microRNA⁃223在动脉粥样硬化发生过程中的网络调控机制

The network regulation mechanism of microRNA⁃223 in the development of atherosclerosis

摘要

microRNA⁃223（miR‐223）是参与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）炎性调控、细胞生长等通路的微小非编码RNA。本研究系统地探究miR‐223及其靶基因的网络调控机制，以便全面理解 miR‐223在 AS中的作用。利用 miRNA靶基因预测数据库 miRDB、miRmap 、TargetScan和miRTarBase 获取miR‐223的靶基因集。R语言分析基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）共享平台动脉粥样硬化斑块差异表达基因集（GSE100927），筛选出斑块差异表达基因，并与miR‐223靶基因集交叉匹配。利用基因本体（gene ontology，GO）及基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析研究差异表达基因功能。结果显示，斑块中下调的1 584个差异表达基因与miR‐223靶基因交叉匹配得到422个交集mRNA。GO及KEGG富集分析发现miR⁃223可能通过细胞生长、炎症反应以及血管平滑肌收缩等信号通路调节动脉粥样硬化斑块的发生发展过程。蛋白相互作用网络（protein‐protein interaction networks，PPI）分析获得关键节点基因是INADL、JAM3、SMTN、LDB3、YAP1、TJP1、NCKAP1、PDLIM3、MICAL2和MPP5，其中YAP1也与铜死亡相关。我们还发现miR⁃223可能直接靶向GLS、GCSH调控铜死亡，参与动脉粥样硬化的发生发展过程。本研究表明，miR‐223主要通过调控细胞生长、铜死亡等相关信号通路影响动脉粥样硬化的各个进程。

Abstract

microRNA⁃223 （miR‐223） is a small non⁃coding RNA involved in the inflammatory regulation and cell growth pathways of atherosclerosis （AS）. In this study， we systematically explored the network regulatory mechanisms of miR‐223 and its target genes in order to fully understand the role of miR‐223 in AS. The target gene set of miR‐223 was obtained by miRDB， miRmap， TargetScan and miRTarBase. The plaque differential expression gene set （GSE100927） ，shared platform of gene expression omnibus（GEO） database，was analyzed by R language， and the plaque differential expression genes were screened out and cross⁃matched with the miR⁃223 target genes. The functions of differentially expressed genes were analyzed using the gene ontology （GO） and the kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG）. A total of 1584 differentially expressed genes which were down⁃regulated in plaques were cross⁃matched with miR⁃223 target genes to yield 422 intersectional mRNAs. GO and KEGG enrichment analysis showed that miR⁃223 may regulate the occurrence and development of atherosclerotic plaques through signaling pathways such as cell growth， inflammatory response and vascular smooth muscle contraction.Protein⁃protein interaction networks （PPI） analysis revealed that the key node genes were INADL、JAM3、SMTN、LDB3、YAP1、TJP1、NCKAP1、PDLIM3、MICAL2 and MPP5.YAP1 was also associated with cuproptosis.We also found that miR⁃223 may directly target GLS and GCSH to regulate cuproptosis and participate in the occurrence and development process of AS.

Graphical abstract

关键词

动脉粥样硬化 / microRNA⁃223 / 网络调控机制 / 细胞生长 / 铜死亡

Key words

atherosclerosis / microRNA⁃223 / network regulatory mechanism / cell growth / cuproptosis

0 引 言

动脉粥样硬化是斑块形成的过程，涉及血管内膜中的各种细胞、脂质和碎片组织^［1］，是慢性血管炎症介导的一种病变^［2］。动脉粥样硬化是一种胆固醇堆积引起的疾病，低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）的滞留导致其沉积在动脉内膜，由于清道夫受体诱导免疫细胞持续浸润，LDL进入动脉粥样硬化斑块^［3~5］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）涉及到多种细胞生理状态的改变，包括内皮细胞、平滑肌细胞、单核⁃巨噬细胞等。AS的分子调控网络十分复杂，治疗AS的分子靶点还有待挖掘，因此，需要进行系统的网络调控分析，以明确可能相关的分子机制。

microRNAs（miRNAs）是高度保守的小RNA序列，由20到23个核苷酸组成，包含特定目标信使RNA（mRNAs）的互补序列。通过与3'⁃非编码区结合，miRNAs在转录后通过降解和/或对其结合靶基因的翻译抑制来调节基因表达。一种miRNA在细胞内具有多种靶mRNA，能同时调节多种基因或蛋白表达，因此在生物体基因表达调控方面起着重要的作用。此外，一组miRNAs可以调节一个功能基因网络，这提供了一种机制来协调复杂的基因表达程序，从而调节细胞内稳态和生理的许多方面^［6~8］。

近年来，miRNAs已成为动脉粥样硬化的重要驱动和保护因素，有研究发现，冠心病患者血清中miR⁃223水平升高^［9，10］；miR⁃223可通过靶向胆固醇生物合成途径和NF⁃kB信号通路调控胆固醇代谢和炎症^［11］；miR⁃223也可抑制高密度脂蛋白胆固醇（HDL⁃C）的摄取^［12］；然而，miR⁃223靶点众多，尽管已有研究表明miR⁃223在动物水平上对动脉粥样硬化的作用，但都是通过单一的通路验证其在动脉粥样硬化进程中的作用，我们对其调控AS的分子机制的了解还不够系统。

本研究通过利用miRNA靶基因预测数据库获取miR‐223的靶基因集，用R语言分析GEO共享平台动脉粥样硬化斑块差异表达基因集（GSE100927），筛选出斑块差异表达基因，并与miR‐223靶基因交叉匹配得到miR⁃223参与调控斑块的靶基因，利用GO及KEGG分析研究miR⁃223参与调控斑块的靶基因功能，有助于全面、系统了解miR⁃223在动脉粥样硬化进程中的作用，为动脉粥样硬化的治疗提供新思路。

1 数据来源与方法

1.1 数据来源

GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/） 是一个公共的功能基因组学数据库，收录了全球大部分高通量基因表达数据。AS斑块基因表达谱mRNA（GSE100927）表达芯片矩阵文件和芯片探针注释文件来源于GEO数据库。颈动脉、下肢动脉为动脉粥样硬化常发生的部位。GSE100927检测动脉粥样硬化斑块mRNA表达谱，包含12个正常颈动脉组织和29个动脉粥样硬化颈动脉组织、12个正常股动脉组织和26个动脉粥样硬化股动脉组织、11个正常腘下动脉组织和14个动脉粥样硬化腘下动脉组织。利用Perl软件将芯片的矩阵文件中探针名转化为标准基因名，R语言读取芯片矩阵数据并进行缺失值的补充、数据均一化处理等。

1.2 斑块中下调基因获取

利用R语言Limma程序包对斑块的基因表达谱进行分析，筛选阈值：FC（fold change）≥0.2，P<0.05。

1.3 miRNA靶基因获取

利用在线miRNA靶基因预测工具miRDB （http：//www.mirdb.org/）、miRmap（https：//mirmap.ezlab.org/）和TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_80/）获取hsa⁃miR⁃223的靶基因，利用miRTarBase数据库获得已知的hsa⁃miR⁃223的靶基因。将4个数据库的结果进行合并，得到miR⁃223的靶基因集合。

1.4 miR⁃223靶基因与斑块差异基因的调控网络

将hsa⁃miR⁃223的靶基因与斑块的下调差异基因取交集，得到miR⁃223参与调控斑块的靶基因。利用STRING（https：//string-db.org/）数据库构建蛋白质相互作用网络（Protein⁃Prolein Interaction Networks， PPI），利用Cytocape3.8.0软件分析获取关键调控基因，以“节点连接度（Degree）、紧密度（Closeness）及介度（Betweenness）均大于等于其中位数”为筛选条件，获得miR⁃223靶基因⁃斑块差异基因调控网络。

1.5 GO富集分析及KEGG富集分析

利用R语言的“ClusterProfiler”程序包对miR⁃223参与调控斑块的靶基因进行GO（Gene Ontology）富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）通路功能注释。分析结果P<0.05有统计学意义。

1.6 miR⁃223参与调控斑块的靶基因与铜死亡基因互作网络调控

铜死亡是近年来发现的细胞死亡方式，可能参与多种病理过程，而铜死亡对动脉粥样硬化的影响目前还没有研究。将hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因与19个铜死亡相关基因做韦恩图取交集。将hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因与19个铜死亡相关基因，利用STRING蛋白互作数据库进行互作分析，找到hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因中与铜死亡基因相互作用的基因。将三个部位所有样本合并分析，获得交集基因在斑块中的表达情况。

2 结 果

2.1 斑块中下调基因获取

将数据集GSE100927中颈动脉、股动脉、腘下动脉三个动脉粥样硬化病变部位的下调基因取交集，共获得1 584个基因（如图1）。

2.2 miR⁃223预测靶基因

利用在线miRNA靶基因预测工具miRDB （http：//www.mirdb.org/）、miRmap（https：//mirmap.ezlab.org/）和TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_80/）获取hsa⁃miR⁃223的预测靶基因，利用miRTarBase（https：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/）数据库获得已知的hsa⁃miR⁃223的靶基因，将4个数据库的结果取并集，得到miR⁃223的靶基因集合，得到4 709个基因（如图2A）。将miR⁃223的预测靶基因与斑块下调差异表达基因取交集，得到422个基因，提示hsa⁃miR⁃223通过靶向这些基因参与AS发展，如图2B。

2.3 miR⁃223靶基因与斑块差异基因的调控网络

利用STRING蛋白互作数据库对422个差异基因进行互作分析。进行优化处理后处于节点中心位置的排名前10位编码蛋白的基因分别是：INADL、JAM3、SMTN、LDB3、YAP1、TJP1、NCKAP1、PDLIM3、MICAL2和MPP5（如图3）。

2.4 GO富集及KEGG通路富集

对miR⁃223预测靶基因与斑块下调差异表达基因的422个交集基因进行GO分析，GO富集的生物过程（biological process， BP）主要包括蛋白质磷酸化的负调控、血液循环系统的调节；细胞组成（cell composition， CC）的功能富集主要包括细胞⁃细胞连接、细胞⁃基质连接、聚集黏附；分子功能（molecular funcIion， MF）的功能富集主要包括蛋白丝氨酸/苏氨酸酶及其激酶活性以及TGF⁃β受体活性（P<0.05）（如图4）。

对miR⁃223预测靶基因与斑块下调差异表达基因的422个交集基因进行KEGG分析，主要富集在以下信号通路：cAMP信号通路、钙信号通路、Hippo信号通路、cGMP⁃PKG信号通路、血管平滑肌细胞收缩信号通路及TGF⁃β信号通路等（P<0.05）（如图5）。

GO及KEGG富集分析发现，miR⁃223可能通过细胞生长、炎症反应以及血管平滑肌收缩等信号通路调节动脉粥样硬化斑块内炎症细胞的粘附聚集、调节免疫及炎症，从而影响动脉粥样硬化斑块的发生发展过程。

2.5 hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因与铜死亡基因互作网络调控

将hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的422个靶基因与19个铜死亡相关基因做韦恩图取交集，得到glutaminase（GLS）和glycine cleavage system protein H（GCSH）两个基因（如图6A）。将hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的422个靶基因与19个铜死亡相关基因，利用 STRING 蛋白互作数据库进行互作分析，找到hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因中与铜死亡基因相互作用的基因，进行优化处理后处于节点中心位置的排名前 10位编码蛋白的基因分别是TJP1、YAP1、CDKN2A、PPP1CB、FGF2、KAT2B、NEDD4、FOXO3、YWHAQ以及ERBB4（如图6B）。将三个部位所有样本合并分析，我们发现GLS、GCSH两个基因在斑块中的表达量显著降低（P<0.001）（如图6C、D）。

3 讨论与结论

动脉粥样硬化是一种全身性的慢性炎症性血管疾病，脂质沉积在血管壁上，引发 AS 相关细胞的炎症和自噬凋亡反应^{［13， 14］}。内皮细胞炎症和血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化的初始病变到终末期并发症的起始和进展中起关键作用。最近，研究表明，miRNA已经成为参与调节动脉粥样硬化病理过程的重要组分^［10］。以往的研究表明，miR‐223广泛参与体内内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的调控，因此在体外调节各种类型细胞炎症和自噬等相关基因表达以及血管壁动脉粥样硬化形成中起关键作用。此外，miR‐223可能用作诊断和治疗动脉粥样硬化的新型疾病生物标志物和治疗靶标^{［15， 16］}。但现有研究都是通过单一的通路验证miR⁃223在动脉粥样硬化进程中的作用，本研究通过生信分析的方法，全面、系统地总结了miR⁃223可能作用的通路，进而影响动脉粥样硬化进程。

3.1 miR⁃223可通过Hippo信号通路影响动脉粥样硬化

本研究发现，miR‐223可调节Hippo信号通路，而Hippo信号通路的调节可直接影响AS的病理过程^［17］。Hippo信号通路是一种限制果蝇组织生长的有效机制。在哺乳动物中，Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应因子YAP和TAZ。YAP和TAZ继而与细胞骨架蛋白相互作用，滞留在胞质内，不能进入细胞核行使其转录激活功能，从而实现对器官大小和体积的调控。有研究表明，蛋白激酶MST1/2可通过Hippo信号通路抑制异常血流导致的动脉粥样硬化，其中MST1/2是哺乳动物Hippo同源物，在组织发育和再生过程中通过磷酸化和灭活下游效应物来抑制细胞增殖和促进细胞凋亡^［17］。另一研究发现，s⁃亚硝基化介导的G蛋白α⁃2与CXCR5偶联诱导Hippo/yap依赖性糖尿病可加速动脉粥样硬化^［18］。另外还有研究表明miR⁃223可抑制血管钙化和平滑肌细胞的成骨化^［19］。这些都表明Hippo信号通路参与动脉粥样硬化的进程，且miR⁃223会通过Hippo信号通路影响血管的状态。

此外，PPI 蛋白互作结果显示，处于中心节点的基因中，Yes1 associated transcriptional regulator（YAP1）编码Hippo信号通路的下游核效应因子，参与机体发育、生长、修复的调节。本研究认为miR223可能通过靶向YAP1调节Hippo信号通路，调节血管内皮、平滑肌细胞的增殖，影响血管状态，来加重动脉粥样硬化。

3.2 miR‐223可通过铜死亡影响动脉粥样硬化

很多研究表明，铜离子可以导致细胞死亡，并通过miRNA⁃mRNA通路进行信号转导^［20］，我们将这种细胞死亡方式称为铜死亡。铜死亡对动脉粥样硬化的影响目前还没有研究。我们将hsa⁃miR⁃223参与调控斑块的靶基因与铜死亡相关基因取交集，得到glutaminase（GLS）和glycine cleavage system protein H（GCSH）两个基因，且在斑块中这两个基因表达显著下调，说明miR223可能通过靶向GLS和GCSH直接调控铜死亡。GLS编码k型线粒体谷氨酰胺酶，编码蛋白是一种磷酸激活的酰胺水解酶，催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨。这种蛋白质主要在大脑和肾脏中表达，在代谢产生能量、合成脑神经递质谷氨酸和维持肾脏中的酸碱平衡方面发挥着重要作用。GLS是铜死亡的抑制基因，在斑块中下调，一定程度上反映了铜死亡的发生；GCSH编码H蛋白，它将甘氨酸的甲胺基团从P蛋白转移到T蛋白。该基因缺陷是导致非酮症高血糖症（NKH）的原因之一。这说明hsa⁃miR223可能通过直接靶向GLS与GCSH诱导细胞铜死亡的发生引起动脉粥样硬化。此外，PPI 蛋白互作结果显示，处于中心节点的基因中，同样发现了YAP1基因，其可以通过NEDD4等基因与CDKN2A这一铜死亡相关基因间接作用，CDKN2A参与了铜死亡的负向调节，这说明YAP1可能同时调控Hippo通路及铜死亡诱导动脉粥样硬化的发生。

3.3 miR⁃223影响炎症反应及胆固醇代谢

miR‐223在疾病的不同阶段，对不同的细胞，靶向不同基因的调控作用表现出明显差异，其机制并未完全阐明。然而，miR‐223在不同的细胞类型、病理进程和动物模型中可能发挥抑制炎症或促进炎症这两种相反的作用。miR⁃223可通过靶向ATG16L1抑制自噬并促进中枢神经系统炎症^［21］；然而也有研究表明中性粒细胞到肝细胞的通信可以通过LDL⁃R依赖的miR ⁃223富集的细胞外囊泡转移，改善非酒精性脂肪性肝炎^［16］；miR⁃223⁃3p能够通过靶向NLRP3炎性小体调节树突状细胞功能并改善实验性自身免疫性心肌炎^［22］；这些结果提示我们miR⁃223在炎症调节中可能起到抑炎和促炎的双重作用。另外有研究发现，miR⁃223可抑制HDL⁃C的摄取^［12］，而HDL⁃C摄取利用减少会诱发动脉粥样硬化。

综上所述，结合生物信息学方法，我们确定了miR‐223调控AS斑块形成发展的网络机制中的关键基因和主要信号通路。对miR‐223可能调控的靶基因进行GO、KEGG分析，显示了miR‐223调控动脉粥样硬化斑块多靶点、涉及多种生物过程、分子和通路的特点。miR‐223主要通过调控细胞生长、炎症反应以及铜死亡，影响动脉粥样硬化斑块的发生发展过程。这为我们以后实验验证miR‐223对动脉粥样硬化的调控机制提供大致的方向，并为今后以miR‐223为靶点开发药物，进而全面、系统地延缓动脉粥样硬化进程提供依据。

参考文献

[1] Basatemur G L, Jørgensen H F, Clarke M C H, et al. Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis [J]. Nat Rev Cardiol, 2019, 16(12): 727⁃744.

[2] Soehnlein O, Libby P. Targeting inflammation in atherosclerosis ⁃ from experimental insights to the clinic [J]. Nat Rev Drug Discov, 2021, 20(8): 589⁃610.

[3] Roy P, Orecchioni M, Ley K. How the immune system shapes atherosclerosis: roles of innate and adaptive immunity [J].Nat Rev Immunol,2022,22(4): 251⁃265.

[4] Hansson G K, Hermansson A. The immune system in atherosclerosis [J]. Nat Immunol, 2011, 12(3): 204⁃212. 257.

[5] Ilatovskaya D V, Halade G V, DeLeon⁃Pennell K Y. Adaptive immunity⁃driven inflammation and cardiovascular disease [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2019, 317(6): H1254⁃H1257.

[6] Kim V N. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6(5): 376⁃385.

[7] He L, Hannon G J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation [J]. Nat Rev Genet, 2004, 5(7): 522⁃531.

[8] Huntzinger E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay [J]. Nat Rev Genet, 2011, 12(2): 99⁃110.

[9] 葛海静, 吕欣桐, 何涛, 等. 循环miR⁃135a水平与HDL抗氧化功能的关联性[J]. 中国动脉硬化杂志, 2022, 30(3): 198⁃204.

[10] Ge H J, Lü X T, He T, et al. Correlation between circulating miR⁃135a level and antioxidant function of HDL [J]. Chin J Arterioscler, 2022, 30(3): 198⁃204.

[11] Guo J F, Zhang Y, Zheng Q X, et al. Association between elevated plasma microRNA⁃223 content and severity of coronary heart disease [J]. Scand J Clin Lab Investig, 2018, 78(5): 373⁃378.

[12] Wang J, Bai X, Song Q, et al. MiR⁃223 inhibits lipid deposition and inflammation by suppressing toll⁃like receptor 4 signaling in macrophages [J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(10): 24965⁃24982.

[13] Vickers K C, Landstreet S R, Levin M G, et al. MicroRNA⁃223 coordinates cholesterol homeostasis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(40): 14518⁃14523.

[14] Taleb S. Inflammation in atherosclerosis [J].Archives of Cardiovascular Diseases,2016,109(12): 708⁃715.

[15] Geovanini G R, Libby P. Atherosclerosis and inflammation: overview and updates [J]. Clin Sci (Lond), 2018, 132(12): 1243⁃1252.

[16] Tabet F, Vickers K C, Cuesta Torres L F, et al. HDL⁃transferred microRNA⁃223 regulates ICAM⁃1 expression in endothelial cells [J]. Nat Commun, 2014, 5: 3292.

[17] He Y, Rodrigues R M, Wang X, et al. Neutrophil⁃to⁃hepatocyte communication via LDLR⁃dependent miR⁃223⁃enriched extracellular vesicle transfer ameliorates nonalcoholic steatohepatitis [J]. J Clin Invest, 2021, 131(3): 141513.

[18] Quan M, Lü H, Liu Z, et al. MST1 suppresses disturbed flow induced atherosclerosis [J].Circulation Research,2022,131(9): 748⁃764.

[19] Chao M L, Luo S, Zhang C, et al. S⁃nitrosylation⁃mediated coupling of G⁃protein alpha⁃2 with CXCR5 induces Hippo/YAP⁃dependent diabetes⁃accelerated atherosclerosis [J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 4452.

[20] Han Y, Zhang J, Huang S, et al. MicroRNA⁃223⁃3p inhibits vascular calcification and the osteogenic switch of vascular smooth muscle cells [J]. J Biol Chem, 2021, 296: 100483.

[21] Wang L, Bammler T K, Beyer R P, et al. Copper⁃induced deregulation of microRNA expression in the zebrafish olfactory system [J]. Environ Sci Technol, 2013, 47(13): 7466⁃7474.

[22] Li Y, Zhou D M, Ren Y H, et al. Mir223 restrains autophagy and promotes CNS inflammation by targeting ATG16L1 [J]. Autophagy, 2019, 15(3): 478⁃492.

[23] Chen L Q, Hou X Y, Zhang M M, et al. MicroRNA⁃223⁃3p modulates dendritic cell function and ameliorates experimental autoimmune myocarditis by targeting the NLRP3 inflammasome [J]. Mol Immunol, 2020, 117: 73⁃83.

基金资助

湖北省自然科学基金面上项目(2021CFB487)