证实了EV⁃A71感染会引起RD细胞自噬。本研究的KEGG分析结果显示，mTOR信号通路的富集程度较高。mTOR信号通路是经典的自噬信号通路^［15］，因此，我们猜测CV⁃A10也能引起RD细胞自噬。自噬不仅可以维持机体稳态，还能在抵抗病毒感染的过程中发挥重要作用^［16］。宿主细胞可以通过自噬将病毒的蛋白质和核酸转移至溶酶体降解，发挥异体吞噬作用来抵抗病毒感染^［17］。本研究的GO分析富集到与蛋白质降解功能相关的泛素⁃蛋白转移酶^［18］。泛素⁃蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解^［19］。我们推测RD细胞也会通过异体吞噬作用来抵抗CV⁃A10的感染。有研究发现细菌也是采用与人类细胞相似的方式，通过泛素转移酶启动抗病毒免疫反应^［20］。泛素作为一种普遍的识别信号参与蛋白质降解和抗病毒免疫反应。

MAPK信号通路作为细胞信号传导的主要途径，参与细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种生理或病理过程。肠道病毒感染引起的炎症反应及病毒复制与JNK/SAPK和p38 MAPK的活化相关^［21］。有研究报道，JNK/SAPK和p38 MAPK抑制剂可以抑制EV⁃A71的复制，表明JNK/SAPK和p38 MAPK信号通路的激活促进了EV⁃A71的感染^［22］。本研究通过KEGG通路分析富集到了MAPK信号通路，且MAPK信号通路中上调的差异表达基因数在20个以上，提示CV⁃A10感染RD细胞的过程中激活了MAPK信号通路，MAPK信号通路被激活后促进了CV⁃A10的复制过程。

一般来说，干扰素信号通路是天然免疫的主要组成部分，在病毒入侵宿主时被激活从而发挥保护作用^［22］，但本研究中并没有富集到干扰素信号通路。Lei等发现EV⁃A71感染时可以通过多种途径抑制IFN的产生来达到免疫逃逸的目的^［23］。因此，我们推测CV⁃A10在感染RD细胞的过程中，通过抑制IFN的产生来达到免疫逃逸的目的。

尽管肠道病毒引起的手足口病已在2008年被我国列为丙类传染病，其感染率长期居于前三，给公共卫生安全带来威胁，但目前研究发现部分肠道病毒因其对人体的低毒性、靶向性及复制周期短等特性，具有作为溶瘤病毒发挥特异性杀伤肿瘤细胞的作用，如CV⁃A21^［24］、CV⁃B3^［25］等，说明肠道病毒可以作为一种有价值的生物研究资源，在肿瘤治疗中具有重要应用价值。

4 结 论

本研究主要讨论了CV⁃A10感染RD细胞过程中，RD细胞抵抗病毒感染的可能方式以及CV⁃A10实现免疫逃逸的几种途径，加深了对CV⁃A10感染致病机制的理解。但本研究仍缺乏具体实验来对关键基因或通路进行验证和探索，下一步将对自噬过程中的具体基因加以验证，深入探索CV⁃A10免疫逃逸与宿主细胞自噬之间的联系。

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基金资助

国家自然科学基金(81660280)