植物类中药材内生菌活性成分资源开发与利用

Development and utilization of active ingredients resources for endophyte in plant traditional Chinese medicine

摘要

中药材内生菌通过产生多种生物活性物质，调控植物的次生代谢通路，诱导中药材生物活性成分的合成，是发现活性先导化合物的重要天然产物资源库。本文主要围绕内生菌及其代谢物的活性功能、受生态环境的影响、先导化合物的开发以及引入多重组学技术应用进行综述，并对内生菌天然产物的可持续发展进行了展望：通过代谢调控通路定向寻找目标药物并定位目标基因，建立内生菌菌库和基因库；通过基因编辑技术定点精准靶向修饰目的基因，随后激发细胞内源性的修复机制来实现基因定向改造；利用基因工程技术获得工程菌株，为新型天然产物的产业化奠定基础。本文旨在为中药材植物内生菌资源的开发与利用提供新思路。

Abstract

Endophytes of Chinese medicinal materials， which are an important resource pool of natural products for discovery of active lead compounds， regulate the secondary metabolite pathway of plants by producing a variety of bioactive substances， and induce the synthesis of bioactive components in Chinese medicinal materials. The active function， influence of ecological environment， development of lead compounds， and the application of introducing multiple recombinant technology of endophytes and their metabolites are reviewed in this paper. The sustainable development of natural products from endophytes is prospected： target drugs and target genes can be targeted through metabolic regulatory pathways to establish endophyte and gene banks； gene editing technology will be used to accurately target and modify target genes， and then stimulate the endogenous repair mechanism of cells to achieve gene directed modification； engineering strains can be obtained by using genetic engineering technology， which lays a foundation for the industrialization of new natural products. This paper aims to provide a new idea for development and utilization of endophytes resources of Chinese medicinal plants.

Graphical abstract

关键词

中药材内生菌 / 生物活性成分 / 天然产物 / 多重组学

Key words

endophyte of traditional Chinese medicine / bioactive component / natural product / multi⁃omics

0 引 言

植物内生菌（endophyte）是指部分或全部生活史存活在健康植物组织内部，宿主植物不表现出明显感染症状（至少暂时没有感染症状）的微生物^［1］。主要包括真菌、细菌、放线菌，可存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等各部位^［2］。中药材本身具有特殊的药用价值，其内生菌即中药材内生菌也可以产生具有药用价值的菌株和化合物，以及新的天然产物（natural products，NPS），特别是来自特定产地的道地药材^［3］。已有研究^［4］发现，药理活性成分化合物的合成机制，强调了药用植物内生菌群落在天然药物生产中的作用和潜力。从巴西莲子草（Alternanthera brasiliana）中分离出的枯草芽胞杆菌（Bacillus spp）可产生与其寄主植物相同的生物活性化合物^［5］。药用植物内生菌对宿主生长和质量形成有重要的促进作用，不同内生菌对苍术挥发油组成和含量有不同的调节作用，在苍术质量形成过程中起重要作用^［6］。

中药材内生菌是一种新型微生物资源，在农业、工业、医药卫生及生态学等领域有着巨大的应用潜力^［7，8］。通过新兴技术手段，基因工程与代谢调控结合，寻求与目标药物相符的化合物，构建内生菌菌库和基因库，并利用基因编辑定点精准靶向修饰，最终实现工程菌株规模化和产业化是未来NPS研究的重要途径。本文从内生菌及其代谢物的活性功能、受生态环境的影响、先导化合物的开发以及引入多重组学技术应用进行综述，旨在为中药材内生菌资源的开发利用提供新思路，为中药材内生菌的应用前景提供新的方向。

1 内生菌对宿主的生物活性功能

研究发现，植物⁃内生菌的互作可能不仅仅是毒力和防御之间的平衡，而是一种更为复杂和精确控制的相互作用^［9］，长期共存、协同进化对植物生长发育和逆境环境起重要作用。迄今为止发现的内生菌主要分为三个功能组：①保护宿主免受生物胁迫；②缓解宿主的非生物应激；③通过增加磷、氮和其他主要和次要营养物质来支持宿主的营养^［10］。

内生菌生物活性物质对宿主的功能主要有：①对植物生长的促进作用，如可通过产生吲哚乙酸（IAA）、吲哚乙腈、细胞分裂素等促进中药材生长的激素，间接调节植物内源激素的含量水平^［11］。此外，内生固氮菌的形成可为植物提供生物的固氮营养^{［12，13］}。②中药材内生菌可提高宿主对生物胁迫和非生物胁迫的抗逆性^［14］，部分植物内生菌作为生防因子，可开发植物抑菌剂^［15~17］，还可促进中药材次生代谢产物的合成和积累^［18~22］。怀地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）是玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，从怀地黄根中分离得到32株内生细菌，这些内生菌对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）都有不同程度的抑制作用^［23］。据报道^［24］薄荷组培苗感染内生菌后产生的挥发物质比对照组无菌组培苗明显增多。研究表明^［25~27］某些内生菌并不直接转化生成药用成分，而是促进植物次生代谢产物的积累，从而影响植物次生代谢产物的产量，进而影响药用植物有效成分的产量^［28~30］。研究内生菌对宿主植物有效成分生物合成和积累的意义重大。

2 内生菌代谢物的生物活性

植物的代谢通过多种方式与其内生菌的代谢相互作用，即内生菌或宿主诱导对方的代谢，内生菌和宿主在代谢途径中起部分作用^［31］。目前已从中药材内生菌中筛选出了大量具有生物活性的次生代谢产物，这些代谢产物突破了药用植物资源产量低、周期长、不可再生等诸多因素的限制，对保护药用植物资源和生物多样性起到了积极的作用。内生菌代谢产物种类繁多，应用于抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等多个方面^［32~34］。内生真菌产生的抗肿瘤活性成分除萜类外，还包括生物碱、酯类、黄酮类、醌类和甾体类^［35~37］，它们不是微生物生长所必需的，但参与了宿主保护、生态位竞争等^［38］。内生菌产生的抗肿瘤成分毒性低，可以无限合成抗肿瘤产物，为抗肿瘤药物的研究增加新的途径。

从云南西双版纳热带雨林的多种药用植物中分离到272株内生放线菌，其中146株菌的发酵产物具有抗菌活性，94株菌对病原菌具有拮抗活性，127株菌具有抑制病原真菌的作用^［39］。从药用植物鸢尾的内生真菌中分离出两种异构体pestacin和异pestacinl^{［40，41］}，都表现出抗菌活性和抗氧化活性。

中药材内生菌除产生具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化作用的活性物质外，还能产生抗虫类、抗糖尿病类等其他作用的活性物质。从非洲刚果热带植物叶片中分离到内生真菌假黑团藻（Volvocales），其产生的小分子可脱甲基酯化苯醌B⁃1，起到类似胰岛素的作用^［42］。泡林藤属（Paullinia）植物中分离到的内生真菌在特定条件下能产生萘类物质，该物质能杀灭小麦茎叶蜂成虫，为小麦虫害防治提供了新途径^［43］。

3 生态环境对内生菌生物活性成分的影响

道地中药材，又称道地药材，指具有特定产区，历史悠久，质量优异，疗效显著的药材，是优质中药材的代名词^［44］。道地药材之“地”即特定的生态环境，包括气候因子、土壤因子、地形地貌、栽培条件等各种生态因子。

①土壤是药用植物生存的根本，特定环境条件形成特定的土壤微生态系统，对中药品质形成特定的影响。高纬度土壤微生物多样性低，低纬度土壤微生物多样性高。寄居于热带地区植物宿主中的内生菌的种类和数量要远高于温带地区植物中的种类和数量^［45］。②与来自其他地区的植物相比，同一地区的植物内部有更多相似的微生物群落，经过长期的积累逐渐形成鲜明的地域特征。对3种牡丹的研究结果显示^［46］，同一生长环境下的不同品种之间内生真菌群落结构相似性高于不同产地环境的同一品种，因此说明与牡丹品种相比，地理环境对牡丹内生真菌多样性的影响更为重要。③内生菌的自然分布具有明显的宿主限制性。环境中的某些微生物可能通过随机定植的方式侵染宿主植物，但更多的菌是否能够成功定植却受宿主的遗传特性决定。相关报道^［47］比较研究了同为甘肃所产的乌拉尔甘草野生品与栽培品的内生菌群，发现丝核菌属（Rhizoctoni）仅见于野生品、木霉属（Trichoderma）仅见于栽培品；且二者的内生真菌和内生细菌优势菌种均有不同。除上述生态环境影响外，人工干扰下内生菌参与构建微生态群落有利于提高中药材品质，缓解某些中药材植物资源的局面^［48］。人参是我国传统中药材，药用成分的累积与人参内生真菌的作用有直接关联，研究表明人工干预的种植过程会对药材中内生真菌产生影响，进而影响人参药材的有效成分^［49］。

基于以上原因，从生态环境出发对理解中药材的道地性，培育道地药材^［50］具有重大的现实意义。

4 内生菌生物活性成分的开发

目前，国内外对内生菌的分离及鉴定工作已在多种植物内开展，为植物内生菌生态关系研究以及植物内生菌资源的开发利用提供了科学依据。

4.1 传统方法

无论是研究中药材内生菌对植物的生理作用，还是研究其代谢产物，都要对菌株进行分离，目前常用的植物内生菌的分离方法是组织块法和组织匀浆法。具体步骤如图1所示。

根据目的菌株类型选择合适的培养基，高氏Ⅰ号培养基常用于内生放线菌分离，马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）和马丁氏培养基（Martin）常用于内生真菌分离，牛肉膏蛋白胨固体培养基（nutrient agar， NA）和LB（Luria⁃Bertani）固体培养基常用于内生细菌分离。增加培养基的种类有助于菌株多样性筛选的提高，采用选择性培养基可以提高分离效率，例如真菌培养基中添加抗生素可以抑制细菌生长，从而提高分离效率。从6种中药材中分离真菌时在PDA培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素，用于抑制细菌的生长^［51］。在分离川楝中放线菌时在7种培养基灭菌后加入了萘啶酮酸和重铬酸钾，可抑制细菌的生长^［52］。如果分离某些特殊营养的菌株，还可设置其喜好的pH、培养时间和温度等。研究表明改变培养基组成，培养条件如通风、温度、培养瓶的形状等可以筛选出更多的新型NPS。以土大黄叶片分离得到的内生真菌L10为出发菌株，从培养基初始pH值、培养温度、装液量、接种量4方面对L10的培养条件进行优化，为深入研究土大黄内生真菌L10的代谢产物奠定基础^［53］。由于内生菌之间以及与宿主植物的相互作用是多样的，即使体外培养条件的微小变化也会影响它们产生的次生代谢产物的种类和检出限。如用于配制培养基的水由自来水更换为蒸馏水时，Paraphaeosphaeria quadriseptata发酵液中检出了六种新的次级代谢产物^［54］。研究多菌株协同效应时，合适的共培养体系是必要的，另外应通过改变发酵参数来研究体系中内生菌相互作用。关注诱导物（如诱导剂），协同（或拮抗）生物转化，以及最佳培养基和发酵条件，阐明最优参数集将使共培养中内生菌的种间生物合成途径的开发成为可能，以实现所需次级代谢物的持续生产^［55］。

对植物内生菌进行正确的分类鉴定，有利于揭示内生菌菌种多样性和系统发育。最早的内生菌分类鉴定方法是以其形态学或生理生化特征为依据，叫表型分类法（或常规的分类法）。随着科学的进步和相互渗透，近年来发展起了化学鉴定、数值分类法和分子生物学技术^［56］。内生细菌的鉴定方法依据《伯杰细菌鉴定手册》，放线菌鉴定参考《放线菌快速鉴定与系统分类》，一般进行形态学观察，生理生化试验，（G+C）的含量测定，最后获取16S rDNA等序列与数据库序列进行比对。内生真菌的检测最早采用苯胺蓝染色光镜观察法，鉴定方法依据《真菌鉴定手册》，根据培养形态、显微镜观察，18S或5.8S rDNA序列测定比对^［57］。

4.2 基于高通量测序和分子生物学方法

由于中药材内生菌中绝大多数的内生菌为不可培养菌，依靠传统的分离方法只能分离出部分可培养菌，不能真实地反映药材内生菌的正式群落结构^［58］。高通量测序技术是近十几年来发展起来的新兴分子生物学技术，具有分辨水平高、不需要培养等优势，可借助宏基因组测序技术得到药材内生菌的真实群落结构、检索是否含有特定活性物质的相关基因^［59］，将高通量测序技术作为传统微生物分离的辅助手段。借助高通量测序技术对中药材内生菌结构和多样性进行整体分析^［60］，确定宿主的优势内生菌，根据各优势内生菌的特性设计或查询适合其生长的培养基进行培养分离，最后对分离菌株进行功能研究。高通量测序技术指导传统培养分离方法，可以避免重要功能菌的漏筛及扩大中药材内生菌的研究范围，有利于内生菌的深入挖掘和利用。

此外，基于高通量基因测序的分析，如基因表达序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、基因表达帽分析（cap analysis of gene expression，CAGE）以及大规模平行测序（massive parallel signature sequencing，MPSS），克服了传统测序的局限性，可用于量化内生菌的精确数字基因表达水平^［61］。

5 多组学技术在内生菌生物活性成分研究中的应用

中药材内生菌信号定植机制及内生菌与宿主的互作机理尚未形成完整体系，随着科学技术的发展，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等技术部分或全部的联合使用，可以从基因变迁、转录、表达、次生代谢产物的积累、表观遗传学等各层次，对生命现象全面而系统的解释，进而加速了内生菌⁃宿主互作关系的研究进程^［62］。如高通量mRNA深度测序是绘制和量化转录组的独特方法^［63］，通过高通量基因测序与转入组学相结合，内生菌与植物以及与其他共存内生菌的信号传导可以被追踪和量化，以全面描述它们的共生关系^［64］。通过将这种方法与激光显微解剖相结合，甚至可以对从一个内生菌丝或其相邻的寄主植物细胞中分离出来的RNA进行测序。因此，未来的研究利用多组学联合使用，对内生菌-内生菌和植物-内生菌相互作用进行基本的了解，不仅可以发现和可持续生产理想的NPS，还可以发现其他被忽视的次生代谢产物，从而揭示内生菌的综合潜力。

应用多组学研究是解决植物⁃微生物相互作用的识别和定殖等问题的有效手段和途径^［65］，有助于确定这种相互作用的关键决定因素，并将为相互作用机制及其应用的研究提供理论和物质基础。一些内生菌利用靶向RNA的调节途径关闭寄主植物的防御系统^［66］。例如内生菌隐藏几丁质以防止进一步的防御反应，抑制植物水杨酸（salicylic acid，SA）的产生并促进茉莉酸（jasmonates，JAs）的生物合成^［67］。多组学方法具有识别天然产物靶点和机制的巨大潜力，可以识别小分子相互作用，更清楚地定义似是而非的和间接的相互作用，可以更有效地优化先导化合物的结构和物理性质，提高药效，减少新药物开发过程中可能出现的副作用^［68］。为了鉴定和验证大环三肽天然产物，将基因组学方法与蛋白质组学方法相结合，利用自发衍生的耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）突变体的全基因组测序，鉴定了耐药结核分枝杆菌的分子靶点^［69］。

在天然产物靶标识别过程中，全面表征细胞或生物水平的作用机制至关重要，因为天然产物可能影响单个靶标，或多个靶标，同时影响生物体内的多个系统。高通量组学方法，蛋白质组学、基因组学、转录组学、代谢组学和基于生物信息学的分析，可以提供深刻可靠的数据，并具有识别天然产物靶点和机制的巨大潜力，组学技术必将在中药材内生菌可持续生产和发展中发挥更大的优势。

6 问题及展望

目前对中药材内生菌及其代谢物的活性成分、功能等方面研究已取得了初步成果。但是，内生菌与宿主之间的化学信号和串扰是复杂的，如何持续开发新型NPS，作者认为可以从以下几个方面入手：①通过新兴技术手段（进化、比较和群落基因组学、蛋白质组学、代谢组学、分泌组学、转录组学、高通量、下一代测序技术以及生物信息学等）有助于全面理解内生菌分子相互作用和信号转导机制，通过基因水平和代谢调控定向寻找符合目标的药物，并建立内生菌菌库和基因库。②通过基因编辑对目标基因进行删除、替换、插入等操作，定点精准靶向修饰，激发细胞内源性的修复机制实现基因定向改造。③通过在植物体外模拟内生菌与宿主的互作关系，利用基因工程获得工程菌株，为新型天然产物的产业化奠定基础。根据市场需求，内生菌行业在以下几个方面的发展值得深入探究：①通过菌株培养、化合物提取、高效液相色谱纯化、核磁共振分析等寻找符合目标的药物，进而建立内生菌菌库及基因库，是未来研究新型NPS的重要途径。②目前基因工程广泛应用于微生物领域，通过基因编辑技术定点修饰靶向基因，激发细胞内源性的修复机制实现基因定向改造，更准确地实现疾病的个性化治疗。③中药材内生菌生产和品质可控性较强，且成本低，利用基因编辑构建基因工程菌，有效提高菌种的生物活性，实现菌株体外培养，最终达到规模化和产业化。④ 农业方面，植物免疫诱抗剂农药已成为当今国际新型生物农药的重要发展方向，是具有巨大发展前景的新型战略产业。中药材内生菌资源丰富，利用现代新型技术进行生物农药的研发对我国农业的绿色可持续发展具有重要意义。

中药材内生菌是一个用之不竭的重要化合物库，是可持续发展的资源，进一步深入了解内生菌与宿主植物的动态相互作用和内生菌基因的起源将有利于中药材内生菌战略产业的巨大发展。

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基金资助

山东省第四批技术创新项目(201940309025)

山东省中小微企业创新竞技行动计划新锐类科技金融补助项目(2018CXJJA1060012)