植物花青素糖基转移酶研究进展

Research progress of plant anthocyanin glycosyltransferase

摘要

花青素是植物体内重要的次生代谢物，具有较强的药理活性，如抗氧化、抗癌等，广泛用于营养保健领域。自然条件下，植物体内的花青素以糖苷形式存在，带有各种糖基化修饰，而花青素糖基转移酶是专门负责催化这种糖基化反应的酶，能够把糖基供体转移到花青素不同的位点，形成了不同的花青素种类，从而改变这些分子的特性，影响生物活性和药用功能。本文重点综述了植物花青素糖基转移酶的分类和修饰反应特点，以及主要花青素资源植物中糖基转移酶的研究进展，有助于深入挖掘和鉴定植物中花青素相关糖基转移酶，解析其催化和调控机理，为花青素生物合成、富含花青素的植物资源研发提供新的思路。

Abstract

Anthocyanins are important secondary metabolites in plants， with strong pharmacological activities such as antioxidation and anticancer， and are widely used in nutrition and health care fields. Under natural conditions， anthocyanins in plants exist in the form of glucosides with various glycosylation modifications. Anthocyanin glycosyltransferases are enzymes specifically responsible for catalyzing this glycosylation reaction， which can transfer glycosyl donors to different sites of anthocyanins and form different types of anthocyanins， thus changing the properties of these molecules and affecting their biological activity and medicinal functions. The present study is performed to primarily review the classification and modification reaction characteristics of anthocyanin⁃related glycosyltransferases in plants， as well as the research progress of glycosyltransferases in major anthocyanin⁃rich plants. Findings in this study are expected to contribute to the comprehensive exploration and identification of anthocyanin⁃related glycosyltransferases in plants and analyze corresponding catalytic and regulatory mechanisms， so as to provide fresh ideas for anthocyanin biosynthesis， as well as research and development of anthocyanin⁃rich plant resources.

Graphical abstract

关键词

花青素 / 花青素资源植物 / 糖基转移酶 / 生物合成 / 基因工程

Key words

anthocyanin / anthocyanin resource plant / glycosyltransferase / biosynthesis / genetic engineering

0 引 言

花青素是植物中广泛存在的一类次生代谢产物，是植物主要的显色物质，可以使花、叶、茎、果实呈现出红、橙、紫红、蓝紫色。花青素是水溶性色素，主要以糖苷形式存在于植物的液泡中，也称为花青素苷，或花色苷^［1］。对植物来说花青素不仅具有观赏价值，同时可以吸引昆虫传粉，还具有抗病毒、抗菌和杀菌活性，因此在保护植物免受病原微生物感染方面发挥作用。此外还具有抵御低温和紫外线等功能^［2］。对人类来说，花青素是一种天然食用色素，具有安全无毒的特点。它也是一种天然的抗氧化剂，能保护人体免受自由基的损伤、阻断细胞凋亡和延缓机体衰老，是抗氧化领域的研究热点^［3］。花青素对脑缺血再灌注损伤神经具有保护作用^［4］，作为膳食添加剂可以预防与年龄相关的记忆功能障碍和神经退行性疾病^［5］。流行病学数据显示，花青素的摄入与心肌梗死和心血管疾病相关死亡率之间存在负关联^［6］。此外花青素还具有缓解近视、防癌、抗衰老以及降血脂等多种生理功能^［7］。可见花青素在人类健康保健方面有重要作用。因此，研究植物中的花青素对提高植物营养品质具有重要意义。

常见的花青素资源植物有蓝莓（Vaccinium uliginosum L.）、紫薯（Dioscorea alata L.）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）、葡萄（皮）（Vitis vinifera L.）、茄（Solanum melongena L.）、稻（紫米）（Oryza sativa L.）、桑葚（Morus alba L.）、（紫）甘蓝（Brassica oleracea var.capitata L.）、西洋接骨木（Sanbucus nigra L.）、野樱莓（Aronia melanocarpa（Michx.）Elliott）、蔓越莓（Vaccinium macrocarpon Ait.）、黑豆（皮）（Glycine max（L.）Merr.）、玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）、蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）、甜菜（Beta vulgaris L.）、黑茶藨子（Ribes nigrum L.）、花生（衣）（Arachis hypogaea L.）、阿萨伊浆果（Euterpe oleracea Mart.）、（紫）玉米（Zea mayz L.）和马基莓（Aristotelia chilensis（Mol.）stuntz）等。这些资源植物均含有丰富的花青素，并且种类繁多。例如，葡萄的花青素种类有14种^［8］，黑果枸杞共鉴定出27种^［9］。

自然条件下，游离状态的花青素极为少见，常以糖苷化形式才能保持稳定，不同的糖苷化会导致颜色的变化，也会影响健康功能，因此，花青素生物合成中的糖基修饰非常重要。本文重点综述了花青素糖基转移酶的分类和修饰反应特点，以及主要花青素资源植物及模式植物中糖基转移酶的研究进展。

1 花青素糖基化修饰特点

迄今为止，已经从自然界中分离和鉴定了600多种花青素，而且基本上是在6种常见的花青素苷元上连接不同的糖。花青素苷元的基本结构为α⁃苯基苯并吡喃阳离子，具有一个基本的C6（A环）⁃C3（C环）⁃C6（B环）的碳骨架结构。6种苷元为：天竺葵素苷元（pelargonidin）、矢车菊素苷元（cyanidin）、飞燕草素苷元（delphinidin）、芍药素苷元（peonidin）、矮牵牛素苷元（petunidin）和锦葵素苷元（malvidin）（图1）^［10］。

1.1 花青素常见糖基化位点与糖基

花青素糖基化可以发生在苷元的任何一个羟基（OH），形成O-糖苷键。不同位点的羟基与不同糖基进行反应，形成不同的花青素。O-糖苷键主要发生在C环的3-OH位置、A环的5-OH、7-OH位置和B环的3-OH、4-OH和5-OH等位置。3-OH和5-OH是最常见的糖基化位点，一般在3-OH位置最先发生糖基化反应，这是后续修饰反应的先决条件^［11］。除3⁃脱氧花青素（3⁃deoxyanthocyanins）之外，基本上所有的花青素苷都在C环3-OH上连有糖基^［12］。另外，还有极少的C⁃糖基化花青素，发生在A环的C⁃8位置^［9］。

花青素的糖基包括单糖、二糖和三糖，其中葡萄糖是最常见的单糖，还有半乳糖（galactose）、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖等。矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖苷在自然界中分布最广^［13］。二糖一般有芸香糖（6⁃O⁃α⁃L⁃鼠李糖基⁃D⁃吡喃葡萄糖）、槐糖（2⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖基⁃D⁃吡喃葡萄糖）、龙胆二糖（6⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖基⁃D⁃吡喃葡萄糖）和接骨木二糖（2⁃O⁃β⁃D⁃吡喃木糖基⁃D⁃吡喃葡萄糖）等^［2］。三糖主要有3⁃O⁃2G⁃葡萄糖基芸香糖苷（3⁃O⁃2G⁃glucosylrutinoside）和3⁃桑布双糖苷⁃5⁃葡糖苷（3⁃sambubioside⁃5⁃glucoside）^［14］。

1.2 花青素糖基化对颜色的影响

花青素糖基化提高了花青素的稳定性，并且改变花青素的颜色^［15］。花青素苷在细胞液中呈浅色，通过糖基化修饰反应可以发生分子内的共色作用。例如，在花青素3⁃O⁃葡萄糖基转移酶的作用下发生糖基化修饰，生成花青素苷使其母核周围形成了保护层，在空间结构上得以稳定。花青素的稳定性随着糖苷分子数量的增加而增加^［16］。圆叶葡萄酿造的酒在加工和储藏过程中，酒的颜色会随着时间的推移会发生褐变，而欧亚品种“赤霞珠”酿造的葡萄酒颜色稳定性好，其原因在于前者是单糖苷，后者是二糖苷^［17］。此外，不同糖基对花青素的稳定作用也不同：葡萄糖基>半乳糖基>阿拉伯糖基^［18］。

花青素可以进一步糖基化，根据添加糖的数量和位置，颜色发生一定的变化。矢车菊素苷元为骨架的花青素颜色常以红色为主^［19］，例如，牵牛花（Ipomoea purpurea）3GT编码矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖糖基转移酶，其突变体中花青素含量降低80%，导致花瓣由原本的红色呈现为白色^［20］。二糖苷会将颜色稍微转向红色。小苍兰（Freesia hybrid）中的Fh5GT1和Fh5GT2基因编码UDP⁃葡萄糖：矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖基转移酶，催化合成矢车菊素3⁃O⁃芸香苷，导致转基因烟草花瓣中红色色素的积累。飞燕草素和锦葵色素苷元的花青素颜色常以蓝紫色为主^［21］。龙胆（Gentiana triflora）中的Gt3'GT基因编码飞燕草素3'⁃O⁃葡糖基转移酶，催化蓝色飞燕草素3，5⁃O⁃二葡萄糖苷形成飞燕草素3，5，3'⁃O⁃三葡萄糖苷，即深蓝色的龙胆飞燕草素（gentiodelphin）^［22］。

2 花青素尿苷二磷酸糖基转移酶（UGT）基因

糖基转移酶（glycosyltransferase，GT，EC 2.4.x.y）广泛存在于原核生物、真核生物、古细菌和病毒中，可催化特定糖基供体和受体之间糖苷键的形成^［23］。糖基转移酶是高度分化的多基因家族，根据CAZy数据库，可分为115个家族。其中催化花青素糖苷化的糖基转移酶基因多属于植物尿苷二磷酸糖基转移酶（uridine diphosphate glycosyltransferase，UGT，GT family 1）。

根据其催化位点，可以分为编码3⁃O、5⁃O、二糖苷以及二糖链糖基转移酶^［9］。催化7⁃O花青素苷合成需要的糖基转移酶不属于UGTs基因家族。通常，一种酶催化一种受体的特定位置，在某些情况下，同种酶可具有两个不同的修饰位点。例如在玫瑰（Rosa hybrida）中克隆得到的RhGT1基因，其编码的蛋白可以催化生成矢车菊素3⁃O⁃和5⁃O⁃葡萄糖苷^［23］。

2.1 花青素3⁃O糖基转移酶

花青素3⁃O糖基化是最重要的修饰形式，花青素3GT是大多数高等植物中催化花青素第一步糖基化的酶，也是各个植物中研究最多的酶^［24］。如紫甘蓝中克隆得到的UGT78D5，其重组蛋白UGT78D5能以UDP⁃葡萄糖为糖供体，催化飞燕草素生成飞燕草素3⁃O⁃葡萄糖苷^［25］。从甘薯〔Ipomoea batatas（L.） Lam〕中克隆得到的3GT基因（IbUF3GT），序列分析表明其与其他植物的3GT有较近的同源关系，IbUF3GT基因在拟南芥（Arabidopsis thaliana）转化体中的过表达导致茎中花青素含量的增加，接受UDP⁃葡萄糖作为糖供体，催化3⁃O位的糖基化^［26］。猕猴桃（Actinidia chinensis）中，糖基转移酶基因F3GT1和AcUFGT3分别为调节红肉猕猴桃（Actinidia chinensis Planch. var. rufopulpa C.F.Liang et A.R. Ferguson）和普通猕猴桃花青素苷积累的关键基因，其编码的蛋白主要以矢车菊素为受体，并以UDP⁃半乳糖作为糖基供体^{［27，28］}。

2.2 花青素5⁃O糖基转移酶

在大多数情况下，A环5⁃O位的糖基化反应以花青素3⁃O⁃单糖苷为受体，催化形成3，5⁃二糖花青素苷。从紫苏（Perilla frutescens）中克隆了第一个A5GT基因^［29］。此后，在欧美葡萄品种中，克隆得到了能催化锦葵素3⁃O⁃糖苷生成锦葵素3，5⁃O⁃二糖苷的5GT。而欧亚葡萄品种无法生成双糖苷，仅能生成锦葵素3⁃O⁃葡萄糖苷，发现这是由于其5GT基因发生突变导致的功能丧失^［30］。山葡萄（V. amurensis）糖基转移酶基因Va5GT同样能编码UDP⁃葡萄糖：锦葵素5⁃O⁃葡萄糖基转移酶催化形成锦葵素3，5⁃O⁃二葡萄糖苷^［31］。

2.3 花青素二糖苷糖基转移酶

在花青素3⁃O⁃葡糖苷形成后，可以通过糖基转移酶进一步修饰催化合成二糖苷。在红色的甘蓝中克隆得到的UGT79B45基因，其编码的蛋白以飞燕草素3⁃O⁃葡萄糖苷为底物，生成1→2连接的飞燕草素3⁃O⁃槐糖苷。猕猴桃中克隆得到的F3GGT1基因，其编码矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖苷2''⁃O⁃木糖基转移酶，可以将木糖分子结合到矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖苷的2''位置，催化合成矢车菊素3⁃O⁃木糖基⁃半乳糖苷^［27］。

2.4 花青素（3'⁃O、4'⁃O和5'⁃O）糖基转移酶

目前只在一些观赏植物的花瓣和叶片颜色的研究中鉴定出3'⁃O、4'⁃O和5'⁃O位点糖基化的基因。如龙胆、蝶豆（Clitoria ternatea）和小苍兰^［32~34］ 。而对于可作为药物、着色剂和食品的花青素糖基转化修饰的研究还较少。

除了上述这些糖基转移酶基因外，还有比较特殊的糖基转移酶基因。例如，有些糖基转移酶基因编码的蛋白可以同时识别多个受体，甚至不限于类黄酮。在康乃馨（Dianthus caryophyllus）中，DicGT1编码UDP⁃葡萄糖：矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖基转移酶。以UDP⁃葡萄糖为供体，不仅可以催化生成矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖苷，还能催化以槲皮素为底物的黄酮醇类化合物^［22］。在草莓（Fragaria×ananassa）中克隆得到的FaFGT基因，其编码的蛋白在UDP⁃葡萄糖存在的条件下，不仅可以识别天竺葵素和矢车菊素作为底物，还能识别山奈酚和槲皮素^［35］。茶〔Camellia sinensis （L.） O.Kuntze〕中的CsUGT72AM1具有3⁃O⁃葡萄糖基转移酶的催化活性，催化底物包括矢车菊素为代表的花青素以及多种黄酮醇、黄烷酮、木质素等^［36］。

也存在来自同一个植物的不同糖基转移酶识别同一受体的情况，糖基供体相同或不同。在桃（Amygdalus persica）中鉴定了PpUGT78A1和PpUGT78A2两个基因，它们编码的蛋白都能够识别矢车菊素，但是能够利用的糖基供体不同，二者分别以UDP⁃半乳糖和UDP⁃葡萄糖为供体，催化生成矢车菊素3⁃O⁃半乳糖苷和矢车菊3⁃O⁃葡萄糖苷^［37］。而在六倍利（Lobelia erinus）中，ABRT2和ABRT4都编码飞燕草素3⁃O⁃鼠李糖基转移酶，催化生成飞燕草素3⁃O⁃葡萄糖苷，这两个基因编码的蛋白具有完全相同的催化活性^［38］。

3 酰基葡萄糖依赖的花青素葡萄糖基转移酶（AA5GT和AA7GT）基因

酰基葡萄糖依赖的花青素5（7）⁃O⁃葡萄糖基转移酶（AA5GT和AA7GT），它们具有将葡萄糖转移到花青素3⁃O⁃葡萄糖苷的5-OH或7-OH位的活性，可以将酰基葡萄糖作为供体和花青素3⁃O⁃葡萄糖苷作为受体。此外，这些葡萄糖转移酶类似于糖苷水解酶家族（glucoside hydrolase family 1，GH1）型糖基转移酶^{［39，40］}。

对于5-OH位点而言，除了UGT外，还可以是AA5GT基因。在香石竹（Dianthus caryophyllus L.）花瓣中克隆得到花青素5⁃O⁃葡糖基转移酶AA5GT基因，其编码的蛋白能以酰基葡萄糖为供体，对天竺葵素3⁃O⁃葡萄糖苷5-OH位进一步糖基化修饰^［41］。

首次从单子叶植物百子莲〔Agapanthus africanus （L.） Hoffmanns.〕花瓣中克隆得到了花青素7⁃O⁃糖基转移酶基因AaAA7GT，其编码的蛋白以酰基葡萄糖为供体，识别花青素3⁃O⁃葡萄糖苷、3⁃O⁃半乳糖苷、3⁃O⁃芦丁糖苷为受体^［42］。此前，在翠雀（Delphinium grandiflorum L.）中克隆得到了类似的葡萄糖转移酶基因GgAA7GT，其以乙酰基葡萄糖（1⁃O⁃b⁃D⁃vanillyl⁃glucose）为供体，具有将葡萄糖转移到花青素7-OH位的葡萄糖转移酶活性，二者都表现出对花青素3⁃O⁃葡萄糖苷作为受体的严格偏好^［41］。

4 花青素糖基转移酶基因的表达调控

4.1 转录因子

基因的表达严格受转录因子的调控，在花青素生物合成过程中转录因子起着重要的调控作用，其中MYB、bHLH、WD40是研究比较深入的三大类转录因子家族，通过与结构基因启动子区域的作用元件结合来调控花青素的生物合成^［43］。

MYB是调控花青素合成的最重要的调控因子，大部分MYB对于花青素的生物合成起促进作用，有些转录因子对UGT有调控作用，主要作用于3GT。烟草中过表达茶MYB转录因子CsMYB6A可激活3GT基因的表达^［44］。从四倍体杂交品种“巨峰”葡萄的果实中分离出3个MYB的转录因子基因，证实其中的VlmybA1⁃1可以通过诱导3GT的表达来调控花青素苷的合成。随后的研究表明，葡萄的祖先颜色为黑色，由于VvMYBA1和VvMYBA2同时发生突变，导致3GT不能正常表达，才形成了白皮品种^［45］。在紫甘蓝中，BoMYB2可以通过激活下游结构基因DFR、ANS与3GT的表达，诱导叶片的花青素合成^［46］。在越橘（Vaccdium myrtillus）的白色浆果突变体中，发现是因为浆果中转录因子VmMYBPA1.1的沉默，导致了关键的花青素3GT基因的下调^［47］。有些MYB对于花青素的合成有抑制作用，例如在苹果中，MdMYB16基因可以直接抑制花青素合成中3GT关键酶基因的表达^［48］。

bHLH转录因子是植物中仅次于MYB的第二大转录因子超家族，玉米R1（RED1）基因是植物中第一个被发现的bHLH转录因子。对于玉米ZmUFGT（Bz1）基因，R1可通过形成二聚体，在体内直接与Bz1启动子区的E⁃box结合，可激活该基因的表达^［49］。在金鱼草（Antirrhinum majus）中，DELILA编码bHLH转录因子，在DELILA突变的无色花冠管部，DELILA对3GT起抑制性调控作用，使其表达量大幅降低^［50］。

WD40（repeat proteins，WDR）转录因子在植物花青素调控途径中也起着同样重要的作用。从矮牵牛花（Petunia hybrida）中发现调控花青素生物合成的第一个WD40（ANTHOCYANIN11，AN11）基因以来，此后，陆续从拟南芥、马铃薯（Solanum tuberosum L.）中克隆了与AN11基因同源的WD40转录因子。然而，在其他植物中，WD40调控花青素生物合成的研究相对较少。

另一方面，在一些植物中需要MYB和bHLH共表达，或者MYB、bHLH和WD40形成MBW三元复合体来调节合成花青素^［51］。如从苹果中鉴定得到的冷诱导转录因子MdbHLH3，可以与花青素苷合成的MdUFGT和调控基因MdMYB1的启动子结合，显著提高其表达水平^［52］。在山麦冬（Liriope spicata）果皮中，转录因子MYB和bHLH的表达上调之后，UFGT和其他结构基因的表达被激活，由此提高了花青素的含量^［53］。在葡萄中，VvMYCA1基因编码bHLH蛋白，VvWDR1编码WD40蛋白，其共表达激活葡萄浆果中花青素合成3GT的表达^［54］。油桃（Prunus persica var. nectarina）中MBW三元复合体油桃果实花青素生物合成基因中的启动子结合，激活3GT基因的转录。

4.2 调控花青素糖基转移酶基因的其他因子

转录因子参与植物花青素生物合成调控外，miRNA（microRNA）还直接或间接地参与植物体内花青素合成的调控。miRNA是一类长度为19~25 nt的内源性非编码RNA（No⁃codingRNA），广泛存在于真核生物体内。miRNA对靶基因的调控方式多为负调控，miR828、miR858、miR156和miR159等这些小RNA在花青素合成途径中起重要调控作用，在葡萄、紫薯、甘薯和越桔等植物中参与花青素的合成^［55~58］。在葡萄中，miRNAs的初级转录产物miPEP164c通过抑制MYBPA1翻译，增加VvUFGT1的表达和UFGT的活性以及VvGST4和VvMATE1的过度表达，间接刺激花青素的合成^［59］。从花斑种皮花生中筛选出miRNA调控花青素合成途径中的5个结构基因，其中miR5负向调控矢车菊素3⁃O⁃葡萄糖转移酶基因^［60］。

5 花青素糖基转移酶基因在基因工程中的应用

利用基因工程方法，提高植物尤其是植物中可食部位花青素的含量，有利于人体健康。基于双向启动子和2A连接肽的玉米多基因表达体系，在玉米胚中实现了花青素的生物合成和积累，创制了高花青素的新品种，得到了紫色的玉米，其花青素含量与蓝莓含量相当，达到2 910 mg/kg^{［61，62］}。采用新研发的多基因载体系统TGSⅡ（Trans Gene Stacking Ⅱ），同时导入转录因子组合和结构基因组合，构建了多基因载体，首次实现了水稻胚乳合成花青素的营养强化目标，培育出具有高抗氧化活性的紫色的胚乳水稻“紫晶米”^［63］。将来自鱼腥草（Antirrhinum majus L.）的两个转录因子Delila和Rosea1基因同时转入到番茄中，得到的紫番茄花青素含量由几乎为0上升至2.83 mg/g，之后，为了验证获得的花青素的健康作用，喂食含有紫番茄的患癌小鼠，平均寿命延长至182.2 d，最大寿命为260 d。而对照喂食普通番茄的患癌小鼠的平均寿命（145.9 d）没有增加^［64］。

将与花青素代谢相关的转录因子转入其他物种，可以直接获得花青素。将PAP1基因转入烟草中，在转基因烟草中检测到一种具有药用价值的花青素cyanidin⁃3⁃O⁃rutinoside，该花青素的含量占总花青素含量的98%^［65］，这种转基因烟草可以作为工业上提取药用功能的花青素的原料。

但是关于花青素糖基转移酶基因在基因工程中的应用较少。以水稻黑米品种——黑帅的cDNA为模板，扩增了花青素代谢途径中的包括OsUGFT基因在内的7个重要结构基因，将结构基因导入到白米品种中，获得了富含花青素的超表达植株，增加了水稻的营养价值^［66］。

6 展 望

自然界的天然花青素种类繁多，功能多样，且安全性高，因此广泛应用于医药和食品行业。目前，科研人员对花青素生物合成途径进行了比较深入的解析，花青素的代谢调控网络研究也在不断完善。糖基化修饰是增加花青素种类和稳定性的重要原因，在基因工程方面，通过调控相关糖基转移酶基因的表达达到提升花青素含量的目的具有十分广阔的应用前景。同时糖基转移酶催化形成的糖苷种类繁多，仍然有许多参与各种物质形成的糖基转移酶的生理功能和作用机制尚不清楚，需要进一步加强。针对可食用花青素的转录调控机制和利用代谢工程改良花青素的相关研究仍较少。关注花青素修饰和调控的相关基因，有效调节植物体内花青素积累，改良富含对人类健康有益的花青素的产品，并通过基因工程生产。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31570306)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-031)